第四章基因工程制药

源。
噬菌体遗传学
细菌抗药性遗传学 限制酶的发现 DNA合成与修复 细菌基因 调节研究 外源DNA 插入载体 哺乳动物表 达载体 细菌表达载体 构建基因文库
噬菌体载体
质粒载体
动物病毒学
反转录病毒 和反转录酶 mRNA结构与 代谢的研究
大规模的蛋白合成 克隆特定 的基因
制备探 针
寡核苷酸合成 蛋白序列分析
Culture Engineering Bacterium
Identification Finished Products
Separate and Purify the Products
Make up or Packaging
基因工程药物的上游技术：
1、基因克隆载体:质粒载体， 2、重组DNA技术的有关工具酶及其应用 3、核酸制备技术：制备纯净、高质量的 载体DNA和待克 隆的 核酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、连接等 分子克隆操作。 1）用碱抽提法分离质粒DNA 原理：细胞pH12.0-12.6线状DNA变性，cccDNA不变性，加酸 恢复pH到中性，变性的染色体DNA交织成网而沉淀，上清 用酚处理使蛋白变性，用醇沉淀质粒DNA。 A）质粒DNA的小量制备 B）质粒DNA的大量制备
T10 Expression in Eukaryotic Cells
1
2
3
1
2
3
Fig. 2A
Fig.2B
Fig. 2A pCMV/myc-T10 expressed in 293T cells. Lane1: Mr; Lane2: negative control; lane3: expressed T10 protein. Fig. 2B pCMV/myc-T10 expressed in 293T cells. Lane1: Mr; Lane2: negative control; lane3: expressed T10 protein.
5、将重组体导入host cell 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分离和鉴定 （限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测 序、确定基因的 转录方向、转录起始点等。）
二、化学合成法
较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成 法获得。化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基 因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序， 再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。
小鼠胚胎学
DNA序 列分析 插入生殖细胞 定点突变改 变基因结构 功能分析 序列分析
RNA序 列分析
9.基因工程的诞生与及其相关学科的关系
“863”高技术计划在生物技术领域研究的三个主
题之一是：新型药物、疫苗和基因治疗，重点是 利用现代生物技术手段，开发化学合成法难以生 产的药品。
“十五”期间，863计划选择了信息技术、生物和现代农业技术、新材料、先进制造与自动 化技术、能源技术、资源环境技术等6个高技术领域 。
7.基因工程技术的应用特点：
A、为癌症、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾 病的预防、治疗和诊断提供新型疫苗、新型药物和 新型诊断试剂。 B、基因工程技术的最大好处在于它能从极端复 杂的机体细胞内取出所需要的基因，将其在体外进 行剪切拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行 表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的 蛋白质。
小量制备
挑单菌落接种在2ml含抗菌 素的 LB中，过夜
将1ml培养物用0.5ml 水和 Solution I 100ul 悬浮 Solution II 200ul冰浴裂解 Solution III 150ul恢复pH 酚/氯仿抽提 乙醇沉淀DNA
大量制备
用10ml过夜培养物接种500ml含抗菌 素的 LB, 37℃,振荡，使OD600为0.8 －1.0。 离心回收菌体，用50ml 水和Solution I 10ml 悬浮，加溶菌酶 Solution II 20ml 冰浴裂解 Solution III 15ml恢复pH 上清加0.6倍异丙醇，得沉淀 70％乙醇洗DNA 酚/氯仿抽提 乙醇沉淀DNA
方法：合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷
酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片 段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成 较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。
人工化学合成基因的限制： a. 不能合成太长的基因。最长50-60bp.只适用
于克隆小分子肽的基因。
b. 人工合成基因时，遗传密码的简并会为选 择密码子带来很大困难， 如用氨基酸顺序推测核 苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完 全一 致，易造成中性突变。
8.基因工程技术生产药品的优点：
a. 可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为 临床使用提供有效的保障； b. 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化 和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；
c. 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性
物质； d. 内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处， 可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造； e. 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来
3.基因工程技术最成功的成就:用于新型生物技术药物的研制
4.基因工程技术的主要工具: * Tool enzyme 工具酶:restriction enzyme, ligase, repair. * Nucleic acid and protein sequence:Basis for gene analyze and synthesis. * Transfer vector: gene transfer * Expression vector: Manufacture plant for gene replication and expression target products. Good Vectors: Ecol. ,---- High efficiency expression but glycoprotein Beer yeast , mammalian cell ----glycoprotein
