蓝白斑筛选

一、

1、蓝白筛选的原理

LacZ'是lacZ基因的突变型，编码半乳糖苷酶N端的146个氨基酸（全长1201氨基酸）。MCS也在这个区域内。这类载体的适合宿主细胞必须是Z基因突变型，只具有Z基因C端的序列。当两个Z基因的突变产物在一起时可产生蛋白质间的互补，称α互补。

如pUC系列的载体一般采用DH5α、JM109。因为pUC系列的质粒具有lacZ的α片段，而具有lacZ△M15基因型的DH5α、JM109等能表达与α片段互补的ω片段，因此当不带有外源基因的质粒pUC导入宿主细胞，具有lacZ的β-半乳糖苷酶活性，而插入外源基因的pUC质粒导入宿主细胞，则不具有β-半乳糖苷酶活性。

当将具有α互补的细菌培养在含IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，本身无色）的培养基上时，因β-半乳糖苷酶能将X-gal底物水解产生兰色物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此菌落为兰色。相反，不互补则产生白色菌落。如果在MCS位点上插入DNA片段导致插入突变，则不能产生α互补，因此菌落是白色的。从而通过菌斑的颜色即可选择出具有插入外源基因的质粒的大肠杆菌。

2、影响转化率的几个重要因素

⑴、受体细胞

转化的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，它可容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。

另外还应根据载体的性质及实验的目的选择合适的宿主。

此外，受体细胞生长状态和密度也很重要。不要使用经过多次转接或储存于4℃的培养菌。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，密度过高或不足均会影响转化率。

⑵、载体DNA和重组DNA方面

载体本身性质决定了转化的高低，不同的载体DNA转化同一受体细胞，其转化效率不同。载体的空间构象也有明显影响，超螺旋结构的载体质粒往往有较高的转化率，经体外酶切连接操作后的载体DNA或重组DNA由于空间上难以恢复，其转化率常比cccDNA低两个数量级。对以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。

⑶、操作方面

感受态细胞的制备对转化率影响较大。一般未经特殊处理的培养细胞对重组DNA分子不敏感，难以转化成功。为防止杂菌和杂DNA的污染，整个操作均应在无菌条件下进行，所有器皿最好是新的，并经高压灭菌处理，所有试剂也都要灭菌处理。

⑷、转化体系中重组DNA的浓度与纯度

转化体系中重组DNA的浓度与纯度对转化率也有一定影响。在一定浓度范围内，浓度越高，转化率越高，重组DNA纯度越高，转化率越高。

⑸、外源基因与宿主染色体的同源性

外源基因来源与宿主亲缘关系越近，越易整合到宿主染色体中，转化率越高，否则易被宿主核酸酶降解而降低转化率。

二、实验试剂

X-gal：2%母液（用二甲基甲酰胺配制，包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏，-20℃保存备用），工作浓度20ul/20ml平板；

氨苄青霉素(Amp)：用无菌水配制成100mg/ml母液，置-20℃冰箱保存。工作浓度100ug/ml；

IPTG：母液100mmol/L，-20℃冰箱保存。工作浓度40ul/20ml平板；

LB液体培养基：1%蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl，用NaOH调pH到7.2，121℃灭菌20min备用。固体LB培养基则在LB液体培养基中添加1.5%～2%琼脂，灭菌后备用；

含Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp储存液，使终浓度为100ug/ml，摇匀后铺板；

大肠杆菌DH5a。

试剂的作用：

X-gal（5-溴-4-录-3-吲哚-β-半乳糖苷）：一种人工化学合成的半乳糖苷，可被β－半乳糖苷酶水解产生兰色化合物。

IPTG：异丙基硫代半乳糖苷，很强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，它可诱导LacZ的表达。

三、实验器具

超净工作台；恒温水浴锅；制冰机；微量移液器；恒温摇床；常温离心机；恒温生化培养箱；冰箱；培养皿；玻璃刮铲。

四、实验步骤

⑴、取4ul连接产物加入100ul感受态细胞中，用枪轻轻吹打均匀，冰浴30min。

⑵、将管置于水浴锅中42℃水浴热激90sec，立刻放置冰上5min。

⑶、加入1ml 37℃预热的LB培养基，混匀。

⑷、将管置于恒温摇床上37℃振荡培养1h。

⑸、将管置于离心机中3000rpm离心5min。

⑹、弃1ml上清，余下约100ul上清，用枪轻轻吹匀，用于涂板。

⑺、在一含氨苄青霉素的LB平板上，加入20μl 20mg/ml X-gal和40μl100mmol/L IPTG。

⑻、将玻璃刮铲过火灭菌后伸入培养平板中，待其冷却后均匀涂布平板，玻璃刮铲过火灭菌后置于酒精中备用，平板于室温放置30min备用。

⑼、将前述所得含重组子的菌液吸至制备好的含X-gal的平板上，用玻璃刮铲均匀涂布。将平板置于生化培养箱中正面放置30min后，再倒置，于37℃培养过夜。

五、注意事项

1、质粒的质量和浓度

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的10％。

2、防止杂菌和杂DNA的污染

整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。

3、显色反应的时间

需要将平板放入4℃冰箱中3-4h，使得显色反应充分。

4、平板的涂布

菌液涂平板的时候要避免来回涂布，否则过多的机械挤压涂布会导致细胞破裂，影响转化效率。

附件中包含有：整个过程的步骤的图片、一些常见问题与对策