基因工程制药概要
基因工程制药
2.反转录--PCR法
PCR的原理及步骤
mRNA经反转录合成cDNA第一条链后, 直接在特异引物协助下,用PCR法进行 大量扩增,从而特异合成目的基因,然 后再用于重组,克隆。
聚合酶链式反应(PCR)
PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大 量扩增(包括分离)一段目的基因的技术。 加入4种物质:
1. 反转录人工合成互补DNA 提取RNA 纯化mRNA
cDNA第一链的合成
cDNA第二链的合成
合成一条cDNA双链后: cDNA的克隆 选择载体 与载体连接成重组体 将重组体导入宿主细胞 进行表达,筛选鉴定。
反转录人工合成互补DNA方法的 优势——
获取的DNA片段往往是具有特 定功能的目的基因
第一个基因工程药物--人胰岛素
世界第一个基因工程药物的诞生:美国 Lilly公司的重组胰岛素投放市场—— 1982
出现原因P14
化学合成药物 不能直达病灶,有时不可彻底治愈 内源性生理活性物质作为药物 材料来源困难 造价高 可能会产生排斥反应 提取过程中难免有病毒感染 ……
基因去mRNA-cDNA杂交链中的mRNA链 碱解或RNaseH酶解 (2)以cDNA第一链为模板合成第二链 从第一链3’端的发夹结构开始合成 所需酶:DNA聚合酶ǀ (3)核酸酶Sǀ专一性切除发夹结构。
合成过程
下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合
(2)人工合成法限制性
不能合成太长的基因 ≤60bp 只能合成小 分子肽。 遗传密码的简并性,以aa推测核苷酸顺 序时,不一定与天然基因一致,易发生 突段分别克隆在质2.免疫性蛋白:单克隆抗体,疫苗 3.细胞因子:干扰素,白细胞介素 4.酶类:尿激酶,超氧化歧化酶
基因工程制药
重要的工具酶
工具酶 限制性核酸内切酶
(Ⅱ型) T4 DNA连接酶
DNA聚合酶 逆转录酶
碱性磷酸酶 末端转移酶
活性 识别特异碱基序列,切割DNA
催化DNA5’-磷酸与3’-羟基 形成磷酸二酯键 以DNA为模板合成DNA 以RNA为模板合成cDNA 切除5’-末端磷酸 催化3’-端合成同聚尾
(三)、基因工程的载体
表达载体(expression vector)
使插入的外源DNA序列转录翻译,表达 出多肽链,这样的载体称为表达载体。
穿梭载体(shuttle vector)
这类载体中含有来源不同的复制子结构,既具 备原核细胞复制所需的序列结构,又具有能使外源 片段在真核细胞表达所需的结构元件和相应的选择 标记基因,故能在两种受体细胞中复制并检测,克隆 的外源基因在此类载体直接从一种受体转入另一种 受体中进行复制和表达.
基因工程制药
第一节 概述 第二节 基因工程基本技术与策略 第三节 基因药物生产的基本过程 第四节 基因工程药物制造实例
第一节 概述
一、基因工程建立的基础 二、基因工程的相关概念及相关酶学 三、基因工程技术所生产的药物 四、基因工程制药的优点 五、基因工程制药所使用的生物技术 六、我国基因工程制药的进展 七、基因工程制药生产的化学工艺学要求 八、基因工程的发展
四、基因工程制药的优点
(1)利用基因工程技术可 以生产出过去难以获得的 生理活性蛋白和多肽。
(2)可以通过大批量的生 产方法获得足够数量的生 物活性物质。
(3)利用基因工程技术可 以发掘出更多的内源性生 理活性物质。
(4)利用基因工程技术和 蛋白质工程技术可以对药 物蛋白进行修饰和改造, 来提高药效价值和获得新 型的化合物。
生物制药:基因工程制药2
4、溶解氧
影响菌体代谢的一个重要参数,对菌体的生长和产物 的生成影响很大 外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值 (>40%) 调节搅拌转速法,可以改善培养过程中的氧供给,提高活 菌产量
5、诱导时机
一般在对数生长期或对数生长后期升温诱导表达
6、诱导表达程序 热诱导 7、pH pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有
获得微生物自身基因表 达所产生的初级或次级 代谢产物
工艺要求:外源基因既高效表达,又有利于 产品分离纯化。对发酵影响较大的几个因素有: 1. 培养基的影响 2. 接种量的影响 3. 温度的影响 4. 溶解氧的影响 5. 诱导时机的影响 6. 诱导表达程序的影响 7. pH的影响
1、培养基
