生化分析实验-圆盘电泳
生物化学实验3.血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳
（2）灌胶
用胶头滴管吸取分离胶溶液，沿管壁缓慢注入 胶液，至距离管口0.5-0.8cm。（注意：1.在加的
过程中不要混入空气，若有气泡，必须排除。2.灌胶完 毕后立即清洗胶头滴管和小烧杯。）
（3）水封
立即用胶头滴管沿管壁缓
慢加入蒸馏水（必须缓慢
细心，尽量减少胶液表面
的震动与混和），室温下
静置40min。
∝
Q r
蛋白质的两性电离
电场中移向阴极
静止
移向阳极
2.分子筛效应
❖ 相对分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过 一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同，而表现出 不同的迁移速度，这就是分子筛效应。
❖ 分子小，阻力小，移动快。
❖ 分子大，阻力大，移动慢。
比较：凝胶过滤层析中的分子筛效应？ 大分子移动快，小分子移动慢
5、固定
立即放到固定液中，10min
6、染色
染色液，60℃，10min
7、脱色
脱色液，60℃，10min
8、保存
较好的结果可加保存液密封保存
五、结果与分析
前清蛋白
+
-
清蛋白 α1 α2 β球蛋白
区带观察：1.排列顺序 2.区带宽窄 3.颜色深浅
γ球蛋白
六、注意事项
1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，对 皮肤有刺激作用，注意避免直接接触
电泳的分类
➢ 根据电泳系统是否连续分为： 连续电泳 不连续电泳
➢ 按电泳方向分类： 双向电泳 单向电泳 与层析结合的电泳
➢ 根据电泳物质类别不同分为： 细胞电泳 核酸电泳 蛋白质电泳等
一、实验目的
❖ 掌握聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳的基本 原理和方法。
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质.
实验七聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质一实验目的掌握聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳法分离血清蛋白质。
二实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰化胺凝胶作支持物的一种区带电泳，由于此种凝胶具有分子筛的性质，所以本法对样品的分离作用，不全决定于样品各组分所带净电荷的多少，即在电泳开始阶段，由于不连续pH梯度的作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构，很少带有离子的侧基，惰性好，电泳时，电渗作用小，几乎无吸附作用，对热稳定，呈透明状，易于观察结果。
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰化胺基侧链的脂肪族大分子化合物。
三实验器材1、血清及其他蛋白质样品。
2、移液器。
3、稳压直流电源（500V）。
4、玻璃管0 .5cm×7-10cm(×10)。
5、灯泡瓶。
6、注射器10ml(×1)。
7、滴管。
8、培养皿10cm(×5)。
9、圆盘电泳槽。
10、量瓶25ml（×1）、10ml（×1）。
四实验试剂1、1mol/LHCL。
2、丙烯酰胺（Acr）：3、N，N，N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED):密封避光保存.可用N-二甲氨基丙腈或三乙醇胺代替,但效果较差.4、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis):5、三羧甲基氨基甲烷(简称Tris).6、过硫酸铵(A.R)(聚合用催化剂)7、0.05％氨基黑10B溶液:称取50mg溶于100ml水中.8、冰醋酸.9、0.05％溴酚蓝溶液:称取50mg溴酚蓝加水溶解并定容到100ml10、40％蔗糖。
11、20％蔗糖-溴酚蓝溶液：100ml20％蔗糖溶液加50mg溴酚蓝12、甘氨酸-Tris 缓冲液：称取甘氨酸28.8mg，Tris 0.6g加水定容至1000ml （pH8.3）13、1％考马斯亮蓝G250。
丙种球蛋白的电泳制备(圆盘电泳)
• 实验室中常用到的电泳方法（以介质分类）
• 纸电泳 • 醋酸纤维膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 • 凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合， 并联结成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳 称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。 • 类型：垂直板电泳、圆盘电泳、等点聚焦电泳、双向电泳 等。（本实训中选择的是圆盘电泳） • 作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。 • 作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
