基因工程工程菌构建整理.ppt
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基因工程-PPT课件
干扰素 1200 升人血 2－3 万美元 / 病人
1 升发酵液 200－300 美元 / 病人
国外生物医药的发展
➢1976年第一家基因工程技术开发药物的公司建立。 ➢1982年第一个基因工程药物重组人胰岛素正式生产，推向市场。 ➢2019年全球生物技术公司总数已达4284家，美国占34％。 ➢2019年基因重组生物技术药物的年销售额已经突破400亿美元。 ➢2019年市场上的生物技术药物达到200种左右，而在研的药物为600种。 ➢全世界已有2.5亿人使用生物技术药物和疫苗。
• 曼哈顿计划 • 阿波罗计划
20世纪科学史上3个里程碑
HGP的意义
• 了解生命的起源与进化 – 认识种属之间和个体之间存在差异的起因 – 五种“模式生物” 基因组的研究：大肠杆菌、酵母、 线虫、果蝇和小鼠
• 解码生命，认识自身 – 了解生命体生长发育的规律
• 认识疾病产生的机制，掌握生老病死规律 – 疾病的诊断和治疗
甜椒在栽培的过 程中，容易受病毒的 感染。我国科学工作 者，采用转基因技术， 培育出抗病毒的甜椒。
油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜 籽的含油量约为40％左右。通过转基因技术，培育 出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且 油的纯度质量更好。
玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以 用作食品和工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称 它是含金的植物。如今培育出转基因玉米，品质更好， 产量更高。
淋巴细胞ADA酶恢复至正常水平的5%-10% 维持免疫系统功能,改善病人症状
遗传缺陷病人
腺病毒 adenovirus
修正基因
插入修正基因
感染病人細胞
取出病人細胞
修正基因转入到患者体内
注射修正基因
基因工程工程菌构建.ppt
1，3-丙二醇用途
• 可直接用于防冻剂，是多种增塑剂、洗涤剂、防 腐剂和乳化剂的合成原料；也广泛应用于食品、 化妆品和制药等行业14j。
• 1，3．丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯PTT 的原料。PTT纤维克服了PET纤从而引起纤维材 料界的瞩目，可用于生产地毯、短丝及长丝产品， 产薄膜、非织造布和单丝，用作热塑性工程塑料
1，3-丙二醇基因工程菌构建的预期目标
• 本研究首先利用PCR方法从大肠杆菌中克 隆1．16 kb的1，3．丙二醇氧化还原酶同 工酶的编码基因yqhD2．80kb来源于克雷 伯氏杆菌甘油脱水酶的编码基因dhaB构建 了重组菌 i JM109(pEtac—dhaB—tacyqhD) 构建重组载体pUC．tac．dhaT，并 在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac． dhaB．tac-yqhD和pUC．tac-dhaT，研究 为提高1，3．丙二醇产量提供了新途径。
6000 r／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液 。
（7)加入750此漂洗液于离心吸附柱中，静置1 min后，6000r／min离心30s。倒掉废液收集管 中的废液。重复一次。倒掉废液后。再次于6000 r／min离心2min，尽量除去漂洗缓冲液。 (8)小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的1 ．5 mLEppendorf离心管中，加入适量洗脱缓冲 液，常规50此，室温放置2．5min后，6000 r／ min离心2min。 (9)取5“L酶切后电泳鉴定。
（一）、质粒DNA的提取
(1)接重组大肠杆菌一环于LB培养基中，振荡培 养过夜。
(2)取1．5mL菌液于Eppendorf管中，6000r／ min离心5 min。 (3)弃去上清，加入溶液I 100“L重悬菌体。 (4)加入溶液II 150“L，轻柔混匀。 (5)加入溶液III 150此，倒转混匀，8000 r／min ，离心10min。 (6)将420¨L结合缓冲液加入离心吸附柱中，然 后将步骤5中的上清加入离心吸附柱中混匀，
基因工程工程菌构建
实例二：某工程菌的应用效果
应用领域
01
用于生产某种药物或工业酶。
应用效果
02
通过工程菌的构建和优化，实现了目标产物的高效表达和纯化
，降低了生产成本，提高了产品质量和产量。
经济效益
03
工程菌的应用为企业带来了显著的经济效益，推动了相关产业
的发展。
实例三：某工程菌的改进与优化
改进目标
提高工程菌的生长速度、产物表达量或产物纯度等。
基因工程工程菌构建
汇报人：XX
目 录
• 引言 • 基因工程原理与技术 • 工程菌构建流程 • 工程菌构建实例分析 • 工程菌构建的挑战与解决方案 • 工程菌在生物医药领域的应用前景