提高工程菌生长速率,保持重组质粒的稳定性,使外源基因能 够高效表达 常用碳源:葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等
发酵液
细胞分离 胞内产物
细胞破碎
固液分离
包含体
细胞碎片分离
变性
复性
胞外产物 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品
一般不应超过4~5个步骤 细胞破碎 固液分离 浓缩与初步纯化 高度纯化直至得到纯品以及成品加工
捕获阶段:目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白
中度纯化阶段:目标是除去大多数大量杂质, 如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等
培养基组成:限制培养基比丰富培养基更有利于稳定 培养温度:较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
(七) 基因工程菌中试、培养 及高密度发酵
基因工程菌的培养过程
(1) 通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件, 如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比,分 析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响;
第二章基因工程制药
第一节
概 述
基因工程技术诞生:20世纪70年代 现代生物技术的发展
基因工程:
应用DNA重组技术,按照人们的意愿,在基因水平上改变生物
遗传性,创造新的生物物种,通过工程化手段为人类提供有用产品
和服 务的技术。
一、基因工程技术生产药品的优点
1. 大量生产过去通过常规生化分离提取技术难以获得(富集)的 生理活性蛋白和多肽。 2. 提供足够数量的生理活性物质。
超声破碎法
四、固液分离
分离细胞碎片常用的方法有:
1. 离心沉淀:高速离心、超速离心 2. 膜过滤:微滤、超滤和反渗透
3. 双水相萃取:聚乙二醇-葡聚糖
聚乙二醇-无机盐
五、重组蛋白质的分离纯化
分离纯化主要依赖色谱分离方法。 色谱技术包括: 离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、 凝胶过滤色谱、高效液相色谱等。
发夹结构 RNaseH S1核酸
4.cDNA克隆
质粒 入噬菌体 酶、 定向、A T克隆
化 学 法 电 击 转 染
5.将重组体导入宿主细胞 差示 抗体 抗性获得 抗性失活 显色
二、大肠杆菌中的基因表达
2.影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素
(1)外源基因的拷贝数 (2)启动子的强弱 (3)SD序列的有效性 (4)SD与ATG的间距 (5)密码子的组成(偏爱性) (6)产物的稳定性 (7)产物对宿主的影响
二、大肠杆菌中的基因表达
3.表达形式
(1)融合蛋白,增强稳定性。 (2)非融合表达。
五、重组蛋白质的分离纯化
3. 亲和层析: 是利用固定化配体与目的蛋白质之间非 常特异的生物亲和力进行吸附,这种结合既 是特异的,又是可逆的,改变条件可以使这 种结合解除。
基因工程制药碎片网载基因工程制药
基因表达的调控是一个复杂的过程,如何有效调 控基因的表达以达到治疗目的,是基因工程制药 中的一大挑战。
细胞和组织特异性
如何将药物准确地递送到病变细胞或组织,避免 对其他细胞或组织的损伤,是基因工程制药中的 另一个技术挑战。
伦理和法律问题
人类基因编辑
基因工程制药涉及到人类基因编辑,如何确保技术的安全性和伦理 的合理性,是当前面临的重要问题。
知识产权保护
基因是天然存在的,如何保护知识产权,避免侵权行为,是基因工 程制药中需要关注的问题。
法规监管
基因工程制药涉及到法规监管问题,如何制定合理的法规和监管政策, 以确保技术的安全性和有效性,是当前面临的重要挑战。
社会和经济影响
01
社会接受度
基因工程制药是一种新兴的技术,如何获得社会的广泛接受和支持,是
未来发展方向和前景
创新药物的研发
随着基因工程技术的不断发展,未来将有更多的创新药物 问世,为患者提供更有效的治疗方案。
个性化医疗的发展
基因工程制药技术的发展将推动个性化医疗的进步,根据 患者的基因组信息量身定制治疗方案,提高治疗效果。
跨界合作与国际合作
未来将有更多的跨界合作和国际合作,共同推动基因工程 制药领域的发展。同时,国际合作将有助于制定统一的法 规和标准,促进技术的全球推广和应用。
