蓝白斑筛选的原理及方法

蓝白斑筛选的原理及方法

载体pGEMZ在β-半乳糖苷酶（lacZ）的α-肽编码区内具有多克隆区域。在重组质粒中插入片段使α-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。不带有插入片段的载体，表达有功能的β-半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉lacZM15基因，导致内源α-肽失活。载体pGEMZ或其它含lacZ基因的α-肽互补细菌，具有β-半乳糖苷酶的ω片段，所得功能β-半乳糖苷酶（α-肽加ω片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。在载体pGEMZ 的多克隆区域，克隆上插入片段导致α-肽编码区的破坏，使β-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。α-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落，因β-半乳糖苷酶只是部分失活。

重组质粒转化到合适的菌株中（JM109，DH5α），然后涂布到含0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal指示平板上。可将50ul的X-Gal和100 ulIPTG贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在37oC保温30分钟使液体扩散。IPTG溶于水中，贮液浓度为100mM，X- Gal溶于DMF，贮液浓度为50mg/ml。IPTG 和X- Gal需分装后保存在-20 oC，可保存2-4个月。

◆IPTG即Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，也称Isopropyl β

-D-thiogalactoside，中文名为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。分子式为

C9H18O5S ，分子量为238.30，CAS Number 367-93-1，Ultra Pure，dioxane free，纯度>99.6%。我公司提供Merck公司该产品。

◆本产品为接近白色的粉末常用分子生物学试剂，常用于蓝白斑筛选及IPTG诱导的细菌内的蛋白表达等。IPTG是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特性，当pUC系列的载体DNA（或其他带有lacZ 基因载体DNA）以lacZ 缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体的载体DNA进行转染时，如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑选出基因重组体。此外，它还可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用.

使用方法：

首先把IPTG配制成24 mg/ml（100 mM）的水溶液，并进行过滤除菌后保存。然后在100 ml的琼脂培养基中，加入100 μl的上述溶液、200 μl的X-Gal（20 mg/ml的二甲基甲酰胺（DMF）溶液）和100 μl的Amp（100 mg/ml），制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。当DNA片段插入至pUC系列载体（或其他带有lacZ、Amp基因载体），然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、X-gal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体（白色为具有DNA插入片段的基因重组体）。

保存条件：粉末在－20℃稳定保存至少三年，具体请参考各个厂家提供的保存条件

注意事项：

◆培养噬菌体时，Top agar中的添加量为：25 μl/3 ml（24 mg/ml）

◆含有IPTG的培养基4℃避光保存，须在1~2周内使用。