制备丙种球蛋白的方法
• 丙种球蛋白的两种分离制备的方法 • 电泳法（如：聚丙烯酰胺凝胶电泳法） • 定义：利用溶液中带有不同量的电荷的阳离子或阴离子， 在外加电场中以不同的迁移速度向电极移动，而达到分离 目的的分析方法。 • 层析法（如：SephadexG-50) • 定义：是一种利用混合物中诸组分在两相间的分配原理以 获得分离的方法。
操作步骤
1.储备液配置 A液：取1mol/L HCl 48ml,Tris 36.6g,TEMED 0.24ml,混匀。用稀得 HCl调节pH至8.9，加去离子水至100ml.浑浊可过滤。 B液：取1mol/L HCl 24 ml,Tris 3.0g,TEMED 0.24ml，混匀。用稀得 HCl调节pH至6.7，加去离子水至50ml,浑浊可过滤。 C液：取Acr. 14.0 g,Bis. 0.37g,加去离子水溶解后定溶于50ml，过滤。 D液：取Acr. 14.0 g,Bis. 0.37 g,加去离子水溶解后定容至50ml,过滤。 E液：40%蔗糖。 F液：新配制的0.14%过硫酸铵。 以上储备液可以提前配制，冰箱保存备用。其中A、B、C、D液可 用2个月，F液可用一周。
聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质(核黄素-TEMED聚合系统)-1
聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质(核黄素-TEMED聚合系统)-1一、目的：1．学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
2．掌握聚丙烯酰胺园盘电泳的操作技术。
3．比较醋酸纤维薄膜电泳与本法分离血清蛋白质的效果。
二、原理：（一）盘状电泳原理盘状电泳是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2厘米），然后再进行电泳分离。
盘状电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质不连续性（discontinuity），凑巧分离出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”及“圆盘状”的英文字头“disc”。
因此，英文名称为disc electrophoresis，中文直译为盘状电泳。
仪器装置：（见图15-1）。
上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液。
上下槽的缓冲液中分别有正、负电极通入。
上槽底部有很多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃管。
这里仅以Davis和Orstein（1964）用分析血清蛋白的高pH的不连续系统为便说明其基本原理。
此系统是一个高pH的碱性系统，或称阴离子系统，最初用于分析血清蛋白，但也适用于其他的酸性和中性蛋白。
很多细胞蛋白质，或病毒的结构蛋白在此系统中（pH8—9）解离成阴离子，向阳极移动。
系统由下列三种不连续的凝胶组成。
即在每支玻璃管中装有三层不同的凝胶（见图15-2）。
最上层为样品胶，中层为浓缩胶（又称间隔胶或积层胶），下层为分离胶（又称电泳胶）。
在盘状电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。
由于这三种物理效应,使样品分离效果好，分辨率高。
例如人血清用纸电泳(PH8.6)可以分成5—7个成分，而用盘状电泳也可分成20—30个条带清晰的成分（参看图15-3）。
血清蛋白质聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳
醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维素薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜为支持物的电泳。醋酸纤维 素是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。具有色带清晰， 分辨率高；成本低廉，简介快速；样品用量少，灵敏度高，临床检验 应用广泛等优点。
Polyacrylamide gel electrophoresis
聚丙烯酰氨凝胶电泳
胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁移 率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要 取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚 基分子量的大小。 当蛋白质的分子量在15KD~200KD之 间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性 关系