利用基因工程技术进行细胞培养,生 产生物药物。
利用基因工程技术生产生物催化剂, 用于生物制药生产。
蛋白质表达
通过基因工程技术表达蛋白质,生产 生物药物。
04
基因工程制药的挑战与前景
技术挑战
1 2 3
基因测序技术
随着基因测序技术的不断发展,如何提高测序速 度、降低成本和提高准确性是当前面临的重要挑 战。
基因工程制药
1. 原核细胞
(1)大肠杆菌 因为大肠杆菌的分子遗传学研究 深入,生长迅速,所以目前仍是基因工 程研究中采用最多的原核表达体系。
表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达 (包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达 等。 大肠杆菌中的表达不存在信号肽,产品多为 胞内产物,提取困难。 因分泌能力不足,真核蛋白质常形成不溶性 的包含体,表达产物需经变性复性才恢复活性。 蛋白质不能糖基化。 产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。 其内毒素很难除去。
真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件: (1)载体能够独立复制。载体本身是 一个复 制子,具有复制起点。 (2)应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标 记,以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。 (3)应具有很强的启动子,能为大肠杆菌 RNA聚合酶所识别。
(4)应具有阻遏子,使启动子受到控制,只有 当诱导时才能进行转录。 (5)应具有很强的终止子,只转录克隆的基因, 所产生的mRNA较为稳定。 (6)所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号 AUG和SD序列,以便转录后顺利翻译。
(2)丝状真菌
优点:分泌能力强,能正确进行翻译 后加工(肽剪切糖基化)有成熟的发酵和 后处理工艺。
(3)哺乳动物细胞
优点:表达产物可由重组转化细胞分 泌到培养液中,纯化容易。产物是糖基化 的接近天然物。
缺点:生长慢,生产率低,培养条件 苛刻,费用高,培养液浓度稀。
目前使用最广泛的宿主菌是大肠
杆菌和酿酒酵母,已建立了许多适合
本系统宿主菌可以是大肠杆菌HB101、 JM103、C600,质粒拷贝数较多,因此小量 简便快速提取即可满足需要。 本系统为温度诱导,外源基因表达量可 达细胞总蛋白的20%~30%。 产物以包含体形式存在不易降解均一性 好。
基因工程制药
人工合成基因的限制: 人工合成基因的限制: 不能合成太长的基因。目前 不能合成太长的基因。目前DNA合成仪所合成 合成仪所合成 的寡核苷酸片段最长不超过60 bp 的寡核苷酸片段最长不超过 人工合成基因时, 人工合成基因时,遗传密码的简并性会为选择 密码子带来很大困难 费用较高
丝状真菌
有很强的蛋白质分泌能力 能正确进行翻译后加工,包括肽剪切和糖基化 能正确进行翻译后加工, 等,而且其糖基化方式与高等真核生物相似 丝状真菌(如曲霉)等被确认是安全菌株, 丝状真菌 如曲霉)等被确认是安全菌株,有 如曲霉 成熟的发酵和后处理工艺
哺乳动物细胞
COS细胞 细胞 CHO细胞 细胞
4.2 大肠杆菌体系中的基因表达
表达载体必须具备下列条件: 表达载体必须具备下列条件: 载体能够独立地复制 应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记 应具有很强的启动子 应具有阻遏子,使启动子受到控制, 应具有阻遏子,使启动子受到控制有很强的终止子,以便使RNA聚合酶集中力量转 聚合酶集中力量转 录克隆的外源基因,而不转录其他无关的基因, 录克隆的外源基因,而不转录其他无关的基因,同时 很强的终止子所产生的mRNA较为稳定 很强的终止子所产生的 较为稳定 所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号,即起始密 必须具有翻译的起始信号, 所产生的 必须具有翻译的起始信号 码AUG和SD序列〈Shine-Delgarno sequence〉,以便 和 序列〈 〉,以便 序列 〉, 转录后能顺利翻译
表达产物的稳定性措施: 表达产物的稳定性措施:
基因工程制药
基因工程制药基因工程制药是指利用生物技术手段,通过基因克隆、遗传工程、细胞培养等技术制备的药物。
