蓝白斑筛选的原理及方法

蓝白斑筛选的原理及方法

载体pGEMZ在俟半乳糖苷酶（lacZ ）的a肽编码区内具有多克隆区域。在重组质粒中插入片段使a-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。不带有插入片段的载体，表达有功能的禺半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉lacZM15基因，导致内源a-肽失活。载体pGEMZ或其它含lacZ基因的a-肽互补细菌，具有俟半乳糖苷酶的3片段，所得功能俟半乳糖苷酶（a- 肽加3片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。在载体pGEMZ 的多克隆区域，克隆上插入片段导致a-肽编码区的破坏，使俟半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。a-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落，因俟半乳糖苷酶只是部分失活。

重组质粒转化到合适的菌株中（JM109 ，DH5a ），然后涂布到含0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal 指示平板上。可将50ul 的X-Gal 和100 ulIPTG 贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在37oC 保温30 分钟使液体扩散。IPTG 溶于水中，贮液浓度为100mM ,X- Gal溶于DMF，贮液浓度为50mg/ml 。IPTG 和X- Gal 需分装后保存在-20 oC ，可保存2-4 个月。

IPTG 即Isopropyl B -D-1-thiogalactopyra no side ，也称Isopropyl B

-D-thiogalactoside ，中文名为异丙基-B -D-硫代半乳糖苷。分子式为

C9H18O5S 分子量为238.30, CASNumber367-93-1，Ultra Pure, dioxane free，纯度＞99.6%。我公司提供Merck 公司该产品。

.本产品为接近白色的粉末常用分子生物学试剂，常用于蓝白斑筛选及IPTG 诱导的细菌内的蛋白表达等。IPTG是B -半乳糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特性，当pUC系列的载体DNA或其他带有lacZ基因载体DNA以lacZ缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体的载体DNA1行转染时，如果在平板培养基中加入X- Gal和IPTG,由于B -半乳糖苷酶的a -互补性，可以根据是否呈现白色菌落（或噬菌斑）而方便地挑选出基因重组体。此外，它还可以作为具有lac 或tac 等启动子的表达载体的表达诱导物使用.

使用方法：

首先把IPTG配制成24 mg/ml （100 mM）的水溶液，并进行过滤除菌后

保存。然后在100 ml的琼脂培养基中，加入100卩l的上述溶液、200卩l

的

X-Gal （20 mg/ml 的二甲基甲酰胺（DMF 溶液）和100 卩l 的Amp（ 100

mg/ml）, 制作成IPTG X-Gal、Amp平板培养基。当DNA片段插入至pUC系列载体（或其他带有lacZ、Amp基因载体），然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、

X-gal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体（白色为具有DNA插入片段的基因重组体）。

保存条件：粉末在-20C稳定保存至少三年，具体请参考各个厂家提供的保存条件

注意事项：

♦培养噬菌体时，Top agar中的添加量为：25卩1/3 ml （24 mg/ml）

♦含有IPTG的培养基4 C避光保存，须在1~2周内使用。

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