入噬菌体及质粒载体
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体
第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体吴乃虎中国科学院遗传与发育生物学研究所第八讲单链噬菌体载体及噬菌粒载体一、单链噬菌体的一般生物学1．单链噬菌体的优越性2．M13噬菌体的生物学特性二、M13克隆体系1．M13克隆体系2．M13克隆体系-半乳糖苷酶的显色反应原理3．M13载体系列的发展4．M13载体系列的优点三、噬菌体展示载体1．噬菌体展示载体的构建原理2．噬菌体展示载体3．噬菌体表面展示文库4．应用噬菌体展示载体分离有关蛋白质的实例四、噬菌粒载体1．M13噬菌体载体克隆的若干难点2．噬菌粒3．若干常用的噬菌粒载体4．pBluescript噬菌粒载体5．pUC118和pUC119噬菌粒载体第八讲单链噬菌体载体一、单链噬菌体一般生物学大肠杆菌丝状单链DNA噬菌体有M13噬菌体、f1噬菌体及fd 噬菌体，它们均含有分子量约为6400个核苷酸的单链闭环DNA分子。
1．单链DNA phage的优越性A．具有双链的复制型DNA(RF DNA)，可如质粒质粒一样进行遗传操作；RF DNA：Replication Form DNA。
B．RF DNA和ssDNA均可感染感受态的寄主细胞——形成phaque或colony。
C．不受包装的限制。
因为单链DNA phage的大小是受其DNA 多寡制约的。
D．可容易地测出外源DNA的插入取向。
E．可产生大量的含有外源DNA的单链DNA分子，这种单链DNA分子有如下用途(作为模板)：*1用作双脱氧链终止法进行DNA测序*2制备单链的放射性标记的杂交用DNA探针*3利用寡核苷酸进行定点突变2．M13 phage的生物学特性A．M13 phage同f1 phage亲缘关系十分密切，例如：①基因组组织形式相同；②病毒颗粒大小、形状相近；③DNA同源性高达98%以上。
B．在M13 phage颗粒中只有(+)链DNA，感染具F性须的大肠杆菌菌株，因此M13噬菌体是雄性E.coli特有的；M13噬菌体的(+)链DNA，又称为感染性单链DNA。
噬菌体、质粒dna复制方式
噬菌体、质粒dna复制方式
噬菌体是一种病毒，它感染细菌并利用细菌的机制进行自我复制。
质粒则是细菌染色体外的、能自主复制和稳定遗传的双链环状DNA分子。
下面是噬菌体和质粒DNA的复制方式。
噬菌体的复制方式：
1. 吸附：噬菌体通过尾部特异性地吸附到宿主细胞的表面。
2. 侵入：噬菌体的尾部通过酶的作用切开宿主细胞的外膜，注入内部的DNA。
3. 复制：噬菌体的DNA进入宿主细胞的核，利用宿主细胞的机制进行DNA复制。
首先，噬菌体的DNA作为模板，利用宿主细胞的酶和能量进行复制，产生新的噬菌体DNA。
然后，这些新的DNA与蛋白质外壳组装，形成新的噬菌体颗粒。
4. 成熟与释放：最后，成熟的噬菌体颗粒通过宿主细胞的裂解被释放出来，进行下一次的感染。
质粒DNA的复制方式：
1. 自我复制：质粒DNA可以在宿主细胞内进行自我复制。
质粒DNA的复制依赖于宿主细胞的机制，包括使用宿主细胞的DNA聚合酶进行复制，以及利用宿主细胞的能量进行ATP合成等。
2. 分配：在宿主细胞分裂时，质粒DNA会被平均分配给两个子细胞。
质粒DNA 的复制和分配是受调控的，以确保其在宿主细胞内的稳定遗传。
无论是噬菌体还是质粒，它们在复制过程中都受到各种因素的调控，以确保其稳定性和适应性。
这些过程涉及许多生物化学反应和结构变化，为深入理解这些过程需要研究更多的科学细节。
基因工程中常用载体及其主要特点
基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题，听起来就像科幻小说里的情节，其实离我们并不遥远。
今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体，简单明了，让你听得懂，明白得了！准备好了吗？那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧！1. 什么是载体？首先，得先搞清楚，什么是载体。
简单来说，载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。
它们把我们想要的基因装上，然后送到目标细胞里。
这就像是你点了一份外卖，外卖小哥把美味的食物送到你家。
没有它们，我们的基因工程可就没法开展了。
想象一下，如果没有这些小哥，基因可怎么进得了细胞的大门呢？1.1 质粒载体说到载体，质粒可算是老前辈了。
质粒就像是细菌的“USB闪存”，它能自我复制，携带外来基因，简直就是基因工程的明星。
质粒的特点是操作简单、成本低，而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。
想想看，若是你把一张重要的文件放在闪存里，不仅可以在一台电脑上使用，还能借给朋友，这种“共享经济”在基因界也在不断上演。
质粒载体就是这样的存在，方便又实用，真是个好帮手！1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。
这个名字听起来就有点威风，实际上它就是一种能感染细菌的病毒。
噬菌体载体像个特种部队，能精准地将目标基因送到细菌里。
它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。
想象一下，像忍者一样悄无声息地完成任务，真是酷毙了！当然，它的使用相对复杂，需要一定的技术支持，不过一旦掌握，可是非常厉害的工具。
2. 常见的真核载体讲完细菌的载体，咱们再来看真核细胞的载体，这可得好好聊聊了。
2.1 真核表达载体真核表达载体，是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。
这就像是在高档餐厅里，得有专业的厨师才能把菜做好。
真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。
它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。
举个例子，就像你去商场买了新衣服，得先试穿才知道合不合适，对吧？这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适，才能发挥作用。
大肠杆菌的λ-噬菌体
•功能区：裂解相关S和R，复制相关O和P
3、感染周期（溶菌循环）
•λDNA复制早期：一个ori ，双向复制 •晚期：滚环复制--多个λDNA分子形成线状多联体
尾巴上的微丝可以把噬菌 体的DNA注入细菌内。
噬菌体或病毒的DNA能被开发
成为基因工程的有用载体，因为：
1.高效率的感染性能使外源基
因高效导入受体细胞；
2.自主复制繁殖性能使外源基
因在受体细胞中高效扩增。
大肠杆菌的λ-噬菌体
（一） λ-噬菌体的生物学特性 1、由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 2、 λ-DNA的物理图谱
必须携带标记基因
经改造后只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点,长度 为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入 片段最大为14kb.