• 当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳 迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列 方程： 1gMr =K―bmR 式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为 斜率；mR为相对迁移率。在条件一定时，b和K均 为常数。 若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分 子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋 白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移 率即可在标准曲线上求得分子量。
持物种类的不同
纸质电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳
2、根据电泳装置不同
薄膜电泳 垂直板电泳 平板电泳 垂直圆盘电泳
琼脂糖凝胶电泳
琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有 电荷，在电场力作用下能产生较强电渗作用，因此用于作为电泳支持 物。琼脂糖凝胶电泳具有：操作简单，电泳速度快，样品不需事先处 理就可进行电泳；电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好；可直接用于 紫外检测；易染色易洗脱等优点。尤其适合核酸的分离。
SDS
阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂 断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构
生物化学实验--聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质
聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质【目的】1 ．掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。
2 ．熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。
【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。
在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂过硫酸铵（ Ap ）和加速剂四甲基乙二胺（ TEMED ）的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。
根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 ％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质（见第 2 篇第 1 章），使样品分离效果好，分辨率较高。
一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ～ 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来（图 3-4 ），是目前较好的支持介质，应用十分广泛。
图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原理相同。
本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩（浓缩效应）成厚度为 10 -2 cm 的起始区带，然后再利用分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中进行电泳分离。
【器材】1 ．电泳仪直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 50mA 。
2 ．垂直管型圆盘电泳装置目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。
这类装置均由两个基本的部分组成，一部分为载胶玻璃管，须选用内径均匀（ 5 ～ 6mm ） , 外径 7 ～ 8mm ，长 80 ～ 100mm 的玻璃管作为材料，也可以使用更细的玻璃管。
生化实验报告电泳
生化实验报告电泳生化实验报告：电泳引言：生化实验是生物科学领域中重要的研究方法之一，其中电泳是一种常用的技术手段。
电泳通过电场的作用将带电的生物大分子（如DNA、蛋白质等）在凝胶或液体介质中进行分离和分析。
本报告将介绍电泳的原理、分类和应用，并结合实验结果进行讨论。
一、电泳原理电泳是利用电场对带电粒子进行分离的技术。
在电泳过程中，带电粒子会受到电场力的作用，从而在凝胶或液体介质中移动。
电泳的原理可以归纳为两个关键因素：电场力和摩擦力。
1.1 电场力电场力是电泳中最主要的驱动力之一。
