蓝白斑筛选实验中的污染问题

生物工艺原理期中作业

生物工程班彭章川P081412758

蓝白斑实验中需要注意的污染问题

蓝白斑筛选实验是分子生物学中比较经典的一个实验，包括：第一部分质粒DNA的提取、第二部分质粒DNA的酶切（即载体的酶切）、第三部分目的DNA片段与载体的连接、第四部分感受态细胞的制备、第五部分转化与蓝白斑筛选。这是一个步骤繁多且复杂的综合实验，每个步骤的操作要求也都很严格，特别是在防污染方面的要求非常高，只要有一个步骤受到污染都会引起实验的失败。引起污染的因素的很多，比如DNase酶污染、蛋白质污染、金属离子的污染、细菌污染等。下面分步说明：

一、质粒DNA的提取：

这部分包括杂菌污染、蛋白质污染、RNA污染。其中杂菌污染可能发生在实验用菌培养中、风干和加灭菌水时，培养实验用菌时若污染了杂菌，会导致添加的菌液中目的菌体量不足甚至没有，其结果就是提取质粒失败，LB培养基灭菌不彻底或接种时操作不当都会引起污染，所以为了防止这种污染的发生，实验中LB培养基的灭菌一定要彻底，接种最好在通风厨中进行并且操作要快而准确；风干和加灭菌水时很可能会污染空气中的和不合格的灭菌水中的杂菌，若污染了杂菌，杂菌会产生DNA酶而分解提取的质粒DNA，所以风干时一定在通风橱中，加灭菌水时一定要确定是否是灭菌水以及灭菌是否被污染。蛋白质污染主要来自蛋白质抽提不完全，若蛋白质抽提不完全，蛋白质会结合DNA给后续电泳分析带来影响，所以在用氯仿异戊醇抽提蛋白质时要重复一次以除尽蛋白质。另外实验中很可能会残留部分RNA造成污染，RNA污染同样会给电泳分析带来影响同时也会给酶切带来影响，所以加入灭菌水以后一定加人有活性的RNA酶并且在37度下保持30分钟。如果引起上述的污染，由于实验试剂用量在ul水平，根本没有挽救措施，只有认真的重做一次。

二、质粒DNA的酶切：

这一步的实验污染主要是由于所使用的PCR管以及加样枪头的不洁净引起的，比如使用已经用过的PCR管和枪头，这样就很可能引起杂菌、蛋白质、固体杂质等污染，进而引起酶切实验的失败。所以做这一步实验时一定要事先准备好洁净的PCR管和枪头，另外实验中加样时一定记得换枪头。同样，如果实验产生了污染，只能再做一次。

三、目的DNA片段与载体的连接：

这一步同样要注意PCR管和加样枪头可能会带来的污染问题，即要确定使用的PCR管和加样枪头是洁净的。此外，质粒DNA的酶切步骤中残留的EcallRI 酶会污染这一步的实验，因为DNA酶存在的情况肯定会影响DNA连接酶的连接作用。为了消除这个污染，所以进行连接前要在65度中保持5-10分钟使EcallRI酶失活。

四、感受态细胞的制备：

感受态细胞的制备中主要是防止杂菌的的污染，在LB培养基上接种细菌时很可能因操作不当而引起杂菌的污染，也有可能因为所用的菌种本身就有杂菌污染。所以应该选取没有污染的可靠的菌种，还有在接种操作时要在通风厨中按流

程仔细操作。

五、转化与蓝白斑筛选：

此步骤的污染问题主要是杂菌污染问题，转化操作中培养基灭菌步彻底、涂板操作时污染空气中的杂菌、挑取蓝白斑时污染空气中杂菌以及器皿不洁净引起的污染。转化操作中培养基灭菌步彻底和涂板操作时污染空气中的杂菌会引起蓝白斑不明显或有杂菌菌落或不出现蓝白斑，从而导致实验失败。器皿不洁净引起的污染根据污染类型和程度不同而不同。挑取蓝白斑时污染空气中杂菌会影响后续的鉴定和测序工作。所以这一步要做到培养基灭菌彻底、涂板和挑蓝白斑要在通风橱中规范地操作、保证使用器皿的洁净。

总的来说，蓝白斑筛选实验的污染因素主要你有杂菌污染、蛋白质污染、酶污染。对于这种要求严格的实验，每一种污染都可能导致实验失败。并且每一步的操作过程中的污染都没有挽救措施，所以要求实验者一定要认真仔细，规范地操作，防止污染。