相比传统的制药技术,基因工程制药具有高效、精准、无毒副作用等优点。
本文将从基因工程制药的概念、制备过程、应用、发展现状等方面进行介绍。
一、基因工程制药的概念基因工程制药是指利用遗传工程技术,将DNA序列插入到细胞内,使细胞能够表达人类所需的有效蛋白质,从而制备出符合医疗需求的药物。
基因工程制药的研发已成为制药业的重要领域,具有广阔的市场前景和潜力。
二、基因工程制药的制备过程基因工程制药的制备过程包括基因选择、基因克隆、载体构建、转染细胞、发酵培养和纯化等步骤。
1、基因选择基因工程制药的制备过程首先要选择适合人体治疗的基因,可以是已知的治疗目标基因,也可以是新发现的疾病相关基因。
2、基因克隆基因克隆是将目标基因从DNA分子复制到载体上的过程。
其中包括PCR扩增、酶切、连接和转化等步骤,最终得到包含目标基因的重组载体。
3、载体构建为了使目标基因的表达量达到较高水平,需要将目标基因克隆到适合的载体中。
典型的载体包括质粒和病毒。
4、转染细胞将重组载体转染到宿主细胞中,宿主细胞将目标基因表达成蛋白质。
常用的宿主细胞有哺乳动物细胞和真菌等。
5、发酵培养将转染后的细胞进行大规模培养,加入培养基和营养成分,进行培养和生长。
由于基因工程制药药物的生产量较大,通常采用发酵技术进行生产。
6、纯化将发酵得到的药物纯化出来,使其达到医药级别要求。
通常采用多种分离纯化技术,如超滤、离子交换和透析等,得到纯度高、活性好的药物制剂。
三、基因工程制药的应用基因工程制药已经广泛应用于多种疾病的治疗中,如慢性病、肿瘤、代谢性疾病和遗传性疾病等。
其中常见的基因工程制药药物有类风湿关节炎药物、肿瘤靶向药物、生长激素、重组人胰岛素和重组人血小板等。
1、类风湿关节炎药物抗肿瘤类药物通过影响免疫系统来治疗类风湿关节炎。
这些药物通常在类风湿关节炎患者无法耐受非甾体类抗炎药物和光合作用药物时使用。
第二章 基因工程制药.ppt
2019-10-13
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五、重组蛋白质的分离纯化
1. 离子交换层析:
是以离子交换剂为固定相, 依据流动相中的组分离子与交换 剂上的平衡离子进行可逆交换时 的结合力大小的差别而进行分离 的一种层析方法。
6. 降低成本,提高产品质量。
2019-10-13
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二、基因工程药物生产的基本过程
1. 目的基因的获得 2. 构建DNA重组体 上游技术 3. 构建工程菌 4. 工程菌的发酵 5. 外源基因表达产物的分离纯化 6.产品的检验
2019-10-13
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2019-10-13
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1.小分子量的蛋白或多肽 2.已知核苷酸顺序或氨基酸顺序 3.费用较高
2019-10-13
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V第it三a节m基in因表B达2
基因表达的成败,直接影响药品的质量、成本。基因表达是外 源基因在生物体转录、翻译以及所有加工过程,是外源基因异源转录 翻译利用宿主功能的过程,也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主细胞 进攻,保护自身的过程。
2019-10-13
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Vitamin A
2019-10-13
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第二节 目的基因的获得
一、 反转录法 二、化学合成法
2019-10-13
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一、反转录法
1.mRNA的纯化
(1)选择表达目的蛋白质丰度高的 mRNA的生物材料。
(2)分离总RNA。 (3)分离mRNA(多聚T纤维素)
三、国内外基因工程药物研究进展
目前研制的基因工程药物主要包括: 1. 免疫性蛋白,如各种抗原和单克隆抗体; 2. 细胞因子,如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子
2基因工程制药
