第一章 环境监测中的微生物学方法

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2）平皿分离（证实试验）
水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能 引起糖类发酵，因此需要进一步证实。
将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红 美兰培养基或远藤氏培养基上，37ºC培 养24hr，根据菌落特征，挑取可能为大 肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进 一步证实是否为大肠菌群。
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表2.4 落菌法测细菌所需要的最少培养皿数(沉降0.5h)
含尘浓度最大值
0.35 3.5 35 350 3 500~35 000
需要d90mm培养皿数
40 13 4 2 1
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第二节 水质的细菌学检验
一、细菌总数
是将定量水样（原水样或经一定稀释 后的水样1mL）接种于牛肉膏蛋白胨琼 脂培养基平板上，于37ºC培养24hr后观 察结果，计算细菌菌落数，最后算出原 水样每毫升的细菌总数。
致病菌数量少，检测比较复杂，故选用间接指标 即粪便污染的指示菌为代表。
常用肠道正常细菌在水中的存在及数量情况作为 粪便污染的指示。
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健康成人粪便内的微生物数量
微生物名称
主要微生物
每克粪便中平均生长菌落数
拟杆菌属 乳酸杆菌属 大肠埃希氏菌属 粪链球菌 次要的微生物 柠檬酸杆菌属 梭菌属 葡萄球菌属 克雷伯氏菌属 肠杆菌属 芽孢杆菌属酵母属 霉菌 较少的微生物
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3）结果观察： 培养16hr~18hr后，挑选深红 色或紫红色、不带或带有金属光泽的菌落， 或者淡红色、中心色较深的菌落进行革兰 氏染色观察，确定大肠菌群细菌。
G- ：接入乳糖培养液中，复发酵；
G+：阴性结果。
经染色证实为G-无芽孢杆菌者，再接入乳糖 蛋白胨半固体培养基中，37ºC培养6~8hr， 产气者判定为大肠菌群阳性。
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三、大肠杆菌
（一）特征
定义：一群需氧或兼性厌氧性的G-无芽孢杆 菌，能在37ºC培养24hr使乳糖发酵产酸产气， 包括了粪便内全部兼性需氧性的G-杆菌，以 大肠杆菌埃希氏菌属为主，尚有柠檬酸杆菌 属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等。
成人每日粪便中排出的菌数可达(5~100)×106 个。
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1010 109 108 108
105-106 105-106 105-106 104-105 104-105 104-105 104-105
变形菌属
102-103
2019年5铜月16绿假单胞菌属
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102-103
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（一）指示菌的理想条件
1. 大量存在于人的粪便中，且数量比病原 菌多；
2. 受粪便污染的水中易检测出该指示菌， 未受污染的水中无此菌；
3. 在水体中不会自行繁殖； 4. 存活时间略长于致病菌，对消毒剂的抵
抗略强于致病菌； 5. 检出及鉴定方法比较简易迅速； 6. 适用于各种水体。
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（二）适宜的指示菌
总大肠菌群，粪大肠菌群、大肠 杆菌埃希氏菌（大肠杆菌）、克 雷伯氏菌属。
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质，微生物附着于这些物质的微粒上随气流传 播。
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微生物产生的孢子本身也可以飘浮到空 气中，形成 “气溶胶”，借风力传播。
空气中的微生物中，真菌的孢子数量最 多，细菌较少。而且藻类、酵母菌、病 毒都会存在于空气中 。
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二、空气微生物的卫生标准
N——菌落数，个。
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简化后的奥氏公式：
1000×50N C=
A×t
经测定发现，用奥式公式计算的浮游细 菌数比实测的浮游细菌少。
此公式没有考虑尘埃粒子大小、数量、 气流情况、人员密度和活动情况。
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(2)撞击法：