01
引言
基因工程概述
基因工程定义
基因工程是通过对生物体基因进行改造和重组， 以实现特定目标的方法和技术。
常用技术
包括基因克隆、基因编辑、基因转移等。
抗体药物研发
通过基因工程技术改造工程菌，实现抗体药物的高效表达和纯化。
疫苗研发与生产
利用工程菌生产疫苗，如基因工程疫苗、重组亚单位疫苗等，提高 疫苗的安全性和有效性。
基因治疗与细胞治疗
基因治疗载体
工程菌可作为基因治疗的载体，将治疗基因导入患者体内 ，修复或替换缺陷基因。
细胞治疗辅助工具
利用工程菌生产细胞治疗所需的生长因子、细胞因子等， 促进细胞生长和分化。
通过代谢工程手段，改造工程菌的代 谢途径，提高其对底物的利用效率和 产物合成能力。
提高遗传稳定性
采用合适的基因整合方法，确保外源 基因在工程菌中的稳定遗传和表达。
03
工程菌构建流程
目标基因的选择与获取
选择目标基因
【微生物工程】第八章_基因工程菌的培养ppt课件
细胞进一步的 生长，或得到更多的代谢产物
基因工程菌培育方式
补料分批培育 补料分批培育是将种子接入发酵反响器中进展培育，经过一段时间，
间歇或延续地补加新颖培育基，使菌体进一步生长的培育方法。 在分批培育中，为坚持基因工程菌生长所需的良好微环境，延伸其生
长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来， 根据基因工程菌的生长规律来调理补料的流加速率。
基因工程菌培育方式
延续培育 延续培育是将种子接入发酵反响器中，搅拌培育至菌体浓度到达一定程
度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进展不延续培育。 延续培育可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研
讨基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境要素对基因表达的影响等 发明了良好的条件。
但是由于基因工程菌的不稳定性，延续培育比较困难。为理处理这一问 题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进展两阶段延续培育。 在这样的系统中关键的控制参数是诱导程度、稀释率和细胞比生长速率。优 化这三个参数以保证在第一阶段培育时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获 得最高表达程度或最大产率。
提高基因工程菌稳定性的战略
施加选择压力
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
生素
根据载体上的抗药性标志，向培育系统中添加相应的抗
药物和食品消费时制止运用抗生素
参与大量的抗生素会使消费本钱添加
添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的战略 分阶段控制培育 因外源基因表达呵斥质粒不稳定时，可以思索将发酵过程
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的的产活力制 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降
基因工程菌培育方式
补料分批培育 补料分批培育是将种子接入发酵反响器中进展培育，经过一段时间，
间歇或延续地补加新颖培育基，使菌体进一步生长的培育方法。 在分批培育中，为坚持基因工程菌生长所需的良好微环境，延伸其生
长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结合起来， 根据基因工程菌的生长规律来调理补料的流加速率。
基因工程菌培育方式
延续培育 延续培育是将种子接入发酵反响器中，搅拌培育至菌体浓度到达一定程
度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进展不延续培育。 延续培育可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率，为研
讨基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境要素对基因表达的影响等 发明了良好的条件。
但是由于基因工程菌的不稳定性，延续培育比较困难。为理处理这一问 题，人们将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开，进展两阶段延续培育。 在这样的系统中关键的控制参数是诱导程度、稀释率和细胞比生长速率。优 化这三个参数以保证在第一阶段培育时质粒稳定，菌体进入第二阶段后可获 得最高表达程度或最大产率。
提高基因工程菌稳定性的战略
施加选择压力
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
生素
根据载体上的抗药性标志，向培育系统中添加相应的抗
药物和食品消费时制止运用抗生素
参与大量的抗生素会使消费本钱添加
添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间