当电场施加在带电粒子上时，粒子会受到电场力的作用而移动。
电场力的大小与电荷量和电场强度成正比，与粒子的大小和形状无关。
电泳中通常使用直流电场，以确保粒子在凝胶或液体介质中的移动方向一致。
1.2 摩擦力摩擦力是电泳中的阻力因素，它与带电粒子在介质中的移动速度成正比。
摩擦力的大小与粒子的大小和形状有关，较大的粒子会受到更大的摩擦力。
凝胶或液体介质的性质也会影响摩擦力的大小。
二、电泳分类根据不同的分离目标和实验条件，电泳可以分为几种不同的分类。
2.1 凝胶电泳凝胶电泳是最常见的电泳方法之一，通常用于分离DNA和蛋白质等生物大分子。
凝胶电泳中，凝胶作为介质，通过调节凝胶的浓度和孔隙大小，可以实现不同大小的分子的分离。
常见的凝胶电泳包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2.2 毛细管电泳毛细管电泳是利用毛细管作为分离通道的电泳方法。
毛细管具有极小的内径和高表面积，可以实现高效的分离。
毛细管电泳常用于分离离子和小分子化合物，如氨基酸、核苷酸等。
2.3 聚合物链反应（PCR）电泳PCR电泳是一种结合了聚合物链反应和凝胶电泳的技术。
PCR电泳用于检测和分离DNA片段，广泛应用于基因检测和疾病诊断等领域。
三、电泳应用电泳作为一种重要的生化实验技术，广泛应用于科学研究和生物医学领域。
3.1 DNA分析电泳在DNA分析中起着关键作用。
通过凝胶电泳，可以将DNA片段按照大小进行分离，从而确定DNA的长度和形态。
试验聚丙烯酰胺凝胶圆盘状电泳法分离血清蛋白
实验聚丙烯酰胺凝胶圆盘状电泳法分离血清蛋白Poly-acrylamide Gel electrophoresis(PAGE)聚丙烯酰胺凝胶机械强度好，透明且有弹性，化学性质比较稳定，受PH和温度的变化影响较小，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，几乎不产生吸附和电渗作用。
在制备凝胶时通过改变单体浓度和交联度，可以根据实验目的及样品分子特性,随意控制凝胶孔径大小，且制备的凝胶重复性好。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(Poly-acrylamide Gel electrophoresis, 简称PAGE)常用于蛋白质的分离鉴定，也可用于分离小分子核酸或核酸片段。
此外，由于聚丙烯酰胺凝胶纯度高及不溶性，不致污染样品，该法还适用于少量样品的制备。
本实验通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白,掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和操作技术。
一、[实验原理]聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（acrylamide ,简称Arc）和交联剂甲叉双丙烯酰胺(N,N＇-methylene bisacrylamide,简称Bis)在催化系统的作用下,聚合而成的具有三维网状立体结构的大分子物质。
本实验以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂，过硫酸胺(AP)为引发剂。
O —CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2—CH2=CH—C C=O CONH2NH NHCH2=CH—CONH2+ CH2CH2NH NHCH2=CH—C C=O CONH2O —CH2—CH—[CH2—CH]x—CH2—丙烯酰胺N,N’-甲叉（亚甲基）双丙烯酰胺聚丙烯酰胺一般情况下，凝胶的浓度大或交联度大，蛋白质迁移的速度慢，电泳时间长，反之迁移速度快，电泳时间短。
通常凝胶的筛孔透明度和弹性是随着凝胶浓度的增加而降低的，而机械强度却随着凝胶浓度的增加而增加。
聚丙烯胺凝胶电泳所以能把一个蛋白质混合物分离开来 , 除决定于被分离分子的大小和形状外 , 还决定于分子所带的电荷等因素本实验采用电泳基质的不连续体系，这种不连续的PAGE在电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应；②凝胶的分子筛效应；③一般电泳分离的电荷效应。
圆盘电泳
（二）琼脂糖凝胶电泳 天然琼脂是一种多聚糖的混合物，主要有琼脂糖 及琼脂胶组成。琼脂糖是由D-半乳糖和3,6-（脱 水）-L-半乳糖连接而成的线性多糖，不带电荷。 琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由 于这些基因带有电荷，在电场的作用下，能产生 较强的电渗现象.琼脂电泳可用于蛋白质和核酸的 分离，鉴定，尤其适合于核酸的分离，相对分子 质量的测定和分子构像的分析等。
（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺是有单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-甲叉 双丙烯酰胺在加速剂四甲基乙二胺（TEMED）和 AP 催化剂过硫酸铵（AP）的作用下聚合交联成的三 维网状结构的凝胶，其聚合物化学结构是如图所 示。聚丙烯酰胺凝胶富含酰胺基，具有稳定的亲 水性，几乎没有吸附及电渗作用，是理想的电泳 支持物。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰 胺凝胶电泳（PAGE）