第二章基因工程制药基因工程制药概要重组DNA技术的基本定义重组DNA技术是指将一种生物体(供体)的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另种生物体(受载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体)内,使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序,也称为分子克隆技术。
体外操作程序也称为分克隆技术供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
基因工程的基本定义基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用,包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA是基因重组克隆和表达的设计与构建(即重组技术);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
基因程药物生产基本过程基因工程药物生产基本过程获得目的基因成品检定↓组建重组质粒↑半成品检定↓↑构建基因工程菌↓除菌过滤↑培养工程菌产物分离纯化例乙肝疫苗例:乙肝疫苗(表面抗原)的重组表达z乙肝病毒(HBV)的基因组为部分双链环状DNA z有4个开放阅读框架(ORF),称为C、P、X和S 个放阅读框架称为z编码核心抗原(HBeAg/HBcAg)、HBV DNA)g聚合酶(HBV DNA P)、X抗原(HBxAg)及表面抗原(HBsAg)1基因S11.S 区又分为S 基因、preS1基因和preS2基因3段2.S 蛋白:小蛋白(smallprotein, SP ),主分3S2S 3.preS2+S 蛋白称为中蛋白middle protein,MP (middle protein, MP )4.preS1+preS2+S 蛋白称为大蛋白(large protein, LP )基因程药物生产基本过程基因工程药物生产基本过程获得目的基因成品检定↓组建重组质粒↑半成品检定↓↑构建基因工程菌↓除菌过滤↑培养工程菌产物分离纯化一乙肝表面抗原基因的获得、乙肝表面抗原基因的获得z PCR法z cDNA法z RT-PCR法z化学合成法z鸟枪法A cDNA法(反转录法)z cDNA法克隆目的基因的基本战略z cDNA法法克隆目的基因的局限性z cDNA法克隆目的基因的基本战略1. mRNA的纯化5‘ppp’5G G AAAAAAAAAAA OH3’•可被吸附于oligo(dT)-纤维素上•高盐浓度亲和层析法吸附•低盐浓度洗脱2. c DNA 第一链的合成mRNA5‘ppp’5G G5ppp 5G G AAAAAAAAAAA OH 3’引物退火5‘ppp’5G GAAAAAAAAAAA OH 3’TTTTTTTTTTT p 5’逆转录酶dNTPs5‘ppp’5G GAAAAAAAAAAA OH 3’TTTTTTTTTTT p 5’cDNA 第一链3.c DNA第二链的合成:自身引导法‘’G G N OH 5ppp 5G G AAAAAAAAAAAAAA OH3’TTTTTTTTTTTTTT p5’煮沸NaOH TTTTTTTTTTTTTT p5’OH 3’Klenow dNTPsTTTTTTTTTTTTTT p5’AAAAAAAAAAAAAA OH3’TTTTTTTTTTTTTTS1AAAAAAAAAAAAAA3. cDNA第二链的合成:置换合成法5‘ppp’5G G3’DNApol dNTPs 5ppp 5G G AAAAAAAAAAA OH 3TTTTTTTTTTT p 5’DNApol dNTPs RNaesH5’AAAATTT OH 3’TTTTTTTTTTTTTT p55’AAAAAAAAAAAAAA p 5’5TTTTTTTTTTTTTT OH 3’T4-DNA ligase S1AAAAAAAAAAAAAA 5’5’TTTTTTTTTTTTTT 3’3’T4DNA ligase AAAAAAAAAAAAAA 53B PCR法z PCR法定向扩增目的基因的基本原理PCR(Polymerase Chain Reaction)法,又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术,是一种高效快速的体外DNA聚合酶链反应或PCR扩增技术是种高效快速的体外DNA聚合程序。
第二章基因工程制药
n 能外分泌,产物可糖基化。 n 已有不少真核基因成功表达。
第二章基因工程制药
