感受态制备蓝白斑筛选

转
转入受体菌
筛
筛选重组体
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基因工程
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一、感受态细胞及重组体转化
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重组体转入受体菌
转化（transformation ）
转染（tra百度文库sfection ） 转导（transduction ）
受体细胞
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重组DNA分子导入受体细胞的手段
特殊处理
受体细胞 细胞膜特性改变
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50-100mmol/L CaCl2
受体细菌
感受态细 菌
重组体转入细 菌
CaCl2处理
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感受态 (competent) ：宿主细胞处于容易吸收外源性 DNA的 状态，处于感受态的细胞称为感受态细胞 .
正常细胞都有细胞膜（细菌还有细胞壁）作屏障，对外源分 子选择性接受。在实验中通过一定的理化条件使细胞通透性增 大，处于感受态。
? 感受态细胞的制备 ? 质粒转化入大肠杆菌及初步筛选
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? 复习：基因克隆示意图
载 体 DNA
＋
(限制性内切酶切开 )
目的基因
＋
宿主细胞
重组体
已转化的宿主细胞
繁殖 阳性克隆株
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基因克隆操作过程：
分
分离载体和目的基因
切
限制酶切载体与目的基因
接
拼接重组体
三、重组体的筛选
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重组体克隆的筛选与鉴定
由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛 选和鉴定方法得到含有重组 DNA的阳性克隆。
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筛选的依据： 基因载体的特点、受体细胞的特性和外源基因的表达。 筛选的方法：
抗药性标志的选择 插入表达筛选 ? -半乳糖苷酶系统筛选（ ? -互补） (? -半乳糖苷酶能将 X-gal 转变为不溶性的深蓝沉淀）
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制备感受态细胞和转化的常用方法
CaCl 2转化程序法：传统方法,转化效率能达到5? 106－2?107转化子/? g质 粒DNA，简单、快速、重复性好、菌株适用范围广。 电穿孔转化法、脂质体 (liposome) 法、胞核的显微注射法 (microinjection) ； 磷酸钙介导的转染、聚乙二醇介导的原生体转化法；
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α
U
互
6
补
的
检
测
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目录
原位 杂交
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目录
Southern 印迹
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目录
鸡的β肌球蛋白的克隆和检出
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目录
预期结果
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pUC119
pUC119 -u6
含空载体pUC119 的蓝色菌落
转化是将含有目的基因的质粒导入细菌内进行表达。 转染是将含有真核生物基因的噬菌体感染细胞 ; 转导则是指病毒从被感染的细胞 (供体)释放出来，再
次感染另一细胞(受体时)，发生供体细胞与受体 细胞之间的DNA转移及基因重组。
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转化方法
? CaCl2诱导转化 ? 电穿孔 ? PEG介导转化 ? 人工体外包装
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抗 药
插(
性入
标失
记活
选法
择)
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目录
菌落杂交筛选法 内切酶图谱鉴定 PCR筛选重组子 Southern印迹杂交和菌落原位杂交 DNA序列分析 免疫化学检测法
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蓝白斑实验
原理：基因载体上含有? -半乳糖苷酶（LacZ) 的基因，当外源DNA插 入到载体的LacZ 基因上后将造成? -半乳糖苷酶失活，就不能分解培养 基中的X-gal(5- 溴-4-氯-3-吲哚-? -D-半乳糖苷）产生蓝色产物，结果可 通过大肠杆菌转化子菌落在含有 X-gal-IPTG （异丙基-?-D-硫代半乳糖 苷）培养基的颜色变化直接观察出来。
含pUC119 -u6 的白 色菌落
弃上清，将管倒置于滤纸上1min ，使液体流干净 沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl 2 100μl，重悬菌体。
冰浴10min
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冰浴10min 后 每管加入质粒5? l 轻轻旋转试管，混匀混合物，在冰浴上放置 20min 试管放入420C的水浴中，放置90s，不要摇动试管 迅速将试管转移到冰浴，冷却 1~2min
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取出试管后，每管加入LB培养基800? l， 置于370C摇床（100~150r/min），温和震荡45min 用无菌弯头玻璃铺菌器将200? l菌液铺于含Amp的琼脂平板表面
室温放置20min，使液体被吸收（发汗） 倒置平皿，370C培养，12小时可见菌落生长
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0.1mol/LCaCl 2
0℃
重组体
感受态细胞
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转化与感受态细胞
转化(transformation) ：在分子克隆技术中，转化特指质粒 DNA或以它为 载体构建的重组子导入细菌的过程。 区别转化、转染(transfection) 与转导(transduction)
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CaCl 2法制备感受态细胞和转化的原理
一般受体菌对重组 DNA分子的摄取能力很低，难以转化成功。 当细菌处于冰冷（0℃）0.05～0.1M的 CaCl 2低渗溶液中，菌体的细胞 膨胀成球形，细胞膜的通透性增加，对 DNA的摄取能力增强，转化效 率提高（感受态细菌）。
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同时在转化体系中的 DNA形成的抗DNase的羟基-钙磷酸复合物能 粘附于细菌表面，经过 42℃短时间热休克（ heat shock ）处理，促进感 受态细胞吸收 DNA复合物。在丰富培养基上生长 1小时后，球状细胞复 原并分裂增殖，重组子中的基因在转化细菌中得到表达，在选择性培 养(selective culture) 平板上即可筛选出所需的转化子。
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二、感受态细胞制备及重组体 转化的实验操作及注意事项
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细菌转移到一冰冷的1.5ml的EP 管，40C，4000rpm ×5min
弃上清，沉淀中加入冰冷的0.1mol/L CaCl 2 300μl，重悬菌体，冰浴20min 40C，4000rpm ×5min