1不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应， 分为连续系统与不连续系统两大类。连续 聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中，由于缓冲液 的PH值及凝胶浓度相同，带点颗粒在电场 的作用下，主要靠电荷及分子筛效应得到 分离；在不连续电泳体系中，由于缓冲液 离子成分，PH值和凝胶浓度的不连续性， 带电粒子在电场中泳动时不仅有电荷效应、 分子效应，还具有浓缩效应。
－
＋
结果
操作步骤
凝胶柱的准备 （ 1 ） 取一只 10cm × 0 . 6 cm 洁净 ﹑ 干燥的玻璃管 ， 一端 取一只10 cm× cm洁净 干燥的玻璃管， 洁净﹑ 用封口膜严实，垂直放好。 用封口膜严实，垂直放好。 （2）分离胶的制备 （3）浓缩胶的制备 加样（加样时， 加样（加样时，加样器吸头不可插入过 深，以免 刺破凝胶， 同时要缓慢﹑ 均匀， 刺破凝胶 ， 同时要缓慢 ﹑ 均匀 ， 避免搅动缓冲液引起样 品扩散） 品扩散） 电泳 剥胶 固定染色及漂洗
圆盘电泳操作步骤(最新2015.11.27)
圆盘电泳操作步骤1、制胶: ①将0.2ml 50％甘油加入橡皮帽中，再将橡皮帽套在小玻璃管下端。
②8%聚丙酰胺凝胶（PH 8.9, 分离胶）2013年下半年配方（成功）混匀后将此胶液加到各个小玻璃管中，使胶高6~7cm 。
用注射器加上一薄层水（0.3~0.5cm 高，约0.2ml ）覆盖，勿搅动胶面，放置20~30min, 观察现象（刚加水时看出有界面，后逐渐消失，等一定时间后又再出现界面，表明凝胶已聚合），记录聚合时间（TEMED 加量大，则聚合快，控制聚合时间在25~40min ，注意不能漏胶，否则重做）③浓缩胶（PH6.7）的配制混匀，从分离胶胶面上移去覆盖水后，速将浓缩胶加到分离胶上面，使胶高约0.5~1cm, 再小心加一层覆盖水（与上同），在阳光或日光灯下放置20~40min, 使聚胶作用完成，最后移去覆盖水。
２、安装凝胶玻璃管: 将小玻璃管一一安装在电泳仪上，注意垂直并应紧密，防止上槽的缓冲液漏下，向上下槽倒入电极缓冲液，缓冲液应淹没玻管上下端。
3、加样: 血清样品配制：取20ul 血清，加5ul 5x buffer ，混匀，点样时每管加入混合液25ul 。
4、电泳: 上槽连接负极，下槽连接正极，然后通电。
调完电流，前一分钟以每管1~2mA （为了平衡），以后以每管3~5mA 条件下电泳，直到溴酚蓝指示剂接近凝胶底部为止，断电（此过程约需２小时）。
5、剥胶: 将凝胶玻璃管从电泳槽上取下，用一支长针头注射器灌满水，将针头从浓缩胶一端小心地插入到管壁与凝胶之间，转动玻璃管，同时推动注射器，使针头在管壁与凝胶之间前进并注入蒸馏水，使胶条脱出（可用注射器吹）６、固定: 将剥出的胶条用7%乙酸固定20min.７、染色: 将固定后的胶条用染色液染色5~10min(10~20min)。
８、脱色: 将染色后的凝胶用水冲去表面的染料，然后放在洗脱液中冲洗，每30min 换一次洗脱液，直到近无色为止，约需１天。
实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理一聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE），由称盘状电泳。
这种电泳是在区带电泳的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2cm），然后再进行电泳分离。
圆盘电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质的不连续性（discontinuity），凑巧在垂直柱形凝胶上分散出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”和“圆盘状”的英文字头“disc”。
因此英文名称为“disc electrophoresis”，中文直译为盘状电泳。
仪器装置：如图A所示，上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液（图中曲线表示缓冲液面）。
上下槽的缓冲液分别有正负电极通入。
下槽外壳在必要时可通入冷水促使降温，水流方向用箭头表示。
上槽底部有许多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺的玻璃管。
图A在圆盘电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。
由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。
下面就圆盘电泳过程中的三种物理效应的原理加以说明：1. 样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。