提高质粒稳定性的方法
提高基因工程菌稳定性的战略 分阶段控制培育 因外源基因表达呵斥质粒不稳定时，可以思索将发酵过程
基因工程菌的稳定性
基因工程菌的遗传不稳定性的的产活力制 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降
第11章基因工程-PowerPoint演示文稿
（一） 质粒
◆质粒(plasmid)是细菌染色体外存在的一种 能够自我复制的双链闭合环状DNA分子，大 小1kb～200kb。
质粒常常带有一些特殊的基因，如致死基因，抗 抗生素的基因等等。 一般质粒都含有一个复制起始区，可独立复制。 质粒DNA复制与宿主之间的关系，可分为“严谨 型”和“松弛型”。“严谨型”质粒在每个细胞中 的拷贝数通常1~3个，而“松弛型” 通常在10个以 上，可高达200个拷贝。
◆通常是将cDNA库与核基因库配合使用， 以便既能得到基因的编码序列，又可得到基 因的调控序列。
2 筛选基因库
◆从基因库中筛选、分离基因，可据对待选 基因相关信息的了解程度，确定筛选方法和 条件。
◆常用方法是利用一段核苷酸序列(DNA， cDNA或寡核苷酸)作探针(probe)，用放射性 同位素或非放射性同位素标记探针，也可用 抗体作探针，筛选基因库。性： 只切割双链DNA分子，不切单链DNA； 每种酶有其特定的核苷酸序列识别特异性； 需要镁离子激活等。
（一）限制性内切核酸酶
★限制酶可分为3类。
Ⅰ型酶：只有EcoB和EcoK两种，具有催化限制性 切割和修饰核苷酸2种功能。 Ⅱ型酶：在遗传工程中应用最广泛。① 有特异识别 和切割的序列部位，被切割的DNA分子形成单链的断 裂；② 断裂的部位通常不是直接相对的，结果所形 成的DNA片段常具有碱基互补的单链尾巴（粘性末 端），使其能够重新连接； ③ 内切酶的切割和修饰 功能由两个不同的酶催化所完成。 Ⅲ型酶具有特异的识别位点，这种识别位点是非对 称的。
粘粒载体
与噬菌体载体和质粒载体相比具有多个优点：
具有cos位点，能高效地转化大肠杆菌，能在大肠 杆菌中实现自身环化，并能在大肠杆菌中复制； 有像质粒一样的选择标记； cosmid载体比较小，但能插入较大的外源片段，可 克隆外源片段的长度在15~45 kb之间。
最新第2节 基因工程菌构建的载体系统与工具ppt课件
2、天然载体质粒
天然载体质粒的第一个字母大写，且质粒符号用括号 括起来。 如（C01E1）。农杆菌质粒用p加Ti（Tumer inducing）或 At（Agrobacterium tumefacions）表示，如pTiC58。
（三）、常用质粒载体
1. pSC101
图
2. pBR322
（1）组成
可通过插入失活法进行筛选
含Ampr抗性基因，可通过插入失活和颜色反应进行双重筛选。
N端 C端
完整的β-半乳糖苷酶
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
（四）大肠杆菌中的表达载体
表达载体应含有：
（1）强启动子 （2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的SD 序列。 （3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转 录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳 定性。
（1） 有λ噬菌体的高效感染能力。 ⑵ 有质粒的高效复制特性。 ⑶ 有更广泛寄主。 ⑷ 有较大的容量。
３．主要用途：用于DNA 序列分析
四、酵母菌载体
多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为 2μ质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主 复制功能区域（ARS片段）。 根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、 附加型和稳定型等类型。 共同的特点：
（2）替换型载体
在其中央部位有一个可以被外源插入的DNA分子取代的 DNA片段的克隆载体 。这是由于构建此载体时，安排 在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列， 因此，当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA 片段便会被置换掉，从而有效提高了克隆外源DNA片段 的能力。
（二）M13噬菌体载体
E、琥珀突变抑制基因（Amber mutations
天然载体质粒的第一个字母大写，且质粒符号用括号 括起来。 如（C01E1）。农杆菌质粒用p加Ti（Tumer inducing）或 At（Agrobacterium tumefacions）表示，如pTiC58。
（三）、常用质粒载体
1. pSC101
图
2. pBR322
（1）组成
可通过插入失活法进行筛选
含Ampr抗性基因，可通过插入失活和颜色反应进行双重筛选。
N端 C端
完整的β-半乳糖苷酶
lacZ’
lacZ’
缺陷型大肠杆菌