以缝隙采样器为例，用吸风机或真空泵将 含菌空气以一定流速穿过狭缝(狭缝宽有 0.15 mm、0.33 mm和1 mm三种)而被抽吸 到营养琼脂培养基平板上。狭缝长度为平 皿的半径，平板与缝的间隙有2mm，平 板以一定的转速(1 r／min、5-60r／min、 60r／min)旋转。
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撞击法检测空气中微生物数量
培养前
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培养后
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2 液体法
液体法用于测定空气中的浮游微生物， 主要是浮游细菌。该法将一定体积的含 菌空气通入无菌蒸馏水或无菌液体培养 基中，依靠气流的洗涤和冲击使微生物 均匀分布在介质中，然后取一定量的菌 液涂布于营养琼脂平板上，或取一定量 的菌液于无菌培养皿中，倒入15-18ml融 化(45℃)的营养琼脂培养基，混匀，待冷 凝制成平板，置于37℃恒温箱中培养48h， 取出计菌落数。
目前，还无统一的关于空气的卫生学指 标，一般以室内1m3 空气中细菌总数为 50~1,000个以上作为空气污染的指标。
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病原菌在空气中一般很易死亡，但结核 菌、白喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺 炎双球菌、炭疽杆菌、流感病毒和脊髓 灰质炎病毒等，也可以在空气中存活一 段时间。
0
表2-2 以细菌总数评价空气的卫生标准（个/m3 ）
清洁程度
细菌总数
最清洁的空气（有空调）
1~2
清洁空气
<30
普通空气
31~125
临界环境
~150
轻度污染
<300
严重污染 2019年5月16
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>301
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三、空气的微生物监测
通常采用营养琼脂平板计数法。 我国检测空气微生物所用的培养皿直径
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(二)空气微生物的检测点数
空气微生物的测点数越多越准确，为照 顾到工作方便，又相对准确，以20~30个 测点数为宜，最少测点数为5~6，见表。
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表2.1 日本有关标准测点数的规定
时
间
标准
名称
尘埃多的地方，如畜舍、公共场所、医 院、城市街道的空气中，微生物数量较 多。高山、海洋、森林、积雪的山脉和 高纬度地带的空气中，微生物较少。
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场所
表2-1 不同场所上空微生物的数量（个/m3 ）
畜舍
宿舍
城市 市区 海洋 街道 公园 上空
北纬 80º
微生物 (1~2)106 2×104 5×103 200 1~2
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（二）大肠菌群的测定
常用多管发酵法与滤膜法：
1. 发酵法：
又称多管发酵法或三步发酵法
1) 初发酵（推测试验）：将不同稀释度的 水样，分别接种于含有乳糖等糖类的培 养液中（3倍或1倍乳糖液），经37ºC培 养24hr，观察产酸产气情况，以初步判 断是否有大肠菌群存在。
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通常平板转动一周，取出置于37℃恒温箱中 培养48h，根据空气中微生物的密度可调节 平板转动的速度。采集含菌高的空气样品时， 平板转动的速度要比含菌量低的空气样品的 转速快。根据取样时间和空气流量算出单位 空气中的含菌量。采样器的规格各国不一， 可按说明书操作。
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1987 JIS B 9920
洁净室中 浮游粒子
测定方法 和洁净室 的评价方
法
最 建议
每点
少 测点 点距 测定
测
数 （m） 次数
点 数
原则 上<3
6 20， 空间 ≥3 30 太大 可放 宽
空气清 1987 净协
会标准
洁净室性 能评价指
南
原则 5 20, 30 上<3
2019摘年5自月1许6 钟麟．空气洁净技术原感理谢．你的P观5看22．同济大学出版社，1998 21
具有相对的卫生学意义，菌数越高， 反映出水体受有机物污染或粪便污染越 重，病原菌污染的可能性亦大。
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二、粪便污染指示菌
人畜粪便中常常带有大量的微生物，其中有些属 于正常的、对人体无害的肠道微生物，有些则是 病原微生物，进入水体后，可造成水体的污染， 从而引发各种肠道疾病。因此，水质的卫生学检 验，对于保护人群健康，具有重要意义。
第一章 环境监测中的微生物学方法
当环境受到污染后，环境的
物理性质 化学性质
发生变化
生物学特性
如：