取代型载体（substitution vector）
具有成对的克隆位点,空载的载体DNA只26kb，不能被包 装，无法进入受体细胞中去,不需要标记基因.
应用：
（1）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少61种，一半为必需 基因
（2）线状双链DNA，两端各有一个12bp的互补单链 （粘性末端，cohesive-end site），称λcos site ，粘性末端粘连接变成环状DNA。
λco基因大致分为3个区：
cI基因：编码阻遏蛋白，是感染了λ噬菌体的寄主细胞进 入溶源化的必要条件。cI基因失活或缺失的λ噬菌体无法 使寄主细胞发生溶源化效应。
DNA重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。
λ噬菌体DNA的整合与删除：
噬菌体转导的操作方法
噬菌体转导的操作方法噬菌体是一种可以侵染并感染细菌的寄生病毒。
也可以通过一定的操作方法进行噬菌体的转导，即将噬菌体导入到目标细菌中。
噬菌体转导的方法有多种，包括传统的混合转染和现代的质粒张量传递等。
下面将详细介绍这些方法以及其他与噬菌体转导相关的操作步骤。
一、传统的混合转染方法1. 实验室条件准备：首先需要在无菌环境下操作，在实验室环境中设置无菌台，准备好所需的培养基、细菌菌种、噬菌体溶液和培养皿等。
2. 培养目标细菌：首先，将目标细菌分别接种到含有适合其生长的培养基中，培养至合适的生长状态。
3. 噬菌体溶液制备：将待转导的噬菌体培养物取出，可以进行多次离心洗涤，以去除一些不必要的物质。
然后将噬菌体溶液稀释合适的倍数，通常以MOI （Multiplicity of Infection）为计量单位，即用噬菌体粒子数和目标细胞数的比值来衡量噬菌体转染的效果。
4. 转染实验操作步骤：将噬菌体溶液与目标细菌培养物混合均匀，使噬菌体感染目标细菌。
通常，将细菌培养物与噬菌体溶液在37下静置一段时间（通常为10-30分钟）或在摇床上轻微摇动，以促进噬菌体与细菌结合。
然后，将混合物转移到预先加热的琼脂糖平板上，并均匀摇晃，使得细菌和噬菌体充分接触。
然后将含有混合物的琼脂糖平板培养在适当的温度下，通常在37下培养一段时间，让噬菌体感染目标细菌并形成溶菌斑。
5. 结果分析：观察琼脂糖平板上是否出现了溶菌斑，即噬菌体感染目标细菌后引起的溶解区域。
溶菌斑的大小和数量可以用来评估噬菌体的转导效果和细菌对噬菌体的感受性。
二、质粒张量传递方法传统的混合转染方法虽然简单易行，但受到不少限制，如只能传递噬菌体基因组，不能有效转导大分子质粒等。
而质粒张量传递方法则可以绕过这些限制，使得噬菌体转导的应用领域更加广泛。
1. 质粒构建：首先，需要构建带有目的基因的质粒，该质粒通常包括适当的启动子、转录起始序列、编码序列和终止序列。
2. 噬菌体构建：然后，将构建好的质粒导入到适当的噬菌体质粒载体中。
大肠杆菌、质粒和噬菌体
大肠杆菌具有多种抗原构造，包括菌 体抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗 原）和表面抗原（K抗原）。
大肠杆菌在生物工程中的应用
01
02
03
基因克隆和表达
大肠杆菌是基因克隆和表 达的常用宿主菌，可以通 过质粒载体将外源基因导 入大肠杆菌中进行表达。
蛋白质生产
大肠杆菌可以用于生产各 种蛋白质药物，如胰岛素、 生长激素等。
生物防治
噬菌体可以作为生物防治剂，用于防治某些细菌感染，如食品防腐和植物病害 控制等。
噬菌体的复制和感染机制
DNA复制
噬菌体进入宿主细胞后，利用宿主细胞代谢 系统进行DNA复制，产生多个子代DNA。
蛋白质合成
噬菌体DNA控制宿主细胞代谢系统合成噬菌体蛋白 质，包括头部和尾部蛋白质。
组装与释放
子代噬菌体在宿主细胞内组装完成，通过宿 主细胞裂解或出芽方式释放到外界环境中。
生物催化剂
大肠杆菌可以用于生产各 种生物催化剂，如脂肪酶、 淀粉酶等。
大肠杆菌的致病性
肠道感染
大肠杆菌是肠道感染的主要病原体之一，可引起腹泻、 呕吐等症状。
败血症
大肠杆菌可引起败血症，导致全身感染和多器官功能 衰竭。
尿道感染
大肠杆菌也是尿道感染的主要病原体之一，可引起尿 频、尿急、尿痛等症状。
02 质粒
基因敲除
利用质粒介导的同源重组技术，实 现基因敲除或定点突变。
03
02
表达载体
通过将目的基因插入到质粒上，实 现目的基因的高效表达。
基因治疗
质粒作为基因治疗载体，用于将治 疗基因导入病变细胞。
04
质粒的复制和传播机制
复制机制
质粒通过独特的复制机制， 在宿主细胞内自主复制， 并遗传给后代细胞。
λ噬菌体包装质粒原理
λ噬菌体包装质粒原理
噬菌体包装质粒是通过利用噬菌体感染细菌并将质粒DNA包装入噬菌体颗粒中来制备。
其原理包括以下几个步骤：
1. 噬菌体感染：选择一种合适的寄主细菌，使其被特定的噬菌体感染，噬菌体一般是属于细菌的病毒，在细菌被噬菌体感染后，噬菌体将控制细菌的合成机制并复制自身。
2. 质粒DNA插入：将感兴趣的质粒DNA插入到被感染的细菌中，这一步骤一般通过细菌转化技术实现，使质粒DNA进入细菌细胞质。
3. 质粒DNA复制和包装：被插入的质粒DNA在被感染的细菌中进行复制，同时噬菌体的复制机制也被激活。
在病毒复制的过程中，质粒DNA被包装入噬菌体颗粒中，形成带有质粒DNA的新的噬菌体。