（四）大肠杆菌中的表达载体
表达载体应含有：
（1）强启动子 （2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的SD 序列。 （3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转 录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳 定性。
（1） 有λ噬菌体的高效感染能力。 ⑵ 有质粒的高效复制特性。 ⑶ 有更广泛寄主。 ⑷ 有较大的容量。
３．主要用途：用于DNA 序列分析
四、酵母菌载体
多数酵母中含有一种能独立复制的环状双链DNA，称为 2μ质粒，长约6.3kb，有单一的复制起始点和一个自主 复制功能区域（ARS片段）。 根据质粒的复制方式不同将它们分为：整合型、复制型、 附加型和稳定型等类型。 共同的特点：
（2）替换型载体
在其中央部位有一个可以被外源插入的DNA分子取代的 DNA片段的克隆载体 。这是由于构建此载体时，安排 在中央可取代片段两侧的多克隆位点是反向重复序列， 因此，当外源DNA插入时，一对克隆位点之间的DNA 片段便会被置换掉，从而有效提高了克隆外源DNA片段 的能力。
（二）M13噬菌体载体
E、琥珀突变抑制基因（Amber mutations
第九章基因工程-PowerPoint演示文稿共41页
基因工程(genetic engineering）是指 采用人工方法将不同来源的DNA进行重 组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中 进行增殖或表达的过程。
重组DNA技术 重组DNA技术又称为基因工程（genetic
engineering）或分子克隆(molecular cloning)。 基因工程的操作过程主要由以 下步骤组成：
载体DNA与目的基因的连接
（二）人工接尾法： 即同聚物加尾连接
法。当载体和目的基因无法采用同一种 限制酶进行切断，无法得到相同得粘性 末端时，可采用此方法。 此法首先使用
单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端 核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核 苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如 载体上添加一段polyG，则可在目的基 因上添加一段polyC，故二者即可通过 碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连 接。
1．质粒： 是存在于天然细菌体内的一 种独立于细菌染色体之外的双链环状 DNA，具有独立复制的能力，通常带有 细菌的抗药基因。 最早使用的质粒DNA 是人工构建的pBR322，该质粒分子大 小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青 霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ， Hi知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（poly
二、载体和目的基因的切断来自 通常采用限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease)，简称 限制酶，分别对载体DNA和目的基因 进行切断，以便于重组。限制酶目前 已经发现400多种，所识别的顺序往 往为4-8个碱基对，且有回文结构。 由限制酶切断后的末端可形成平端、 3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端 三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因 的重组。
重组DNA技术 重组DNA技术又称为基因工程（genetic
engineering）或分子克隆(molecular cloning)。 基因工程的操作过程主要由以 下步骤组成：
载体DNA与目的基因的连接
（二）人工接尾法： 即同聚物加尾连接
法。当载体和目的基因无法采用同一种 限制酶进行切断，无法得到相同得粘性 末端时，可采用此方法。 此法首先使用
单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端 核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核 苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如 载体上添加一段polyG，则可在目的基 因上添加一段polyC，故二者即可通过 碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连 接。