（1）凝胶层的不连续性：浓缩胶：为大孔凝胶，有防止对流的作用。
分离胶：为小孔凝胶，也有防止对流的作用。
样品在其中进行电泳和分子筛分离。
蛋白质在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。
进入小孔凝胶时遇到的阻力大，速度就减慢了。
由于凝胶的不连续性，在大孔胶与小孔胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。
（2）缓冲离子成分的不连续性。
(3)电位梯度的不连续性。
(4)pH的不连续性：在浓缩胶和分离胶之间有pH的不连续性，浓缩胶应有的pH应为8.3，分离胶应有的pH为8.9。
圆盘电泳课件按改进版
圆盘电泳的应用领域
01
02
03
04
生物科学研究
用于蛋白质、核酸等生物大分 子的分离和纯化，如蛋白质组
学、基因组学等领域。
医学研究
用于疾病标志物的检测和鉴定 ，如血清蛋白组学、肿瘤标志
物检测等。
药物研发
用于药物筛选和鉴定，如抗体 药物、细胞因子等的分离和纯
化。
环境监测
用于水体、土壤等环境样品中 污染物的分离和鉴定，如重金
温度控制
保持电泳过程的恒温，以维持电泳的 稳定性和样品的分离效果。
缓冲液更换
定期更换电泳缓冲液，以避免因缓冲 液污染或失效导致的电泳结果异常。
避免气泡产生
在加样和电泳过程中，应避免产生气 泡，因为这会影响电泳的进行和样品 的分离效果。
常见问题及解决方案
条带模糊或不均匀
可能是由于电压或电流不稳定、缓冲液不纯或电 泳槽不干净等原因引起的。解决方案包括检查并 调整电压和电流设置，更换新的纯度高的缓冲液 ，以及清洗电泳槽。
改进后的缓冲液成分和新型分离介质有效 降低了背景噪音，提高了检测的灵敏度和 准确性。
缩短实验时间
减少误差
自动化操作系统减少了实验中的人为干预 和操作时间，使实验过程更加快速高效。
通过技术改进和创新，降低了实验中的人 为误差和随机误差，提高了实验的可重复 性和可靠性。
05
圆盘电泳技术的前景展望
自动化与智能化
页码等信息。
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THANK YOU FOR YOUR WATCHING
圆盘电泳课件（改进版
目录 CONTENTS
• 圆盘电泳技术概述 • 圆盘电泳实验操作流程 • 圆盘电泳实验注意事项与常见问题 • 圆盘电泳技术的改进与创新 • 圆盘电泳技术的前景展望 • 参考文献
实验七园盘电泳分离血清蛋白
图3一2 正常人血清醋酸纤维素薄膜电泳示意图 1为清蛋白；2，3，4，5分别为α 1-，α 2-，β -及γ -球蛋白；6为点样原点
此法由于操作简单快速、分辨率高及重复性好等优点， 目前已成为临床生化检验的常规操作之一。它不仅可用于 分离血清蛋白，还可用于分离脂蛋白、血红蛋白及同工酶 的分离测定。
光密度(O.D．520)
2.0
1.5
1.6
1.5
1.4
1.5
1.2
1.5
1.0
1.5
0.8 0.6
1.5 1.5
均在沸水浴中加热5min 立即用流动冷水冷却
21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5 21.5
将以上各管溶液混匀后，用分光光度计 (520nm)进行比色测定，用空白管溶液调零点， 记录光密度值，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度 为纵坐标，绘制出标准曲线。一大组同学做一个 标准曲线 （三）样品中含糖量的测定 取4支大试管，分别按表1—2加入各种试剂。
• Rf值的定义： • Rf =(原点到层析斑点中心的距离)/（原 点到溶剂前沿的距离）
• 影响Rf值的因素有： ①物质本身的化学结构； ②展层所用溶剂系统； ③展层剂pH值； ④展层时的温度； ⑤展层所用滤纸； ⑥展层的方向(横向，上行或下行)。 • 用纸层析鉴定样品时，一般都与标准 品相比较。若没有标准品，可选择文献 记载的该物质层析条件，根据文献Rf值 进行鉴定。
3．层析
将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面向里， 点样点位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤 纸两边接触(见图1)。 将培养皿中放入2／3量的展层剂，放入层 析缸中，然后将滤纸直立于层析缸的培养皿中， 样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品 点，开始层析。 当溶剂前沿到达离上端2 cm处，取出滤纸， 用铅笔描出溶剂前沿，晾干。
实验四 圆盘电泳
封口防漏 配液防凝
•
•
操作防毒
滴管灌胶 封口胶
6%分离胶的制备（每组四人）
A液 C液 H液 G液
1ml 2ml 2ml 5ml
混匀后分装 4管
正丁醇 封顶 等待聚合（约30分钟）
3%浓缩胶的制备（每组四人）
B液 D液 E液 F液
1ml 2ml 1ml 4ml
混匀后分装 4管
标准曲线
标准液编号 1 2 3 4 蛋白质浓度（mg/ml） 0 0.125 0.250 0.375 OD280 0 0.075 0.138 0.212