4. 细菌溶解和收集：当感染的细菌数量达到一定程度时，噬菌体会释放，溶解宿主细菌。
此时，溶解的细菌中含有大量包装有质粒DNA的噬菌体颗粒，通过离心等方法，可以收集到纯净的噬菌体和质粒DNA。
通过以上步骤，可以利用噬菌体包装质粒原理，制备纯净的质粒DNA。
这种方法在基因工程实验中被广泛应用，包括基因克隆、重组蛋白表达、基因组库构建等。
入噬菌体及质粒载体
理想的质粒载体
(1)分子量小、多拷贝、松弛控制型; (2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点; (3)能插入较大的外源DNA片段; (4)具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和 筛选。 (5)对宿主细胞无害。常用的质粒载体大小一 般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、 PGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。
Β-半乳糖苷酶失活的插入型载体
• 载体基因组中含有一个大肠杆菌的 lac5区段，编码着Β-半乳糖苷酶基因 lacZ。由这种载体感染到的大肠杆菌 lac-指示菌，涂布在添加IPTG和Xgal 的培养基上就会形成蓝色的噬菌斑。
替换型载体
• λ噬菌体的中央部分有一个可以被外源插入 的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。
质粒载体的优缺点
• 质粒载体主要用于DNA分子的亚克隆，表达外源 蛋白，DNA序列的测定和基因的体外重新构建等。 • 1.与外源DNA重组操作简便； • 2.外源DNA在质粒载体中相对较稳定， • 3.质粒DNA的制备和纯化方便，快速简单，所以 得到广泛应用。 • 缺点： • 1.它容纳外源DNA片段有限，通常最多为15kb左 右，因为当质粒大于15kb时，转化效率明显下降。
质粒载体
质粒特点
• ①染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed
circuar DNA,cccDNA）可自然形成超螺旋结构，不同质 粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯
化，＞15kb的大质粒则不易提取。
• ②能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous
注 意
• λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶
菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体基因工程是一门综合性的学科，其中一个关键方面是使用载体进行基因转移和操控。
载体是一种可以携带和传递特定基因的DNA分子。
在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体。
下面将详细介绍这三种载体的相关信息。
1. 质粒（Plasmid）质粒是一种环状双链DNA分子，通常存在于细菌细胞内，也可通过人工方法导入其他生物体内。
质粒是最常用的基因工程载体，因其结构相对简单且易于操作，可以携带外源基因并通过转染等方法传递到细胞中。
质粒的大小通常在1-20千碱基对之间，具有自主复制和不受宿主基因组限制的能力。
质粒常用于基因克隆、表达以及基因敲除等研究。
例如，在基因克隆中，通过将目标基因插入质粒中的多克隆位点，可以将质粒转化到宿主细胞中进行扩增和分析。
质粒也常用于表达外源基因，可以将目标基因与促进其表达的启动子及调控元件结合在一起，构建表达载体进入目标细胞中，使其产生目标蛋白。
2. 噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，是基因工程中另一常用的载体。
噬菌体具有高度选择性对细菌进行感染和复制的能力，因此可以利用噬菌体来转移和表达外源基因。
噬菌体载体通常比质粒大，可以携带更长的DNA序列。
噬菌体常用于噬菌体展示技术和抗体库构建。
噬菌体展示技术是一种用于筛选蛋白质相互作用、抗体或潜在药物靶点的方法。
通过将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面蛋白基因融合，在噬菌体所感染的细菌中进行筛选。
另外，噬菌体也常用于构建噬菌体抗体库，通过大规模的筛选，筛选出具有特定抗体活性的噬菌体克隆。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是通过基因工程方法人为合成的染色体模拟体，在某些情况下可用于携带超长的DNA分子。
人工染色体被设计成可以稳定传递和复制的DNA分子，通常包括一个原核或真核的起始序列、一个中央控制区域和一个终止序列。
人工染色体在基因组学和基因治疗研究中发挥着重要作用。
第五章、噬菌体和粘粒载体
删除酶的功能是将原噬菌体DNA从细菌染色体DNA上删 除下来，而后环化成环形的DNA分子。。
5.1.2 .5 λ附着位点att
返回第五章
λDNA 整 合 在染 色 体 上的位 点 叫做λ附着位点att.