1．质粒： 是存在于天然细菌体内的一 种独立于细菌染色体之外的双链环状 DNA，具有独立复制的能力，通常带有 细菌的抗药基因。 最早使用的质粒DNA 是人工构建的pBR322，该质粒分子大 小为4.3kb，带有抗四环素和抗氨苄青 霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ， Hi知目的基因两端的序列，则可采用聚合酶链反应（poly
二、载体和目的基因的切断来自 通常采用限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease)，简称 限制酶，分别对载体DNA和目的基因 进行切断，以便于重组。限制酶目前 已经发现400多种，所识别的顺序往 往为4-8个碱基对，且有回文结构。 由限制酶切断后的末端可形成平端、 3'-突出粘性末端和5'-突出粘性末端 三种情况。形成粘性末端(cohesive end)者较有利于载体DNA和目的基因 的重组。
基因工程工程菌构建ppt课件
最新版整理ppt
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2、通过正交实验分析法进一步优化了重组菌E coliJMl09(pEtac-dhaB．tac-yqhD， pUC—tac-dhaT)的发酵培养基，其适宜组成为：甘油20 g／L、VBl2 O．01 g／L、KH2P045 g／L、 M92+0．67 edL和酵母膏5∥L。最适发酵条件为：装液 量10％、接种量10％、转速150 r／min、接种后4d,时左右加入IPTG、IPTG终浓度为 lmmol／L。应用此培养基l，3．丙二醇 的产量为2．4329／L，
(3)在摇瓶水平，对已构最新建版整的理p产pt 1，3．丙二醇重组菌6
1，3．丙二醇生物合成途径
l，3一丙二醇是一种典型的甘油发酵产物,并 未发现其可由其他有机底物厌氧转化而来。甘 油作为唯一碳源和能源，它可以沿着氧化和还 原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类 发酵产物一致，并产牛供细胞牛长所必需的 ATP，在某些产物形成的同时释放还原力NADH ；还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力， 生成1，3一丙二醇 。
EcoliJM109(pEtac—dhaB—tac-yqhDDpUC—tac—
最新版整理ppt
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材料
菌株：重组菌Ecoli JMl09(pEtac．dhaB-tac-
yqhD，pUC—tac—dhaT)为本论文三中构建。
培养基和培养条件
LB培养基(∥L)：蛋白胨10，酵母膏5，氯化钠
lO，琼脂15(固体培养基)，固
体和液体培养基在需要时加入氨苄青霉素至100}tg
／mL、卡那霉素50p．g／mL。
（五）、酶活力测定
1、甘油脱水酶活力的测定
2、1，3一丙二醇氧化还原酶同工酶的酶 活力测定
基因工程工程菌构建共30页
39、没有不老的誓言，没有不变的承 诺，踏 上旅途 ，义无 反顾。 40、对时间的价值没有没有深切认识 的人， 决不会 坚韧勤 勉。
谢谢你的阅读
❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是Байду номын сангаас间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
基因工程工程菌构建
36、“不可能”这个字(法语是一个字 )，只 在愚人 的字典 中找得 到。--拿 破仑。 37、不要生气要争气，不要看破要突 破，不 要嫉妒 要欣赏 ，不要 托延要 积极， 不要心 动要行 动。 38、勤奋，机会，乐观是成功的三要 素。(注 意：传 统观念 认为勤 奋和机 会是成 功的要 素，但 是经过 统计学 和成功 人士的 分析得 出，乐 观是成 功的第 三要素 。
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6000 r／min离心30s。倒掉废液收集管中的废液。 （7)加入750此漂洗液于离心吸附柱中，静置1 min后，6000r／min离心30s。倒掉废液收集管 中的废液。重复一次。倒掉废液后。再次于6000 r／min离心2min，尽量除去漂洗缓冲液。 (8)小心取出离心吸附柱，将其套入一个干净的 1．5 mLEppendorf离心管中，加入适量洗脱缓 冲液，常规50此，室温放置2．5min后，6000 r ／min离心2min。 (9)取5“L酶切后电泳鉴定。
优选
9
（一）、质粒DNA的提取
(1)接重组大肠杆菌一环于LB培养基中，振荡培 养过夜。
(2)取1．5mL菌液于Eppendorf管中，6000r／ min离心5 min。 (3)弃去上清，加入溶液I 100“L重悬菌体。 (4)加入溶液II 150“L，轻柔混匀。 (5)加入溶液III 150此，倒转混匀，8000 r／min， 离心10min。 (6)将420¨L结合缓冲液加入离心吸附柱中，然 后将步骤5中的上清加入优选离心吸附柱中混匀， 10
