荧光光谱分析法PPT课件

1 nm
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第五章 荧光分析法
第一节 第二节 第三节
荧光分析法的基本原理 荧光定量分析方法 荧光分光光度计
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某些物质受到光照射，除吸收某种波长的光之外，发射出 比原来所吸收光的波长更长的光——光致发光（二级光）。
光致发光√
荧光 fluorescence
磷光 phosphorescence
荧光分析法是根据物质的荧光谱线的位置及其强度进
2008年诺贝尔化学奖.
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澳大利亚科学家最新发现 ，一种叫“螳螂虾”的海 里动物通过发出色彩鲜艳 的荧光来恐吓警告敌对者 或者吸引性配偶，
用荧光抗体染色之 原生动物
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green-fluorescent protein (GFP) K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306
实验所工作。他1962年从一种 对大脑造成的损害、观察有害细菌的
水母中发现了荧光蛋白，被誉为 生长，或是探究老鼠胚胎中的胰腺如
生物发光研究第一人。
何产生分泌胰岛素的β细胞。
马丁·沙尔菲马丁·沙尔菲出生于1947年，现年61岁，是美国哥伦比 亚大学生物学教授。他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧 光蛋白作为发光的遗传标签的作用，这一技术被广泛运用于生理 学和医学等领域。
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l4
l1
l2
l3
激发态→基态的能量传递途径√
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间跨越 内转移 外转移 振动弛豫
荧光：10-7～10-9s，第一激发单重态的最低振动能级→基态
瑞典皇家科学院8日宣布，美籍华裔科学家钱永健、美国生物学家 马丁·沙尔菲和日本有机化学家兼海洋生物学家下村修共同获得 2008年度诺贝尔化学奖，将均分1000万瑞典克朗（约合140万美元） 奖金。帮助他们获奖的是绿色荧光蛋白。这种蛋白为生物与医学实 验带来革命，它发出的荧光像一盏明灯，帮助研究人员照亮生命体 在分子层面和细胞层面的诸多反应。
由于绿色荧光蛋白用紫外线一照就
下村修现年80岁的下村修1928 发出鲜艳绿光，研究人员将绿色荧光
年出生于日本京都府，1960年 蛋白基因插入动物、细菌或其他细胞
获得名古屋大学理学博士学位后 的遗传信息之中，让其随着这些需要
赴美，先后在美国普林斯顿大学、 跟踪的细胞复制，可“照亮”不断长
波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物 大的癌症肿瘤、跟踪阿尔茨海默氏症
外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭”。
系间跨越：激发态的电子发生自旋反转而使分子的多重性发 生变化的非辐射跃迁。
禁阻跃迁，但当能层有较大重叠时S1T1 就可发生系间 跨越，通过自旋—轨道耦合进行。 10-6s
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态(T1 →S0跃迁)；发光速度很慢： 10-4~100s、磷光的能量比荧光小
行物质鉴定和含量测定的仪器方法。
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分子荧光分析的特点：
1. 灵敏度高：一般紫外一可见分光光度法的检出限 约为10-7g/ml，而荧光分析法的检出限可达到1010甚至10-12 g/ml。
2. 选择性好 3. 线性范围宽 4. 应用范围窄
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第一节
荧光分析法的基本原理
一、分子荧光
molecular fluorescence
电子被激发且伴随着自旋方向的改变
ms为+1/2和+1/2, s=1，M=3。则该分子所处的电子能态称为
激发三重态,用符号T表示。（T1 T2 T3…）
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小结：分子能级与跃迁 基态(S0)→激发态：吸收特定频率的辐射；量子化；跃迁 一次到位； 激发态→基态：多种途径和方式(见能级图)；速度最快、激 发态寿命最短的途径占优势，发生的几率大； 第一、第二、…电子激发单重态 S1 、S2… ； 第一、第二、…电子激发三重态 T1 、 T2 … ；
磷光：10-4～10s； 第一激发三重态的最低振动能级→基态
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辐射和非辐射能量传递过程√
振动弛豫：同一电子能级中，以热能量交换形式由高振动能 层至低相邻振动能层间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12s
内转换：相同多重态的电子能级间的等能级的无辐射跃迁。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回第一激
1. 分子荧光的产生
★分子能级比原子能级复杂 ★在分子体系中，每个电子能级上都存在振动、转动能级 ★室温下大多数分子处于基态的最低振动能层
★在基态时，含有偶数个电子的分子，电子的ms为+1/2和1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为基态单重态, 用符号S0表示
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分子吸收辐射后
S0
电子被激发且不发生自旋方向的改变 ms为+1/2和-1/2, s=0，M=1。则该分子所处的电子能态称为 激发单重态,用符号S表示。 （S1 S2 S3…）
电子能级的多重性 M=2S+1
平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应
单重态能级低；
大多数有机分子的基态处于单. 重态；
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小结：激发单重态与激发三重态的不同√
激发单重态分子中没有净电子自旋，因而具有反磁性；激
发三重态有2个自旋平行电子，是顺磁性的
激发单重态分子平均寿命短（10-8~10-6s），而激发三重态
发单重态的最低振动能级。发生内转换的时间10-13s。
荧光发射：电子由第Baidu Nhomakorabea激发单重态的最低振动能层→基态
( 荧光多为 S1→ S0跃迁)，发射波长为 l3的荧光，10-7~10-9s 。
发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长：
l3 > l 2 > l 1 ；
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外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质分子之间碰撞引起的 转移能量的非辐射跃迁。常发生在S1或 T1 S0
电子由S0进入T1的过程：（ S0 → T1禁阻跃迁） S0→激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 光照停止后，可持续一段时间
的长（10-4~10s）
基态单重态到激发单重态的激发，不涉及电子自旋方向的
改变而容易发生，属于允许跃迁；而到激发三重态属于禁阻
跃迁
S0→S1、S2 允许跃迁； S0→T1、T2 禁阻跃迁；通过其他途径进入 (见能级图)；进入的几率小；
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内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
量
吸 收