大多数的温和噬菌体都整合在 特定位置上。少数一些噬菌体可 整合在数个位点上，甚至染色体 的任何一个位点上。
复制起点ori自主复制序列arsautonomouslyreplicatingsequence着丝粒cen使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中有丝分裂中的纺锤丝联系的那段dna两个端粒tel即末端基因末端复制所必需且可防止染色体被核酸酶降解返回第五章第五章噬菌体和粘粒载体西北师范大学精品课程基因工程562人工细菌染色体载体克隆的片段大小10215kb平均100kb少量大于300kbbac载体本质上为质粒载体由于可克隆较大dna片段具有部分类似yac载体的特征因此将其称为人工染色体载体返回第五章第五章噬菌体和粘粒载体西北师范大学精品课程基因工程返回第五章
基因组中有一段免疫区 imm
当外源DNA插入时，合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源 周期。
imm
重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没有外源DNA插入的亲本噬菌体就 会形成混浊的噬菌斑。
②开半乳糖苷酶失活的插入型载体 基因组中含有一个大肠杆菌的lacZ 区段
返回第五章
lacZ
指示菌：lac一 培养基：IPTG和Xgal
第五章、噬菌体和粘粒载体
第一节 噬菌体的一般生物学特性 第二节 λ噬菌体载体 第三节 柯斯质粒载体 第四节 单链噬菌体载体 第五节 噬菌粒载体
第一节 噬菌体的一般生物学特性
5.1.1.1 结构及核酸
噬菌体颗粒基本类型:无尾二十面体型、 具尾二十面体型和线状体型。
基因工程载体质粒
丢失四环素抗性标记的正选择体系
原理是具有四环素抗性的细菌对亲脂的螯合剂萎蔫酸 (fusaric acid)极为敏感，因此，将外源性DNA插入到质粒 载体的四环素抗性基因的酶切位点上，在含有萎蔫酸的培 养基上筛选对四环素敏感的重组子，则是十分方便的方法。
人工质粒要素
1．质粒的基因组小好（不影响生物学功能前题） 。转化入细菌的转化率与质粒大小呈反比，当质 粒大于15kb时，转化率将成为限制因素,质粒大， 拷贝数越低。
。
2．质粒应易于转化。 3．质粒应有较多的拷贝数。 4．选择标记。 5．质粒DNA可插入结合较大的外源DNA
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
环形质粒分子
环形染色体DNA
质粒DNA
大肠杆菌细胞 抗菌素抗性基因
控制质粒DNA转移的基因
质粒主要包括几个组成部分
• 复制子（reilcator） • 复制起始位点(replication origin site) • 多克隆位点（Polylink）(MCS) • 辅助序列(COS位点等) • 选择标记(LacZ,抗性等)
Merry，1983 YAC) 9,来源于P1的细菌人工染色体（P1-derived artificial
chromosome PAC, loannon，1994）、 10,哺乳动物人工染色体（MAC，mamal artificial
chromosome，Farr，1991） 11,人类人工染色体（HAC，human artificial
pUC 18 和pUC 19质粒图谱
• 质粒主要包括几个组成部分：
• 一、复制子（reilcator）
• 也就是基础复制子（basic replicon）， 具有原质粒同样拷贝数的最小自主复制 单位。一般约2kb，含一个复制起始部 位Orgin（Ori）拷贝数多少和携带有 控制复制的基因信息。
质粒和噬菌体
2.噬菌体
2.噬菌体λ DNA分子的基因组织
01
04
02
03
The λ genetic map showing the positions of the important genes and the functions of the gene clusters.
Control integration
植物中可利用的载体较少。
adenoviruses(腺病毒)
昆虫病毒baculovirus(杆状病毒)
3 病毒作为其它生物的载体
The end! Thanks!