5
6 7
0.500
0.625 0.750
0.276
0.351 0.412
8
1.000
0.554
【方法评价】
操作简便、样品溶液可回收，同时可估计核酸含量。 但核酸含量小于20％或溶液混浊、则测定结果误差较 大。 公式计算时也应注意各种蛋白质和各种核酸在280nm 及260nm处的光吸收值也不尽相同，不同蛋白质中的 酪氨酸和色氨酸含量有差异，故计算结果有一定误差。 如果设定标准管，则应与测定管的蛋白质氨基酸组成 应相似，以减小误差。
（浓度为6%，每组总体积为10ml，灌胶高度为7~8cm）
封正丁醇
（手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时间掌握15min）
浓缩胶配制（浓度为3%，光聚合，每组总体积为
8ml，灌胶高度为1.5cm,留1cm空加样）
倒掉正丁醇 灌浓缩胶 封正丁醇（观察界面，判断凝固时间）
安装电泳槽（结构、原理、电流及电极的方向、
（三）、实验结果的分析
相关理论
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聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳（左）和圆盘电泳（右）示意图
它们各有什么不同，各自的优缺点是什么？
垂直平板： 1、多个样品在同一块凝胶上，电泳条件一致－－便于利用各种鉴定 方法，直接比较各种样品区带，保证结果的准确可靠 2、可以进行双向电泳 3、电泳时热量容易消散，凝胶结果便于照相和易于制成干胶 圆盘电泳： 1、缺点是由于聚合效应，凝胶的长度和直径有细微差别，即使同一 样品在两个凝胶柱上以同样的条件电泳，其结果也会不同 2、但是研究工作中还会用到圆盘电泳，例如 测定放射性标记的样品 测定蛋白质的生物活性；测定蛋白质分离的最适pH，凝胶浓度； 双向电泳中第一相的分离。
实验六 聚丙烯酰胺凝胶 圆盘电 泳分离蛋白质
1. 简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的原理，如何调节
凝胶的孔径? 2. 为什么样品会在浓缩胶中被压缩成层？ 3. 为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的40％蔗 糖溶液？蔗糖及溴酚蓝各有何用途？ 4. 上下两槽电泳缓冲液电泳后，能否混合存放？ 为什么？ 5. 根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯 酰胺垂直板电泳？哪些是关键步骤？ 6. 如何除去凝胶中过量的AP？未反应的单体如 何除去？
10、绘图： 、绘图： 最后根据染色所出现的带数和位置进行绘图， 以确定被分析样品的组分。另一种方法是通 过密度扫描仪扫出各组分的峰形位置，这样 不仅，可参考教课书）。
注意事项
Acr和Bis有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等 吸收，故操作时要注意保护。 没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近， 没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近， 实验中全部的胶统一放到指定的容器中， 实验中全部的胶统一放到指定的容器中， 由专门的人收集到一起，统一处理。 由专门的人收集到一起，统一处理。 各种废液请集中在指定的容器中（ 各种废液请集中在指定的容器中（第一组 的水池边的桶） 的水池边的桶）
友情提示: 友情提示:
分 离 胶: 浓 缩 胶: 上 样 量: 稳 压: 7.0 CM 1.5 CM 10 ul 300 V 1:30 小时
电泳时间: 电泳时间:
染色时间: 染色时间: 30 分钟 大家在等凝胶聚合的时候，可以观察和记录上次垂直平板电 泳的结果。
讨论题
1、在利用预电泳除去未反应完全的单体时，在 不连续电泳体系中，预电泳只能在分离胶聚 合后进行，洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓 缩胶制备后，不能进行预电泳， 为什么？
7、取出玻管内的凝胶： 、取出玻管内的凝胶： 8、凝胶染色 、凝胶染色： 将取出的凝胶柱，放入一合适干净的培养皿 内，然后加入适量染色液，于摇床上进行振 摇染色 分钟 染色30分钟 染色 分钟，完毕，回收染色液，用清水 洗凝胶柱2-3遍。在染色的同时，凝胶中蛋白 质区带亦被固定。
9、凝胶脱色： 、凝胶脱色 在培养皿（或试管）内加入适量脱色液于摇 床上进行振摇（2小时/次，需3次）脱色多次 直至色带完全清晰为止。
图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面) (1)样品胶pH6.9 (2)浓缩胶pH6.9 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3
三、试剂的配制： 试剂的配制： 1、电极 的配制：每排派一个同学配一 、电极Buffer的配制 的配制 份 2、样品溶液，染色液都已由实验室的老师配 好了。 3、脱色液可在电泳的时候配制 脱色液可在电泳的时候配制