重金属离子、NO3- 浓度增加； 水体污染变质，水生生物种类减少，甚
至灭绝；
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如何监测？
化学方法：快速、定性定量反映污染物 浓度，但为瞬时值；
生物学方法：利用生物种类、数量的变 化，生物学特性的改变来监测污染物对 环境的影响。
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再以菌液体积和通入的空气量计算出单 位体积空气中的细菌数。
例如：将10m3含菌空气通入100mL的无 菌水中，使10m3空气中的微生物全部截 留在100mL水中。然后取0.1 mL菌液涂布 于平板上，若长出100个菌落，10mL水中 共含菌10,000个，则10m3空气含有10,000 个。1m3空气含有1,000个 。
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4）结果计算： 根据滤膜上证实的大肠菌 群数及滤过水量，求出1L水中的大肠菌 群数量。
计算公式： 总大肠菌群数 =
滤膜上生长菌落数 × 1000
过滤水样量（mL）
滤膜上的菌落数以20~60个/片为适宜。 5）评价报告： 根据测定的数值写出检测水样的细菌学
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可通过前苏联奥梅梁斯基公式换算出浮游 细菌数。
奥氏认为：5 min内落在面积100mm2营养 琼脂平板上的细菌数和10L空气中所含的 细菌数相同。
奥氏公式：C =
100 A
×
5 t
× 1000
10
×N
式中：C—空气细菌数；
A——捕集面积，cm2 ；
t ——暴露时间，min；
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2 滤膜法
发酵法全部检测需要的时间较长，为缩 短时间，可以采用滤膜法，其步骤为：
1）水样过滤：选用具有微孔的滤膜，灭菌 后通过抽滤一定量的待测水样，将水中 的细菌截留在无菌滤膜上；
2）培养：将滤膜有菌面朝上贴于特定的固 体培养基平板上（伊红美兰培养基或远 藤氏培养基），经37ºC培养16hr~18hr；
表2.2 按美国联邦标准209E方法计算的必要测点数
进风面积 (单向流) 或室面积 (乱流)／
m2
<10 10 20 40 80 100 200 400
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100级及 高于100
级
2~3 4 8 16 32 40 80 160
洁净度
1000 级
2 3 6 13 25 32 63 126
可监测到污染物对环境的综合影响，但不易精确反映 污染物的性质、浓度和数量。
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第一节 空气的卫生学检验
一、空气微生物来源 空气并非微生物的繁殖场所，空气中缺乏水分
和营养，紫外线的照射对微生物也有致死作用。 土壤中飞扬起来的灰尘； 水面吹起的水雾、人和动物体表干燥脱落的物
为d90mm，有用d100mm的。 评价空气的清洁程度，需要测定空气中
的微生物数量和空气污染微生物。测定 的细菌指标有细菌总数和绿色链球菌， 在必要时则测病原微生物。
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(一)空气微生物的测定方法
1．固体法 固体法有平皿落菌法(沉降—平板法)、撞击
法(有缝隙采样器、筛板采样器、针孔采样 器)和过滤法。 (1)平皿落菌法：将营养琼脂培养基融化倒人 d90mm无菌平皿中制成平板。将它放在待 测点(通常设5个测点)，打开皿盖暴露于空 气5~10min，以待空气微生物降落在平板表 面上，盖好皿盖，置于培养箱中培养48h后 取出计菌落数，即为落菌数。
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10000 级
2 2 2 4 8 10 20 40
100000 级
2 2 2 2 2 3 6 13
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表2.3 浮游菌最小采样量
浮游菌上限浓度 ／个 ·m-2 ·min-1
10 5 1 0.5 0.1 0.05
计算最小采样量／m3
0.3 0.6 3 6 30 60
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3） 复发酵试验（完成试验）
将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接 入1倍乳糖培养液中，经37ºC培养24hr， 产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。
产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、 产气则记为阴性反应；
根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌 群的数量。
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