汇报人姓名
01
其他真核生物中尚未发现质粒存在。
02
1.质粒
1.5 细菌之外的质粒
2.噬菌体
2. 噬菌体
2.1噬菌体的特点 Structure Infection process
2.噬菌体
λ噬菌体的侵染循环
The lysogenic infection cycle of bacteriophage λ
B
2.噬菌体
cos位点的两个作用：
使进入细菌的DNA分子成为环状 ，这是插入细菌基因组的先决条件。 作为识别位点，由内切酶将原噬菌体从细菌基因组切下来 。
A
B
C
D
2 噬菌体
2.3 M13单链噬菌体DNA载体
2.3 M13单链噬菌体DNA载体
细菌细胞每分裂一次，大约可以释放1000个新的病毒颗粒。
质粒
大小/kb(千碱基对)
来源
pUC8
2.1
E. Coli
Col E1
6.4
E. Coli
RP4
54
Pseudomonas
载体的种类6
一 质粒（plasmid）载体
（一）质粒（plasmid）概述
质粒是细菌染色体外的遗传物质，为环形闭合的双股 DNA（部分质粒为RNA）。 ,存在于细胞质中，质粒编码 非细菌生命所必须的某些生物学性状，如性菌毛、细菌素、 毒素和耐药性等。质粒具有可自主复制、传给子代、也可 丢失及在细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有关。
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建 的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切 位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有 pBR322、pSC101。
质粒电泳图
2 大肠杆菌质粒的类型
F因子F进因供编子体码编菌在码向在细受细菌体菌菌表表传面面递产产色生生体性性D菌N菌A毛或毛。质。F粒因F。子因F的子因特的子性决特为定性可编以为码促可 以促的进性供菌体毛菌可在向供受体体与菌受传体菌递间色形体成D交N通A通或连质接粒结。构，F因从子而 决 定编可码使的两性个菌杂交毛细可菌在间供形体成胞与浆受内体连菌接间桥。形成交通连接结构，
（3）λ噬菌体的衍生物 λ噬菌体:λ噬菌体的基因组是一长度约为50kb的双链DNA分子， 它在宿主细胞有两种生活途径，其一是裂解生长，环状DNA分子在 细胞内多次复制，合成大量噬菌体基因产物，装配成噬菌体颗粒， 裂解宿主菌再进行下一次感染；其二是溶源性生长，即感染细胞内 λ噬菌体DNA整合到宿主菌染色体DNA中与之一起复制，并遗传给子 代细胞，宿主细胞不裂解。平板培养时，裂解生长形成噬斑。液体 培养时，裂解生长使菌液中宿主菌最后全部被裂解而释放出大量的 噬菌体颗粒。经过改造的λ噬菌体克隆位点可插入几到几十菌体 裂解生长的特点，培养获得大量的噬菌体颗粒，并提取λ噬菌体 DNA来开展进一步的工作。
常用克隆载体
PAC ( P1-derived artificial chromosome, 插入片 段可达300kb)
本图所表数字是 以 EcoR I 位点中央计为0， 从顺时针方向计算，至各 酶切位点的 第一个碱基的 数。在圆的内 部所表示的 各限制酶是在 pBR322 DNA上只有一个酶 切位 点的酶，圆外所表示的各 酶是在pBR322 DNA上 有2个至3个的酶切位点的 酶，（）内的数是酶切位 点数
质粒载体pUC19
缺点：插入M13的外源DNA超过1000bp时就不稳定，在 噬菌体增殖时会出现缺失。
噬菌粒载体
由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型载体系列， 称为噬菌粒（phagemid）。
噬菌粒（phagemid）是带有丝状噬菌体复制起始点的 质粒。
pUC118/pUC119噬菌粒载体; pBluescript噬菌粒载体（最常用，M13载体在多克隆 位点的两侧引入了T7和T3两个噬菌体的启动子。）
常用的粘粒载体
用于在细菌中增殖真核DNA的粘粒载体 pJB8, c2RB, pcos1EMBL 用于转染哺乳动物细胞的粘粒载体 cos202/203，pWE15/16
粘粒的主要特征
（1）由质粒与组成的一种4-6kb的环状杂种DNA， 容易分离并可分离操作。既能像质粒一样在细菌 中繁殖，又能像一样在体外包装，并高效导入受 体细胞。
基因工程常用的克隆载体
克隆载体
目的基因进入细胞必须要有载体（vector） 的运载作用才能实现。
载体运载外源DNA至宿主细胞，是通过 载体自身DNA的核酸序列中插入了外源 DNA，再进入宿主细胞内进行的DNA复制， 在载体DNA复制时，外源DNA分子也获得 了复制（扩增）和表达。
噬菌体载体复习题及答案.docx
噬菌体载体复习题及答案一、填空题1. 噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因：①它 在细菌中能够大量繁殖，这样有利于外源DNA 的扩增；②对某些噬菌 体(如入噬菌体)的遗传结构和功能研究的比较清楚，其大肠杆 宿主系统的遗传研究的比较详尽。
2. 入噬菌体基因组DNA 为48.5 kb,根据入噬菌体的包装能力，其 包装DNA 限度为37〜51 kb,为其本身基因组的75〜105 %。
将野生 型入噬菌体的基因组DNA 改造成插入型载体，如X ZAP II,该载体的 最小分子大小约为48.2kb,插入的外源片段最大不超过10. 2kb 。
构 建的入取代型载体XEMBL4,基因组大小为42. 36kb,填充DNA 片段为 14 kb,可容纳的外源DNA 分子最大为23 kb 。
3. 野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是没有合适的 限制性内切核酸酶识别位点和选 择标记。
4. 黏粒(cosmid)是质粒一噬菌体杂合载体，它的复制子来自质粒,大的克隆片段达到45 kb o 8.野生型的入噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体，原因是：① 分子 质量大；②酶的多切点；③无选择标记。
cmCOS 位点序列来自入噬菌体，9. M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：①SS-RF ；②RF-RF ；③ RF->SSo二、选择题（单选或多选）1.限制性内切核酸酶屁oR I在野生型的入噬菌体DNA中有5个切点，Hind III 有7 个切点，Banil I也有5个切点。
调整这些酶切位点的数量，主要通过（A ）。
A.体内突变B.完全酶切后连接C.部分酶切D.先用甲基化酶修饰后再酶切2.pBluescript M13载体在多克隆位点的两侧引入了T7和T3两个噬菌体的启动子，这样增加了该载体的功能，下述四种功能中哪一种是不正确的？（D ）A. 可以对插入到多克隆位点的外源片段进行转录分析B. 利用这两个启动子的通用引物进行PCR扩增C. 利用通用引物进行序列分析D.利用这两个启动子进行定点突变3. 下面关于细菌人工染色体（BAC）的特征描述，除了（C ）外都是正确的。
4第四章 基因克隆的载体-3柯斯质粒
因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外 包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式 将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬 菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内并自 我复制。 柯斯质粒（cosmid）
cos位点 cos site-carring plasmid 质粒
二、柯斯质ห้องสมุดไป่ตู้载体的特点
Formation of a cosmid clone
Digestion
Ligation
C) Packaging and infect
Ligation to cleaved cosmid vector molecules can produce vector-target concatemers, resulting in a large exogenous DNA fragment flanked by cos sequences.
