干细胞培养

造血干细胞的特性与应用

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xx大学生命科学学院，2010生物科学

摘要：

关键词：

造血干细胞；生物学特性；应用

1造血干细胞的来源

胚胎造血与出生后的较单一、固定的骨髓造血不同，它伴随着生长发育而不断变换造血部位。一般认为，随着胚胎发育过程中造血中心的转移，其造血过程相继分为三个阶段，即胚胎外造血期——卵黄囊造血期（人胚第13~16天）、胎肝造血期（人胚第6周至第5个月）和骨髓造血期（胚胎第四4个月开始至终生）。但有学者认为成体造血干细胞来源于胚胎的背主动脉区，因为能够重建成体各系造血的造血干细胞最早出现在鼠胚第10天的主动脉-性腺-中肾（AGM）区。

而卵黄囊只是一种一过性的造血组织，不是胚胎发育过程中的第一个造血中心。至于骨髓造血干细胞，有人认为其来源于胎肝造血干细胞的迁移，也有人认为其来源于上述的AGM区，目前尚无定论。

2造血干细胞的特性与鉴定

2.1造血干细胞的生物学特性

2.1.1造血干细胞的活化

1986年Lemischka等通过对移植小鼠血液细胞DNA分析所做的克隆研究发现，在小鼠接受移植后的造血恢复期，植入的造血干细胞不是被平均使用，一部分克隆逐渐消退;以移植小鼠的骨髓做二次移植后，二次移植的小鼠造血由在

一次移植中与造血无关的另一部分克隆来维持。结果提示，造血干细胞并非全部处于增殖分化周期中。一般情况下，大部分造血干细胞处于静止期，在必要时才进入细胞周期进行细胞分裂。造血干细胞分裂后，其子代细胞一个通过自我复制维持造血干细胞的特性，另一个则通过分化成为多能性造血祖细胞。造血干细胞的活化机制尚不明确，但至少其中一个机制是通过各种细胞因子来调节。人们推测，造血干细胞的活化，需要多种刺激因子的协同作用。在细胞刺激因子之外，细胞抑制因子也能调节造血干细胞的活化。

2.1.2造血干细胞的自我更新

造血干细胞最为基本的生物学特征是其具有高度的自我更新能力(Self-re-newal)，即它能通过自我复制方式使子代细胞与亲代细胞具有完全相同的特征。造血干细胞的这种高度的自我更新能力，在维持机体一生的造血过程中具有重要意义。因为，造血干细胞如果不能通过自我复制进行自我更新，随细胞的增殖分化成熟，干细胞池即会被耗尽而导致难以维持造血。大量研究证实，造血干细胞经分裂后其子代细胞基本上能够保持与亲代细胞完全相同的特性。但也有学者认为，即使是造血干细胞，只要行分裂，从严格的意义上来讲，就不存在完全的自我复制，而已进入了分化阶段。造血干细胞是否确实能够进行完全的自我复制，尚存争议。但具有长期体内外造血重建能力这一特征是造血干细胞所必备的。

2.1.3造血干细胞的多向分化

通过放射线照射，诱导细胞产生染色体异常，然后将具有这种染色体异常的造血干细胞移植给小鼠，在小鼠体内可以看到含淋巴细胞在内的所有血液细胞均具有相同的染色体异常，说明造血干细胞可以形成含淋巴细胞在内的各种血液细胞。现已明确，造血干细胞向成熟细胞分化过程中受到多种正负造血因子的作用，形成一种较为复杂的调控网络。在综合因素作用下，造血干细胞可以分化形成红系、髓系、巨核系成熟血液细胞，也是淋巴系干细胞的来源。除造血系细胞外，近年还发现造血干细胞可以分化形成一些非造血细胞，如破骨细胞、表皮生发层细胞等。新近在一例作异性间骨髓移植后的病人，发现受者肝细胞具有供者的染色体核型，提示其来源于供者的造血干细胞。