丝状真菌
n 有很强的蛋白质分泌能力。 n 能正确进行翻译后加工。 n 糖基化方式与高等真核生物
相似。
第二章基因工程制药
哺乳动物细胞
n 优点:表达产物可由重组转化 细胞分泌到培养液中,纯化容 易。产物是糖基化的接近天然 物。
n 或转化感受态大肠杆菌使质粒进 入细胞内。
第二章基因工程制药cDNA的鉴定n 根据重组体的表型进行筛选,主要 有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑 颜色改变法。
n 然后采用凝胶电泳、分子杂交、 DNA序列分析测定等方法进行进 一步筛选和鉴定。
第二章基因工程制药
目的c核酸探针杂交法:用层析和高分辨电泳等技术纯
酸二酯键,故能分解 RNA/DNA杂交体系 中的RNA链。该酶 不能消化单链或双链
DNA。
第二章基因工程制药
cDNA第二链的合成
n 此反应是在DNA聚合酶I催化下完 成的。核酸酶S1专一性切除单链 DNA,因此用它可以切除发夹结 构。
n 发夹结构结构切除后,双链cDNA 分子的大小常用变性琼脂糖凝胶电 泳进行测定。
n 基因工程中基因高效表达研究是指外 源基因在某种细胞中的表达活动,即 剪切下外源基因片段,拼接到另一个 基因表达体系中,使其能获得原生物 活性又可高产的表达产物。
第二章基因工程制药
什么是最佳的基因表达体系 n 目的基因的表达产量高 n 表达产物稳定 n 生物活性高 n 表达产物容易分离纯化
第二章基因工程制药
第二章基因工程制药
克隆真核基因的方法 逆转录法 化学合成法
03-3 基因工程制药
3.菌种库的建立与保藏
1.基因工程假单胞杆菌菌种建立 第一步:干扰素α-2b基因的克隆 第二步:表达载体的构建
第三步:工程菌的构建
第一步:干扰素基因的克隆(RT-PCR) 制备白细胞,病毒诱导,分离mRNA,反转录酶合成cDNA,
PCR,基因连接质粒,转化E.coli(感受态细胞),筛选鉴定
基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺
宿主:腐生型假单胞杆菌(Pseudomonas putida) 上市产品:IFN α-2b/安福隆 表达产物:无糖基化可溶性蛋白质,具有天然分子结构和生物 活性 工艺特点: 发酵周期短:几个小时
无需变性、复性过程,获得有活性产品
纯化过程:淘汰抗体亲和层析
二、基因工程假单胞杆菌的构建与保藏
4 生产实例
重组人干扰素生产工艺
一、干扰素概述
二、基因工程假单胞杆菌的构建与保藏
三、干扰素的发酵工艺过程 四、干扰素的分离纯化工艺过程
一、干扰素概述
干扰素简介
干扰素的临床应用 干扰素的研究与生产现状 干扰素的生产工艺路线
1.干扰素简介
概念(interferon, IFN):机体免疫细胞产生的一类细胞因子, 是机体受到病毒感染时,免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生 的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。 功能:干扰病毒在细胞内的繁殖
第二步:表达载体构建
IFN基因与表达载体连接 转化大肠杆菌 筛选阳性克隆
获得序列正确的表达载体
第三步:工程菌构建
转化假单胞杆菌
筛选高表达、稳定遗传的工程菌
获得原始菌种
2.基因工程菌的特性 (1)具有宿主菌的特征 细菌:革兰氏阴性菌,有荚膜,无芽孢,杆状。
基因工程制药1
2、基因的一般特性?
Biotechnological Pharmaceutics
第一节 基因工程制药概述
基 因 工 程 制 药
基因工程技术:
是通过对Nucleic acid 分子的Insert, Assemble and Recombinant而实现遗传物质(germ plasmid)的 重新组合,再借助Virus, bacterium, Plasmid or other Vectors,将Target gene转移到新的 Host Cell System,并使Target Gene在新的Host cell system 进 行Replication and Expression的技术。
Get Target Gene
Construction Recombinant Plasmid Construction Gene Engineering Bacterium Culture Engineering Bacterium
Filtration
Biotechnological Pharmaceutics
Biotechnological Pharmaceutics