③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，不易 于检测：因此如用柯斯质粒制备基因文 库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌 落很费时间。现虽建立了高密有可能通过同宿主基因组交换而致丢失 等，所以最常使用的还是噬菌体载体。
第三节 柯斯质粒(cosmid)
一、柯斯质粒（cosmid）概述
1、定义：是由λ噬菌体与质粒（plasmid）共同构 建而成的杂合载体。 2、柯斯质粒DNA:
λ噬菌体的cos位点:使其可被包装蛋白识别包装； 质粒的复制起点：使其在宿主细胞中可自主复制。
另外还含有与cos位点相邻的控制包装作用的序列， 质粒中的抗性标记基因（如：AmpR，TetR），以 及酶切位点（EcoRⅠ、HindⅢ）。
四、柯斯质粒作载体的优、缺点
1、优点： 可携带外源基因大， 30～44.5 kb 。
基因工程的载体种类
基因⼯程的载体种类基因⼯程的载体对于外源基因的复制、扩增、传代乃⾄表达⾄关重要，其必需具备以下条件：①具有有效运载能⼒，能够进⼊宿主细胞；②对多种限制酶有单⼀或较少的切点，最好是单⼀切点，即本⾝是⼀个复制⼦，携带外源基因前后均能在宿主细胞内⾃主复制，或者能够整合到宿主细胞中；③在宿主中能控制外源基因的表达活动；④要有筛选标记，鉴定⽅便，装卸⼿续简单；⑤容易控制，安全可靠。
在基因⼯程（DNA重组）中，使⽤的载体有：①克隆载体（clone vector），即以繁殖DNA分⼦为⽬的的载体；②穿梭载体（shuttle vecto），⽤于真核⽣物DNA⽚段在原核⽣物中增殖，然后在转⼊真核⽣物细胞宿主表达；③表达载体（express vector），⽤于⽬的基因的表达。
现在对载体提出了更⾼的要求，如：⾼拷贝数、具有强启动⼦和稳定的mRNA、具有⾼的分离稳定性和结构稳定性、转化频率⾼、宿主范围⼴、插⼊外源基因容量⼤且可以重新完整地复制与转录、和宿主细胞匹配等。
此外，载体在宿主不⽣长或低⽣长速率时仍能⾼⽔平地表达⽬的基因。
但达到上述要求的载体很少，尤其是当动物细胞作为宿主细胞时，⽬前能⽤的主要时病毒，进⼊宿主的⽬的基因⼀般只能是⼀个基因，⽽以基因组或多个基因同时进⾏重组还有⼀定困难。
⼀、质粒克隆载体除酵母杀伤质粒（killer plasmid）为RNA外，其他质粒多位环状DNA分⼦，每个质粒都有⼀段DNA复制起始点的序列，帮助实现质粒的复制。
质粒⼀般决定抗⽣素的抗性、产⽣抗⽣素酶系、糖酵解酶系、降解芳⾹族化合物酶系、肠毒素及限制-修饰酶系等。
其中严紧型复制控制质粒的复制与宿主染⾊体同步，并与宿主蛋⽩质合成有关，与DNA聚合酶I活性⽆关，蛋⽩质合成停⽌，质粒与宿主染⾊体复制亦停⽌，故只有1个或少数⼏个拷贝；⽽松弛型复制控制质粒的复制与宿主染⾊体复制不同步，与蛋⽩质合成⽆关，与DNA聚合酶I活性有关，蛋⽩质合成停⽌，质粒仍可复制，故可以在宿主有10—206个拷贝。
第五章 噬菌体载体和柯斯载体
本章主要内容
噬菌体一般特性 λ噬菌体 柯斯质粒 M13噬菌体 1、M13噬菌体特性及基因组结构 2、M13噬菌体载体类型及特点 噬菌粒
比较
第一节 噬菌体的一般生物学特性
（Bacteriophage，phage）
• 噬菌体可以在脱离寄主 细胞的状态下保持生命， 但一旦脱离了寄主细胞， 就不能生长和复制 • 利用寄主的核糖体、蛋 白质合成因子、氨基酸 和产能体系，进行生长 和繁殖
Charon 40
LA 19.2
短片段 重复替换区
MCS MCS
RA 9.6
•λNM781
在λNM781替换型载体中，可取代的EcoRⅠ片段， 编码有一个supE基因（大肠杆菌突变体tRNA基 因），这种λNM781噬菌体感染细胞后，寄主细 胞lacZ基因的琥珀突变被抑制，因此能在X-gal琼 脂培养基上产生出蓝色的噬菌斑。
2、替换型载体（取代型载体）
具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的 λDNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。 可以克隆较大分子量的外源DNA，克隆高等真核 生物DNA
（一）插入式载体
• λ噬菌体载体相对于质粒载体来活
的细菌 溶源化：用温和噬菌体感染细菌培养物使之
形成溶源性细菌的过程
整合：噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞 染色体DNA中
原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或 非整合的噬菌体
超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一 次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。
2、溶源周期的主要特征
λ噬菌体和P1噬菌体 λ噬菌体的特征： (1) 噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 (2) 经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于
Charon 4A Lac 5
植物基因工程中的λ噬菌体载体
•右臂：长约10kb，控 制溶菌和溶原生长最重 要的调控基因和序列、 以及λDNA复制起始均 在这区域内。