而近

2、3年，循环内皮细胞与造血干细胞的关系一直是研究热点。

因此，造血干细胞的这种多向分化能力亦不容质疑。有关造血干细胞分化能力的研究，相信在近年会有新的发现。

2.1.4造血干细胞的表面标记

迄今为止，真正的造血干细胞表型尚难以确定，其原因可能在于这些造血干细胞是最为原始的细胞，大多抗原为阴性表达;同时，造血干细胞的数量极为稀少，难以分离到足够的造血干细胞进行研究。

在小鼠的造血干细胞上不存在T细胞、B细胞、单核系、粒系及幼红系等的分化抗原，如Mac-

1、C

D4、C

D8、TER119等，这些抗原可作为小鼠造血干细胞的阴性标志，而T细胞相关抗原Thy-1在小鼠造血干细胞有弱表达，现已将Thy-1弱阳性做为小鼠造血干细胞的标志。

此外，也常以干细胞因子的受体c-kit等作为小鼠造血干细胞的阳性标志。小鼠的造血干细胞与人不同，常不表达或微弱表达CD34抗原。

而在人类，通过异种移植等大量研究已经证实，CD34阳性细胞群具有长期造血重建能力，推测绝大部分造血干细胞应为CD34阳性。由于CD34抗原在造血祖细胞上也有表达，故常以一些在干细胞为阴性表达的抗原，如HLA-DR、

CD38、CD33等，对CD34阳性细胞群进行再分类，以识别出其中的造血干细胞。有报道认为，CD45RO，c-kit等也可作为造血干细胞的阳性标志。目前，普遍认为人造血干细胞的表型为CD34+CD38-Lin-

、HLA-、DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、Rhodull，这可能是人类认识到的最为早期的造血细胞。不过，近年也有报道认为，CD34阴性细胞可能为更为原始的造血干细胞，因为在CD34-细胞群中也发现具有重建长期造血能力的细胞，因此，人类真正造血干细胞的表型在目前阶段尚无定论。

2.2造血干细胞的检测方法

2.2.1脾xx形成法

该方法是人类认识造血干细胞最早的方法，主要用于评估小鼠的造血干细胞。将小鼠的骨髓或脾细胞注射到经放射线照射过的小鼠体内，通过观察CFU-S 的数量和种类来推知造血干细胞。这种方法不能用于测量人类造血干细胞，仅适合于有关小鼠造血调控的实验研究。

2.2.2外xx形成法

将造血细胞注入到半固体培养基中，在一定条件下培养一段时间后，根据克隆形成的数量、克隆细胞的构成来分析克隆的起源和克隆形成细胞的性质，即称为体外克隆形成法。向培养基中加入各种造血生长因子，不论在人还是在小鼠均可培养出含有各类血液细胞的混合集落(CFU-MIX、CFU-GEMM)，常常以其数量代表造血干细胞。但现在认为，形成混合集落的细胞大部分为多潜能造血祖细胞而不是造血干细胞。造血干细胞移植时常用CFU-GM计数作为植入干细胞数的一个标准，它代表的是粒-单祖细胞的数量。因此，现将它作为造血祖细胞的一种检测方法。

原始细胞集落形成细胞(CFU-blast)是目前在体外所能鉴别出的最未分化的克隆形成细胞。这种集落是由未分化的原始细胞组成。二次集落试验证实它可形成较多的原始细胞集落和混合集落，同时，这种细胞还具有向淋巴细胞分化的能力，因此，人们推测这种细胞非常接近于造血干细胞。人类的这种集落培养条件相当苛刻，一般多用于小鼠的造血细胞研究。

2.2.3长期培养启动细胞检测法

将造血细胞放在骨髓基质上培养，在最初1~2周可发现有克隆形成细胞(CFC)的增殖，其后逐渐消失，这些细胞一般认为其来源于造血祖细胞。但培养5周以后，在培养细胞中仍有CFC细胞的存在，它们则来源于更为早期的未分化造血细胞，被称为长期培养启动细胞(long-term culture-initiaing cell，LTC-IC)。LTC-IC的定量可以采用极限稀释培养法来测定，此法常用于测定人类的造血干细胞。据报道，在105个骨髓单个核细胞中，以LTC-IC分析法所示的原始干细胞约为10个左右。