基因工程制药工艺
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具有遗传背景清楚、目标基因表达水平高（高 达70％），培养周期短，抗污染能力强。
不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白 表达。
细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内 毒素，具有抗原性，产生热源。
N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。
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制药过程与工艺
6 应用
大量外源基因能超量的表达，18种药物上市。
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二、化学合成法
较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成 法合成。必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白 质的氨基酸顺序。 用化学法合成目的基因DNA不同 部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形 成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按 正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用 连接酶连接成完整的基因。 人工化学合成基因的限制 ⒈不能合成太长的基因。目前 DNA 合成仪所合成的寡 核苷酸片段仅为 50～ 60 bp，因此 只适用于克隆小分子肽的基因。 ⒉遗传密码的简并使选择密码子困难，用氨基酸顺序 推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全 一致，易造成中性突变。 ⒊费用高。
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制药过程与工艺
3.1 基因工程制药微生物表达系统
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制药过程与工艺
表达宿主细胞的选择
适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求: 容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 产物的产量、产率高， 产物容易提取纯化。
优点:大量生产、应用临床、深入研究、扩 大应用、改造不足 。
基因工程技术是将重组对象的目的基因插 入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工 程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合， 并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技 术。
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制药过程与工艺
基因工程基本过程
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制药过程与工艺
基因工程菌：微生物为操作对象，通过基 因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制 表达自身基因的工程生物体。 宿主细胞分为两大类：
第一类为原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽 胞杆菌、链霉菌等；
第二类为真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、 哺乳动物细胞等。
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制药过程与工艺
基因工程中使用菌株：K－12株的衍生菌株。 基因组：4.6 Mb，3000多种蛋白质。 染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。
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制药过程与工艺
3 质粒载体
复制起始点 选择标记 多克隆位点
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制药过程与工艺
质粒类型
严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少数几 个拷贝的质粒，pSC101；
能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生 长繁殖迅速，倍增期约2小时。
酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因 组测序，遗传背景已相当清楚。
基因组：120.68Mb，5887个ORF，编码约 6000个基因。
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制药过程与工艺
3 优点与不足
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第3章 基因工程制药工艺
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制药过程与工艺
本章内容
3.1 基因工程概述 3.2 基因工程制药微生物表达系统 3.3 基因工程大肠杆菌的构建技术 3.4 基因工程菌的发酵培养与控制 3.5 重组人干扰素生产工艺
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制药过程与工艺
概述
20世纪70年代基因工程诞生最先应用在医 药科学领域。1982年第一个基因工程产品--人 胰岛素在美国问世。
多肽类2种（甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽）
激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种 PEG化)
细胞因子类：5种干扰素α（1种PEG化）、干 扰素β和γ，2种G-CSF(1种PEG化)，白介素-2、 白介素-11、白介素-1拮抗剂
溶栓酶类：rPA
白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗） 等。
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二 酵母表达系统
1 形态特征
细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。
繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。
菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。
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2 生长与遗传特征
孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同的单 倍体细胞结合形成二倍体接合子或营养细胞， 进行芽殖。
基因工程药物制药的主要程序
⒈目的基因的克隆 ⒉构建DNA重组体 ⒊DNA重组体转入宿主菌 ⒋构建工程菌 ⒌工程菌发酵 ⒍表达产物的分离纯化 ⒎产品的检验等
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目的基来自百度文库的获得
克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，在反 转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。 ⒈mRNA的纯化 ⒉cDNA第一链的合成 ⒊cDNA第二链的合成 ⒋ cDNA的克隆 ⒌将重组体导入宿主细胞 ⒍ cDNA文库的鉴定 ⒎目的cDNA克隆的分离和鉴定
一 大肠杆菌表达系统
1 大肠杆菌（Eschericlia coli）形态特征
细胞：G－，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜。裂殖。 菌落:白色至黄白色，光滑，直径2－3mm。
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制药过程与工艺
2 生化与遗传特性
能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无 机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。
松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至几百 个拷贝数的质粒，pMB1和colE1；
克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因； 测序质粒：用于基因测序； 整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合； 穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在； 表达质粒：能表达基因产物