➢ 基因组长约50kb ，至少包括61个基因，除少数例外，大多数编码基因均是按功能的相似 性成簇排列。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生 长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。 植物基因工程中的λ噬菌体载体
植物基因工程中的λ噬菌体载体
λ早使用的载体 系统，其主要优点是插入片段的装载容量大，适合于 全长的eDNA克隆，不仅质量高、代表性好，而且重组 噬菌体颗粒的感染活性在替换或插入某些标志基因，如上述的可 供蓝白筛选lacZ’序列和多克隆位点等。
• 建立重组λDNA分子的体外包装系统。
• 与一般的质粒载体不同, 噬菌体转染前需要利用噬菌体外 壳蛋白和噬菌体DNA加工酶组成的混合物(包装抽提物
• )在体外将连接好的DNA线性分子包装成噬菌体颗粒
植物基因工程中的λ噬菌体载体
植物基因工程中的λ噬菌 体载体
2020/11/20
植物基因工程中的λ噬菌体载体
载体（vector）是把一个有用的目的DNA片段通过重 组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工 具。 植物基因工程技术中尤为重要的是载体，不同目的 基因需要采用不同的载体。 组成植物基因工程载体系统常见的几种载体有：
右臂，填充片断的存在会影响连接效率， 必须纯化左臂和右臂。
植物基因工程中的λ噬菌体载体
（3）外源片断与载体的连接 • 通过载体的粘性末端，将载体连接成多联
体，以利于将两个cos位点之间的片断装入 噬菌体颗粒
植物基因工程中的λ噬菌体载体
（4）重组噬菌体的体外包装，形成有感染力 的噬菌体颗粒
基因工程载体的分类及其特性
基因工程载体的分类及其特性田文晓 1343001125按照来源和性质分类1、质粒载体①复制：通常情况下一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区。
在不同的质粒中，复制起始区的组成方式不同，有的可决定复制的方式，例如滚环复制和θ复制；在大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点。
②拷贝数：质粒拷贝数分为严谨型与松驰型。
严谨型质粒每个细胞中拷贝数大约为1 ～几个；松驰型质粒拷贝数较多，可达几百。
③不相容性：两个质粒在同一宿主中不能共存的现象称质粒的不相容性，它是指在第二个质粒导入后，在不涉及DNA 限制系统时出现的现象。
不相容的质粒一般都利用同一复制系统，从而导致不能共存于同一宿主中。
两个不相容性质粒在同一个细胞中复制时，在分配到子细胞的过程中会竞争，随机挑选，微小的差异最终被放大，从而导致在子细胞中只含有其中一种质粒。
④转移性：指在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。
它需要移动基因 mob ，转移基因 tra ，顺式因子 bom 及其内部的转移缺口位点 nic。
2、噬菌体载体（包括λ噬菌体、M13噬菌体载体）1)λ噬菌体载体：大的外援插入片段在质粒中不稳定，转导是比转化效率更高的过程，避免出现无插入片段的空载体。
2)M13噬菌体载体：可以对任意克隆基因进行DNA进行诱变，测序方便，可以制备单链测序模板；含有噬菌体DNA的噬菌体颗粒从转化细胞中分泌出来后，可以在生长平板上收集。
①超感染免疫性：溶原性细菌在被噬菌体感染并溶原化后，不会被同种噬菌体再次感染。
②经过若干世代后，溶原性细菌会开始进入溶菌周期，即溶原性细菌的诱发。
此时，原噬菌体从宿主基因组上切离下来进行增殖。
3、粘粒载体（柯斯质粒）①具有λ噬菌体的特性。
柯斯质粒载体在克隆了合适长度的外源DNA，并在体外被包装成噬菌体颗粒之后，可以高效地转导对λ噬菌体敏感的大肠杆菌寄主细胞。
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理想的质粒载体
(1)分子量小、多拷贝、松弛控制型; (2)具有多种常用的限制性内切酶的单切点; (3)能插入较大的外源DNA片段; (4)具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和 筛选。 (5)对宿主细胞无害。常用的质粒载体大小一 般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、 PGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。
• 右侧区：位于Ｎ基因的右侧，包括全部主要的调控 成分，噬菌体复制基因（Ｏ和Ｐ）以及溶菌基因 （Ｓ和Ｒ）
注意
• λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶 菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基 因编码的蛋白质，同λ噬菌体的两个操纵基因 （OL, OR)之间的相互作用来决定的。
• 如果这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，那 么噬菌体便可以进入溶菌周期，否则进行溶源 周期。
酶形成融合蛋白质的克隆载体。
质粒载体
质粒特点
• ①染色质外的双链共价闭合环形DNA（covalently closed