5. 传统制药存在的问题：
A、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用；
B、从动物脏器中提取出来，也因造价太高，或因来
源困难而供不应求；
C、由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制。
6. 基因工程技术的特点：就是能够十分方便有效地生
产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可 以创造出自然界中不存在的全新物质。
2）染色体DNA的制备
3）真核细胞RNA的制备 4) DNA的凝胶(Agarose)电泳和 凝胶中DNA的 回收 5) SDS-PAGE电泳和 凝胶中DNA的 回收
心 肝 脾 肺 肾 胃 脑 大肠睾丸 心 肝 脾 肺 肾 胃 脑 大肠卵巢
第一节 目的基因的获得
问题：来源于真核细胞的产生基因工程药物的目的基因，为什 么不能进行直接分离？
为什么要以Fusion Protein的形式表达药物基因 许多蛋白质药物与原核生物的蛋白质融合后，能保留原有 的免疫原性。一些免疫原性弱的多肽制成融合蛋白，其免疫 原性能得到加强。用这种融合蛋白免疫动物所制备的抗体， 能够用于检测原来的多肽药物，也可用于药代动力学研究， 药物受体研究以及药物产品的检测。
制 备 基 因 工 程 药 物 的 一 般 程 序
Get Target Gene
Filtration
Bacteria Free
Construction Recombinant Plasmid
Identification
Construction Gene Engineering Bacterium
Semi-manufactured Goods
10. 基因工程药物生产的基本过程
基因工程药物的生产分为上游和下游两个阶段： 上游阶段：主要是分离目的基因、构建工程菌(细 胞)。目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表 达。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋 白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。 此阶段的工作主要在实验室内完成。 下游阶段：从工程菌的大量培养一直到产品的分离 纯化和质量控制。此阶段是将实验室的成果产业化、 商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确 立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置 的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备 技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造， 电子计算机的优化控制等。
目的基因的获取途径： 一、逆转录法
逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA， 然后进行cDNA 克隆表达。 1、mRNA purification a.细胞内RNA的组成和含量:
DNA:95%核内，5％细胞器 RNA：75％细胞质，10%核内，15%细胞器 rRNA80-85%;tRNA10-15%;mRNA1-5%
3
GST-T10
Glutamic dehydrogenase 53 KD Glyceraldehyde-3-Phosphate 36KD
Trypsinogen
24 KD 17 KD
Fig.2 GST-T10 fusion protein expressed in BL21 induced with 1mM IPTG. Lane 1: Mr; Lane 2: Negative control; Lane 3: expressed GST-T10 fusion protein .
10mM Tris 1mM EDTA
纤维素柱纯化Poly(A)mRNA 流程图
Poly(A)mRNA
2、cDNA第一链的合成：一次好的逆转录反应可使
oligo(dT)选出的mRNA有5—30%被拷贝。
3、cDNA第二链的合成：
4、cDNA cloning：expression vector pUC
b.真核细胞mRNA 的特点及分离纯化方法。 3’-polyA（20-250AAA）-oligo(dT)
Oligo(dT) 纤维素
TTTTTT TTTTTT AAAAA TTTTTT AAAAA TTTTTT 100mM NaCl 洗脱 rRNA/tRNA Total RNA
Poly(A)--Oligo(dT)
第四章
基因工程制药
内容：
• • • • • • 1、目的基因的获得 2、基因的表达 3、基因工程菌的稳定性 4、基因工程菌的发酵 5、基因工程药物的分离纯化 6、基因工程药物的质量控制
基因工程制药的基本概念
Chapter 4 Gene Engineering for Pharmacon
1.定义
基因工程:是通过对Nucleic acid 分子的Insert, Assemble and Recombinant而实现遗传物质（germ plasm）的重新组合， 再借助Virus ,Bacterium ,Plasmid or other Vectors,将 Target gene转移到新的 Host Cell System,并使Target Gene 在新的Host cell system 进行Replication and Expression 的技术。 2.基因工程主要研究任务:Gene isolation ,synthesis , Incision(切割),recombinant ,transformation and expression. Gene Manipulation/Gene cloning/DNA recombination.
c. 费用太高。
第二节
基因表达
克隆蛋白质药物基因的一个主要目的使为了高效的表达该 基因，从而大量地获得原本难以获得的药物。
基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有 加工过程。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的 表达活动，即剪切下一个外源基因片段，拼接到另一个基因 表达体系中，使其能获得既有原生物活性又可高产的表达产 物。
进行基因表达研究的主要问题是目的基因的表达产量、 表达产物的稳定性、产物的生物学活性和表达产物的分离纯 化。因此，建立最佳的基因表达体系，是基因表达设计的关 键。
GST-T10 Fusion Protein Expression
Leabharlann Baidu
1
Phosphorylase Albumin 97 KD 66 KD
2