目的要求
基 因 工 程 制 药
1、掌握基因工程技术的概念及基因工程制药的基本过程。 2、理解目的基因的获得方法,基因表达体系及不同表达 体系的特点及高效表达的措施。 3、掌握质粒不稳定产生的原因及提高质粒稳定性的方法。 4、掌握基因工程药物的分离纯化。
5、了解基因工程药物的质量控制。
Biotechnological Pharmaceutics
学习内容
基 因 工 程 制 药
1、基因工程制药概述
生物制药技术-第二章-基因工程制药(1,2,3,4小节)
Richard Young和Ronald Davis设计的λgtl0和 λgtDNA便十 分有效地产生许多克隆,每纳克cDNA可产生 5000个克隆,另方面可容纳较大相对分子质量 的外源DNA片段。由于噬菌斑的筛选和操作较 筛选细菌主中,λgtl0载体对于未携带cDNA的噬菌体的 裂解生长有很强的生物学选择作用。cDNA 插 入到λgtl0可使噬菌体阻遏物基因(c 1)失活。
1. MRNA的纯化
反转录法的前提是必须首先得到该目的基因的mRNA,而要 分离纯化目的基因的mRNA,其难度几乎不亚于分离目的基 因。细胞内含有3种以上RNA,mRNA占细胞内RNA总量的 2%~5%,相对分子质量大小很不一致,由几百到几千个核苷 酸组成。在真核细胞中mRNA的3'末端常含有一多聚腺苷酸 (polyA)组 成的末端,长达20~250个腺苷酸,足以吸附于寡 聚脱氧腺苷酸Oligo(dt)-纤维素上,可以用亲和层析法将mRNA 从细胞总RNA中分离出来。利用mRNA的3'末端含有polyA的 特点,在RNA流经寡聚(dt)纤维素柱时,在高盐缓冲液的 作用下,mRNA被特异地结合在柱上,当逐渐降低盐的浓度 洗脱时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下,mRNA被i洗脱下来, 经过两次寡聚(dt)纤维素往后,可得到较高纯度的mRNA。
我国基因工程药物研究和开发起步较晚,基础较差。 20 世纪70年代末以来,开始应用 DNA重组技术、淋 巴细胞杂交瘤技术、细胞培养、克隆表达等技术开 发新产品和改造传统制药工艺。几十年来,在国家 汁划,特别是国家"863"高技术计划的优先支持下, 使这一领域迅速发展,缩短了我国与世界先进国家 的差距。"863"高技术计划在生物技术领域内研究的 三个主题之一是新型药物、疫苗与基因治疗,重点 是利用现代生物技术手段,开发化学合成法难以生 产的医药产品,如肝炎、肿瘤、传染病和心脑血管 疾病预防、诊断和治疗的生物技术医药产品。
基因工程制药—基因工程制药技术
产物分离纯化
上游:主要指的是目的基因分离、工程菌(或 细胞)构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成。
下游:主要指的是从工程菌(或细胞)的大规 模培养一直到产品的分离纯化、质量控制等。
(一)基因工程菌的构建与筛选 将目的基因与载体连接后,转入受体细胞,即获得基因工程菌 该过程也称为基因工程的上游技术
3、培养温度 (1)在复制水平上,温度可影响基因拷贝数量 (2)在转录水平上,温度可影响RNA聚合酶的作用 (3)在翻译水平上,还可以通过小分子蛋白质合成水平来影响基因表达 (4)温度还影响蛋白质的活性和包涵体的形成 例如,重组人生长激素工程菌,在30℃时的产物是可溶的,而在37℃所表达出的蛋 白质则是不溶的
1、目的基因的制备 (1)化学合成法:将已知序列的目的基因利用化学合成的方法直接合成。 特点: • 只能合成小于100个碱基的特定序列 • 自动化程度高RNA合成cDNA,再将这些cDNA与载体连接, 转效表达和翻译需要维持较高水平的溶氧。 通常采用改变转速的方法,改善氧的供给 5、pH的影响 影响细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达。
6、诱导时机的影响 案例1 重组苏氨酸脱水酶的基因表达
不同诱导时机对重组苏氨酸脱水酶的影响
案例2 L-天冬氨酸酶的表达
诱导时机对L-天冬氨酸酶表达水平和活力的影响
2、载体
载体是携带外源目的基因或DNA进入宿 主细胞,实现外源基因无性繁殖或表达有 意义蛋白质所采用的DNA分子。
包括质粒载体、病毒(包括噬菌体)等。
基因工程载体必备条件 • 具有有效运载能力 • 载体自身能够独立复制,并能在宿主内进行自主性复制 • 必须有一个或多个限制酶的切割位点,以便目的基因可以插入到载体上 • 必须带有标志基因,以便进行重组后的筛选
生物制药:基因工程制药3
名称