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4 产物表达形式
不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体；
可溶性蛋白质：存在于细胞质；
周质表达：外源蛋白被运输分泌到周质，可溶 性。有利于分离和减少蛋白酶降解，避免N端 附加蛋氨酸；
胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外 的培养液中。
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5 优点和不足
发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。
不能用于加工修饰化（糖基化、酰胺化）蛋白 表达。
细胞死亡后，细胞壁脂多糖游离出来，形成内 毒素，具有抗原性，产生热源。
N端增加的蛋氨酸也容易引起免疫反应。
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6 应用
大量外源基因能超量的表达，18种药物上市。
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二、化学合成法
较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成 法合成。必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白 质的氨基酸顺序。 用化学法合成目的基因DNA不同 部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形 成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按 正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用 连接酶连接成完整的基因。 人工化学合成基因的限制 ⒈不能合成太长的基因。目前 DNA 合成仪所合成的寡 核苷酸片段仅为 50～ 60 bp，因此 只适用于克隆小分子肽的基因。 ⒉遗传密码的简并使选择密码子困难，用氨基酸顺序 推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全 一致，易造成中性突变。 ⒊费用高。
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3.1 基因工程制药微生物表达系统
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表达宿主细胞的选择
适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求: 容易获得较高浓度的细胞； 能利用易得廉价原料； 不致病、不产生内毒素； 发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态； 容易进行代谢调控； 容易进行DNA重组技术操作； 产物的产量、产率高， 产物容易提取纯化。
优点:大量生产、应用临床、深入研究、扩 大应用、改造不足 。
基因工程技术是将重组对象的目的基因插 入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工 程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合， 并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技 术。
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基因工程基本过程
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基因工程菌：微生物为操作对象，通过基 因工程技术获得的表达外源基因或过量或抑制 表达自身基因的工程生物体。 宿主细胞分为两大类：
第一类为原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽 胞杆菌、链霉菌等；
第二类为真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、 哺乳动物细胞等。
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制药过程与工艺
基因工程中使用菌株：K－12株的衍生菌株。 基因组：4.6 Mb，3000多种蛋白质。 染色体DNA为环状双链，核外遗传物质为质粒。
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制药过程与工艺
3 质粒载体
复制起始点 选择标记 多克隆位点
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武汉科技大学
制药过程与工艺
质粒类型
严紧型质粒：在每个宿主细胞只能复制少数几 个拷贝的质粒，pSC101；
能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。生 长繁殖迅速，倍增期约2小时。
酿酒酵母有17条染色体1996年完成其全基因 组测序，遗传背景已相当清楚。
基因组：120.68Mb，5887个ORF，编码约 6000个基因。
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3 优点与不足
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第3章 基因工程制药工艺
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本章内容
3.1 基因工程概述 3.2 基因工程制药微生物表达系统 3.3 基因工程大肠杆菌的构建技术 3.4 基因工程菌的发酵培养与控制 3.5 重组人干扰素生产工艺
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制药过程与工艺
概述
20世纪70年代基因工程诞生最先应用在医 药科学领域。1982年第一个基因工程产品--人 胰岛素在美国问世。
多肽类2种（甲状旁腺激素(1-34)、利尿钠肽）
激素：胰岛素及2种突变体、8种生长素(1种 PEG化)
细胞因子类：5种干扰素α（1种PEG化）、干 扰素β和γ，2种G-CSF(1种PEG化)，白介素-2、 白介素-11、白介素-1拮抗剂
溶栓酶类：rPA
白喉毒素-IL 2融合蛋白、OspA脂蛋白（疫苗） 等。
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二 酵母表达系统
1 形态特征
细胞：单细胞真核生物，球形、椭圆形、卵形。
繁殖：芽殖、裂殖。在特定条件下才产生子囊孢子。
菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐。
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2 生长与遗传特征
孢子萌发产生单倍体细胞，两个性别不同的单 倍体细胞结合形成二倍体接合子或营养细胞， 进行芽殖。
基因工程药物制药的主要程序
⒈目的基因的克隆 ⒉构建DNA重组体 ⒊DNA重组体转入宿主菌 ⒋构建工程菌 ⒌工程菌发酵 ⒍表达产物的分离纯化 ⒎产品的检验等
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克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。 一、逆转录法 逆转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，在反 转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。 ⒈mRNA的纯化 ⒉cDNA第一链的合成 ⒊cDNA第二链的合成 ⒋ cDNA的克隆 ⒌将重组体导入宿主细胞 ⒍ cDNA文库的鉴定 ⒎目的cDNA克隆的分离和鉴定
一 大肠杆菌表达系统
1 大肠杆菌（Eschericlia coli）形态特征
细胞：G－，单细胞，杆状。鞭毛，无芽孢，一般无荚膜。裂殖。 菌落:白色至黄白色，光滑，直径2－3mm。
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2 生化与遗传特性
能在仅有碳水化合物和氮、磷及微量元素的无 机盐的极限培养基上生长，发酵糖，产气产酸。
松弛型质粒：在每个细胞中能复制几十至几百 个拷贝数的质粒，pMB1和colE1；
克隆质粒：用于克隆和扩增外源基因； 测序质粒：用于基因测序； 整合质粒：用于外源基因与宿主染色体整合； 穿梭质粒：能在两种宿主细胞存在； 表达质粒：能表达基因产物
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4 产物表达形式
不溶性蛋白质：细胞质内形成包涵体；
可溶性蛋白质：存在于细胞质；
周质表达：外源蛋白被运输分泌到周质，可溶 性。有利于分离和减少蛋白酶降解，避免N端 附加蛋氨酸；
胞外分泌表达：胞内可溶性蛋白质分泌到胞外 的培养液中。
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发展最早、应用最广泛的经典的表达系统。