circuar DNA,cccDNA）可自然形成超螺旋结构，不同质 粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯
化，＞15kb的大质粒则不易提取。
• ②能自主复制，是能独立复制的复制子（autonomous
构建λ噬菌体载体的基本原理
• 野生型的λ噬菌体DNA，对大多数基因克 隆中常用的核酸内切酶都有过多的限制位 点，通过消除一些多余的限制位点和切除 非必要的区段，才可能将它改造成适用的 克隆载体。
λ噬菌体载体可分为：
插入型载体 替换型载体
插入型载体
• 免疫功能失活的插入型载体：载体基因组 上存在一段免疫区，其中带有一两种核酸 内切限制酶的单切割位点。当外源DNA插 入到这种位点上时，就会使载体所具有的 合成性阻遏物的功能遭受到破坏，而不能 进入溶源周期。因此带有外源DNA插入的 λ重组体都只能形成清晰的噬菌斑，而没 有外源DNA插入的亲本噬菌体就会形成浑 浊的噬菌斑。
Β-半乳糖苷酶失活的插入型载体
• 载体基因组中含有一个大肠杆菌的 lac5区段，编码着Β-半乳糖苷酶基因 lacZ。由这种载体感染到的大肠杆菌 lac-指示菌，涂布在添加IPTG和Xgal 的培养基上就会形成蓝色的噬菌斑。
替换型载体
• λ噬菌体的中央部分有一个可以被外源插入 的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体。
从而能产生出大量的子代噬菌体颗粒。 • 使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒
λ噬菌体载体
1 λ噬菌体的分子生物学概述 2 λ噬菌体载体
1 λ噬菌体的分子生物学概述
• λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分 子，长48 502bp，两端各有12个碱基的5` 凸出黏性末端是互补的。进入细胞的λDNA 通过两端的黏性末端环化。可用来构建柯 斯质粒。
λ- 噬菌体及质粒载体
——郭苋 2014212346
噬菌体的一般生物学特性
• 依赖于寄主细胞存活。脱离了寄主细胞后既不能 生长也不能复制。
• 基本功能： • 保护自己的核酸分子（DNA或RNA）免遭环境化
学物质的破坏 • 将其核酸分子注入到被感染的细菌细胞 • 经被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，
注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA 大小只能： 38kb ~ 52kb。 体外包装：λ噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白
λ噬菌体载体的良
• 围绕三个目的进行： • 设计可对重组体分子作正选择的克隆载体， • 构建可方便的通过转录作用制备外源DNA
插入序列之RNA探针的克隆载体 • 发展可使插入的真核cDNA与β-半乳糖苷
• λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其 生活周期。
λ噬菌体基因组编码基因区域
• 左侧区：自基因A到基因J，包括参与噬菌体头部蛋 白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因。
• 中间区：介于基因J与基因N之间，这个区又称为非 必要区。本区基因与保持噬菌斑形成能力无关，但 包括了一些与重组有关的基因（redA 和redB）。以 及整合到大肠杆菌染色体中去的int基因。和把原噬 菌体从寄主染色体上删除出去的xis基因。
质粒载体的优缺点
• 质粒载体主要用于DNA分子的亚克隆，表达外源 蛋白，DNA序列的测定和基因的体外重新构建等。
• 1.与外源DNA重组操作简便； • 2.外源DNA在质粒载体中相对较稳定， • 3.质粒DNA的制备和纯化方便，快速简单，所以
得到广泛应用。
• 缺点： • 1.它容纳外源DNA片段有限，通常最多为15kb左
replicon）。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂 而传给后代。
• ③质粒对宿主生存并不是必需的，某些质粒携带的基因
功能有利于宿主细胞的特定条件下生存。
质粒载体的种类
• 在基因工程中，常用人工构建的质粒作为 载体。人工构建的质粒可以集多种有用的 特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗 生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有 pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素 基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含 有27种限制性内切酶的单一识别位点。
• 中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向 重复序列。因此当外源DNA插入时，一对 克隆位点之间的DNA片段便会被置换掉， 从而有效的提高了克隆外源DNA片段的能 力。
λ噬菌体载体的特点
(1)筛选简便； (2)可克隆的片段大，最大可达23 kb，
而质粒最大仅10 kb左右； (3)转化效率高。λ噬菌体载体是主要用于cDNA构建， 也经常用于外源目的基因的克隆。