在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒
pEtac．dhaB．tac-yqhD和pUC．tac-dhaT，
研究为提高1，3．丙二醇产量提供了新途
径。
优选
5
1，3-丙二醇基因工程菌构建的路线
(1)串联表达来源于克雷伯氏菌(Klebsiella)编码油脱 水酶的基因dhaB以及来源于大肠杆菌(编码1，3 一丙二醇氧化还原酶同工酶的基因yqhD，构建
1，3-丙二醇新型基因工程菌的构建
生物技术1101班
李娟
优选
1
1，3．丙二醇简介
1，3．丙二醇是目前国际上公认的六大 石化新产品之一，其主要功能是作为合成 聚酯、聚醚和聚亚氨酯的单体。1，3一丙 二醇的生产方法有化学合成法和微生物转
化法，但从自然界中筛选的微生物厌氧发 酵甘油生产l，3一丙二醇还存在产物生产 周期长和转化率低等问题，目前仅有化学
优选
7
一、大肠杆菌JMl09的构建及其表达
优选
8
材料
1，菌株、质粒及基因片断：
大肠杆菌JMl09，质粒pUCl9，pEtac由 本实保藏；yqhD和dhaB基因分别从大肠
杆菌和克雷伯氏菌中克隆得到。
2，主要试剂：
质粒小量抽提试剂盒、胶回收试剂盒化
试剂盒 ；工具酶、抗生素 ；丙烯酰胺、甲
叉双丙烯酰胺、
合成法应用于工业生产。因此，利用基因
工程技术构建高产菌株备被认为是今后的
发展方向。
优选
2
1，3-丙二醇性质
• 物理性质：1，3．丙二醇(1，3-propanediol，l， 3-PD)是一种无色无味透明的液体，易溶于水、 乙醇、醚类和甲酰胺，微溶于氯仿和苯【3j，相 对密度为1．053 g／cm3，熔点．27℃，沸点 211℃，自燃温度为400℃。
(3)在摇瓶水平，对已构建优的选 产1，3．丙二醇重组菌6
1，3．丙二醇生物合成途径
l，3一丙二醇是一种典型的甘油发酵产物,并 未发现其可由其他有机底物厌氧转化而来。甘 油作为唯一碳源和能源，它可以沿着氧化和还 原途径发生歧化反应，氧化途径中产物与糖类 发酵产物一致，并产牛供细胞牛长所必需的 ATP，在某些产物形成的同时释放还原力NADH； 还原途径则消耗氧化途径中多余的还原力，生 成1，3一丙二醇 。
轻轻吹吸悬浮菌体，冰水中放置30min。 （6)重复步骤(5)两次。
(7)8000r／min离心5min，然后静置2min， 冰水中迅速弃上清，加入预冷的CaCl280uL。 也可加40 uL50％的甘油保存代用。
优选
13
（三）、转化大肠杆菌
(1)取出感受态细胞，在冰水中融化。 (2)加入待转化的DNA，用吸头轻柔混合，不可 用漩涡混合仪。 (3)冰水浴40min。 (4)42℃热激90s。 (5)加入1mL LB培养基，37℃震荡培养1．2 h。 (6)涂布含有相应抗生素的LB平板。
优选
4
1，3-丙二醇基因工程菌构建的预期目标
• 本研究首先利用PCR方法从大肠杆菌中克
隆1．16 kb的1，3．丙二醇氧化还原酶同
工酶的编码基因yqhD2．80kb来源于克雷
伯氏杆菌甘油脱水酶的编码基因dhaB构建
了重组菌 i JM109(pEtac—dhaB—tac-
yqhD) 构建重组载体pUC．tac．dhaT，并
重组菌E coliJMl09(pEtac．dhaB．tac-yqhD);考 察其转化甘油的能力。
(2)利用PCR扩增来源于克雷伯氏茵的1，3一丙二醇 氧化还原酶dhaT，构建重组载体pUC．tac一砌口 T，并在大肠杆菌JMl09共表达重组质粒pEtac— dhaB—tac-yqhD和pUC—tac-dhaT。
优选
14
（四）、大肠杆菌JMl09基因工程菌的构建
首先将来源于大肠杆菌的基因片段yqhD 连入载体pEtac上，得到重组质粒pEtacyqhD，经酶切，得到片段tac-yqhD连入载体 pUCl9，得到重组质粒pUC．tac-yqhD，将 来源于克雷伯氏菌的基因片段dhaB连入载体 pUC．tac-yqhD，以得到的重组质粒 pUC．dhaB．tac-yqhD。将重组表达载体酶 切连接到pEtac上，得到双启动子重组表达大 肠杆菌JM 109(pEtac优—选 dhaB-tac-yqhD)。 15
• 化学性质：高温下与羧酸缩合成酯，与异氰酸盐
及酸性氯化物生成聚氨酯。1。3一丙二醇最重
要的性质就是与二酸反应生成聚酯和聚氨酯。
优选
3
1，3-丙二醇用途
• 可直接用于防冻剂，是多种增塑剂、洗涤剂、防 腐剂和乳化剂的合成原料；也广泛应用于食品、 化妆品和制药等行业14j。
• 1，3．丙二醇最主要的用途是合成新型聚酯PTT 的原料。PTT纤维克服了PET纤从而引起纤维材 料界的瞩目，可用于生产地毯、短丝及长丝产品， 产薄膜、非织造布和单丝，用作热塑性工程塑料
优选
11
(二)、大肠杆菌感受态细胞的制备
(1)接种EcoliJM109于LB培养基中振荡培养过 夜。 (2)取0．5mL培养液于50mLLB培养基中37℃ 振荡培养至OD值O．3—0．4。 (3)菌液三角瓶放入冰水中，轻轻摇晃，使菌 液迅速冷却约10分钟。 (4)分装菌液到Eppendorf管(1．5mL)中， Eppendorf管迅速放入冰水中静置15min。 (5)8000r／min离心5min，然后静置2min，冰 水中迅速弃上清，加入优选预冷的CaCl2400uL，12