手性色谱分析..

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手手性性高高效效液液相相色色谱谱法法

**手手性性药药物物分分析析的的概概念念 **常常用用手手性性高高效效液液相相色色谱谱法法 手手性性衍衍生生化化试试剂剂法法 手手性性固固定定相相法法 手手性性流流动动相相添添加加法法

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手手性性的的概概念念：：一一种种镜镜像像反反射射的的对对称称性性

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手性分子：组成相同但空间结构上互成镜像的分子，称之为对映异构体。

分子结构中含有不对称碳原子是最常见的手性结构。

根据对偏振光的作用不同可分为R、S体，两者的等量混合物称之为消旋体。

OH COOH

H

CH

3

OH

COOH

H

CH

3

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Mirror Mirror

手手性性异异构构体体在在药药理理学学效效应应上上的的差差异异 ● Pfeiffer 规则：

● 对映异构体之间的生物活性存在着差异； ● 不同的对映体之间活性的差异是不同的；

当手性药物的有效剂量越低，即药效强度越高时，则对映体之间的药理作用的差别越大。

外消旋体和其两种单一对映体是不同的3种实体！ 5

对对映映体体与与生生物物大大分分子子的的三三点点作作用用

c a

b

d

a

b

d c

α

γβ

α

β

γ

手性分子的a 、b 、c 三个基团与受体分子的活性作用点、

、

结合，是高活性对映体（优映体）。

手性分子的a 、b 、c 三个基团中只有a 和b 与受体分子的活性作用点和结合，是低活性对映体（劣映体）。

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在未研究清楚两种单一对映体之间的生物学差异时，以消旋体给

药往往会影响药物质量，甚至会严重损害人体健康。

“反应停”(Thalidomide)作为人工合成药，当时投入使用时是两种

对映体的混合物。

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反应停：五十年恩怨

发展趋势：

劣映体本身或其代谢物产生毒副作用，不再使用外消旋体。外消旋体转换成单一对映体，不仅提高质量，还延长药物寿命。

如：氧氟沙星的左旋异构体活性更强，左旋氧氟沙星临床使用剂量是消旋体的一半。

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手性拆分（Chiral resolution）

●对映体除了偏振光的偏转方向不同外，其它理化性质完全相同，

因而分离难度大。

●手性色谱拆分方法：创造（或引入）手性环境，构造非对映异构

体，使药物对映体间呈现理化特性的差异，从而实现药物对映体的色谱分离。.

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组成相同但空间结构上互成镜像的分子，称之为对映异构体；不成镜像的分子，称之为非对映异构体，分子中所含手性碳越多，非对映异构体的数目越多.

非对映异构体

对映体

对映体

（- ）盐酸伪麻黄

（-）麻黄碱（+）麻黄碱

（+ ）伪麻黄碱（- ）伪麻黄碱

13 H

OH

CH

3

H

CH

3

.H Cl

色谱条件：色谱柱：苯基柱150mm×4.6mm，I.D. 5mm；流动相：三乙胺-水（含50mmol·L-1磷酸二氢钾，磷酸调pH至4.0）-甲醇（0.01∶90∶10, v/v/v）；流速1.0 mL·min-1；检测波长：210nm；柱温：室温。

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手性高效液相色谱法（Chiral HPLC)

●手性衍生化试剂法（CDR）（分析物）

●手性固定相法（CSP）（固定相）

●手性流动相添加法（CMP）（流动相）

● 15

手性试剂衍生化法（CDR ） ● 原理：

光学活性药物与有高光学纯度的手性试剂于分离前衍生化，在药物对映体中引入另外一个手性，形成非对映异构体，再以HPLC 分析。

(R)SA (R)SE (R)SA

(R)SE (S)SA (R)SE (S)SA -→---⎧-+⎨

-→---⎩

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手性反应注意事项

● 手性试剂为高光学纯度试剂，光学稳定性好： ●

● 手性待测物必须具备反应活性基团，如胺基（-NH2），醇基（-OH ），羧基（-COOH ），以保证与CDR 反应完全 ；

● 生成的非对映体光学稳定，柱效要高，能有效检测。

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胺类对映异构体 ● 异硫氰酸酯（ITC ）

● 常用试剂有苯乙基异氰酸酯（PEIC ）、2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯（GITC ） 。

● 广泛应用于氨基酸及其衍生物、麻黄碱类、肾上腺素类、肾上腺素拮抗剂、儿茶胺类等药物的分离分析。 18

GITC 衍生化分离胺类对映异构体 ● 反应原理

C S N

R NHR R 1

R 2

2R 1

●在三乙胺存在条件下进行，于乙腈、二氯甲烷或DMF中进行。

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色谱分离和前处理条件优化

●流动相组成和流动相pH对拆分的影响

●（1）降低甲醇含量改善分离度，保留时间增加；

●（2）未衍生化的羧酸基对pH值比较敏感。

●衍生化时间及GITC用量的优化

●（1）反应时间：10 min ~ 30 min

（2）用量：过量两倍

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手性拆分结果

色谱条件：C18色谱柱，流动相：甲醇∶1%三乙基乙二氨四乙酸（TEAA 缓冲）（pH = 5.5），检测波长254 nm； 1 ml/min。

前处理：药物溶于含三乙胺乙腈水溶液，取50 μl该溶液，加入50 μl含2 g/L GITC的乙腈溶液，混合均匀后室温下放置10 min ~ 30 min，进样分析。

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拉贝洛尔的GITC衍生化