5、接通电源： 、接通电源： 接通电泳槽的两端电极与电泳仪的电源，上槽 上槽电极 上槽 接负极，下槽电极接正极，稳压300V电泳开始时， 负极， 负极 下槽电极接正极， 电流应由小逐步加大至额定值。这时的电流大约每 管3.0-5.0 mA 电流，直至指示剂前沿到达凝胶管底 部约0.5 cm处，（大约需时2小时），停止电泳。 小时） 处 小时 确定电泳结束时，不应将溴酚兰跑出凝胶管，以防 止标准分子量中的最低分子量蛋白质也跑出凝胶管。
）、浓缩胶 贮液的配制： （2）、浓缩胶 ）、浓缩胶[2.5%]贮液的配制 贮液的配制 E： 称取Tris. 0.958 g；加1.0 mol/L HCL 4.8 ml； ： TEMED 200 µl ；最后加蒸馏水至10. 0 ml ；pH6.9 即可。 (TEMED最后在浓缩胶的混合液中加20 µl ） F： 分别称取Acr 1.0 g；Bis 0.25 g；加蒸馏水至10. ： 0 ml溶解、混匀即可。 G： 称取蔗糖4.0 g；加蒸馏水至10. 0 ml溶解、混匀 ： 即可。 H： 称取过硫酸铵(AP) 0.028 g；加蒸馏水至10. 0 ml ： 溶解、混匀即可。 分别取： 分别取：E ：F ：G ：H = 0.5ml ：1.0ml ：0.5ml ： 2.0ml （4.0 ml） ）
凝胶的配制： 四、凝胶的配制： ）、分离胶 贮液的配制： （1）、分离胶 ）、分离胶[7.5%]贮液的配制： 贮液的配制 A： 称取Tris. 3.7 g；加1.0 mol/L HCL 4.8 ml； ： TEMED 100 µ l ；最后加蒸馏水至10ml； pH8.9即 可。(TEMED最后在分离胶的混合液中加10 µl） B： 分别称取Acr 3.0 g；Bis 0.08 g；加蒸馏水至10. ： 0 ml溶解、混匀即可。 C： 称取过硫酸铵(AP) 0.028 g；加蒸馏水至10. 0 ml ： 溶解、混匀即可。 D： 蒸馏水 ： 分别取： 分别取：A ：B ：C ：D = 1.0ml ：2.0ml ：4.0ml ： 1.0ml （8.0 ml） ）
一、目的要求
1.学习聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳原理和技术 2.学习和掌握圆盘电泳分离蛋白质技术
二、原理
聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳和垂直平板电泳具 有相同的原理。 有相同的原理。
不连续： 凝胶孔径不连续性；缓冲体系离子成分及pH值的不连 续性；电位梯度的不连续性： 三种效应： 样品浓缩效应；分子筛效应；电荷效应
五、操作步骤 1、分离胶的制备 、分离胶的制备： （1）、将清洁、无破碎干燥的小玻管一端（同学们 将 应该挑选一下比较平的那头），用胶布贴封后，朝 下垂直放入有机玻璃凝胶玻管架的孔中，并在小玻 管的7.0 cm处作一记号。 （2）、用自动取液器吸取上述配好的分离 分离凝胶贮液 用 分离 沿着小玻管内壁小心准确加入7.0 cm高。 7.0 cm高 （3）、凝胶溶液加毕后，随即吸取蒸馏水，加至管 凝 中的凝胶表面，使其表面覆盖一水层（水封， 1.0cm 高）。在灌胶和封水的过程中，操作要轻， 以避免产生气泡。 （4）、将加注好的凝胶管于室温下静置，以进行聚 合反应，在正常情况下大约30-60分钟后，待界面 出现明显分层现象时，表明胶已聚合完毕，即可加 浓缩胶。
6、练习取出玻管内的凝胶： 、练习取出玻管内的凝胶： 将一支带有长针头的注射器吸有适量水（蒸馏水或 自来水），把针头慢慢插入玻管内壁和凝胶柱表面 之间，一边开始压水，一边同时使针头慢慢贴紧管 壁呈螺旋式前进，如果一端不行，再在管的另一端 按同样的方法剥离，这样依靠水流的压力和滑润力， 使玻管内壁与凝胶分离，最后用洗耳球在管的一端 轻轻挤压，另一端对着一干净大小适宜的培养皿内， 此时可以将凝胶柱压出玻管。
讨论题
2、电解液中的离子强度有什么影响？如含大量 盐类时，可不可以直接上样电泳 ？为什么？
讨论题
3、实验的上样量是多少，绝对量是多少？可 不可以增加上样量，或者说我们的合适上样 量是多少？
本次实验做到分离胶和浓缩胶都凝聚后，然 后练习取出凝胶。剩余的分离胶和浓缩胶的 贮液放到冰箱保存留待下次实验用。
2、浓缩胶的制备： 、浓缩胶的制备： （1）、轻轻倒掉分离胶玻管上端的液体，并用 吸水纸吸去未倒净的液体（但不能触及胶面） 然后先小心用浓缩胶贮液洗涤凝胶表面1-2次， 再小心加入该浓缩胶贮液1.5 cm高。 （2）、随后同样加1.0cm高的蒸馏水层覆盖胶 表面。大约也在20-40分钟后，待浓缩胶出现 乳白色时，表明胶已聚合完毕。
3、加样： 、加样： 取一根上次做好的凝胶小玻管用吸水纸轻轻 吸去浓缩胶表面上的水层，然后用微量注射 器加10ul测试样品溶液。
4、装置凝胶管： 、装置凝胶管： 将加好样品的凝胶管的加样端（上端），插 入上电泳槽孔中，然后将已插满凝胶管的上 电泳槽放入加有电极溶液的下电泳槽内。此 时凝胶玻管下端管口易产生气泡，可通过轻 轻摆动凝胶玻管以去除气泡，插入上电泳槽 的玻管上端，用滴管轻轻滴满电极溶液，以 免产生气泡，最后将上电泳槽装满电极液。