重组链激酶 (SK )* 重组葡激酶 (SAK )* 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)*
人bFGF 牛bFGF融合蛋白 表皮生长因子(EGF)* EGF 衍生物* 生长激素(GH) 人胰岛素 白介素11 (IL-11) 抗IL-8 鼠源单抗乳膏剂* Anti-CD3 鼠源单抗 [131I]肿瘤细胞嵌合抗体注射液* 乙肝疫苗 痢疾疫苗* 霍乱疫苗* p53重组腺病毒注射液*
固体蛋白质比液体稳定,在室温或冰箱中保存比较稳定,长 期保存最好制成干粉或结晶
(十) 基因工程药物制造实例
我国已批准生产的生物技术药物和疫苗
名称
干扰素 IFN-α1b * IFN-α1b (滴眼液) IFN-α2a IFN-α2a (栓剂) IFN-α2b IFN-α2b (凝胶剂) IFN-γ
注射用水需高压灭菌,柱层析配制溶液用水一律使用超纯 化水。所配制溶液经高压灭菌后需4℃保存,有效期7d
细胞破碎前,大肠杆菌应进行革氏染色,镜检是否均一、 有无污染。细胞需在倒置显微镜下观察,是否形态饱满, 是否有其它污染物污染
纯化工艺过程的质量控制要保证能尽量除去污染病毒、核 酸、残余宿主菌蛋白、热原质和培养基残余细胞内蛋白及 其它杂质以及纯化过程带入的有害物质
福林-酚法和紫外光谱法等 相对分子质量测定
凝胶过滤法:测定完整的蛋白质相对分子质量 SDS-PAGE法:测定蛋白质亚基的相对分子质量
(5)蛋白质二硫键分析 维持蛋白质一级结构的重要共价键
方法有对氯汞苯甲酸法 (p-chloromercuribenzoate, PCMB)和5,5’-二硫双基-2-
检测方法
产品是否含内毒素
家兔热原法
蛋白质是否变异
肽谱、HPLC、等电聚焦、毛细管电泳
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DNA片断,主要产生3种末端结构:
5ˊ-粘性末端
3ˊ-粘性末端
平端或钝端
回文序列(palindrome) 是指该部位的核苷酸序列呈180O反向重复; 粘性末端(sticky end) 是指经内切酶特异切割后产生的5ˊ-末端突出和 3ˊ-末端突出的碱基序列相互间具有互补性。
HindⅡ GTCGAC CAGCTG
(三)、基因工程的研究内容
基因工程(genetic engineering )是指在基因水 平上,采用与工程设计十分类似的方法,按照人类 的需要进行设计,然后按设计方案创建出具有某种 新的性状的生物新品系,并能使之稳定地遗传给后 代。
二、基因工程相关概念及基本工具
(一)、基因工程的相关概念
1.克隆与克隆化 克隆指同一副本或拷贝集合。从众多不同的分子群体中分离 的某一感兴趣分子,经扩增产生很多相同分子集合,即为分 子克隆。
大肠杆菌 RY13株的第一种酶
第一个字母取自产生该酶的细菌属名第一个字母,用大写; 第二、第三个字母是该细菌种名的前两个字母,用小写; 第四个字母代表菌株类型; 如果菌株有几种酶,在代表菌株的字母后用罗马数字表示。
(4)Ⅱ类酶识别序列特点——
回文结构(palindrome)
特异识别及切割48个bp长度且具有回文序列的
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端切口
粘端切口
同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同,但切割DNA后,产生相同的粘性末端, 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
2.基因工程载体
为了使DNA片段能在宿主细胞中得以扩增,须将其接到一个特 定能够进行自我复制的载体分子上。Lederberg开始从事细菌 性因子(F因子)研究。20世纪50-60年代,相继发现其他质 粒,如抗药性基因(R因子)和大肠杆菌因子(CoE)。这些 工作为基因工程载体系统的建立打下基础。
3.基因的体外重组技术
(TaqDNA polymerase) 作用特点 1) Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围 70 75℃,
2) 95℃以上高温,半小时不失活,
3) 最适合用于聚合酶链反应(PCR)。
4.逆转录酶
特点
逆转录酶是一个多功能性酶,至少具有以下3种酶 活性: ⑴
⑵
以单链RNA为模板, 催化合成cDNA单链
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
G CCTAG
+
GATCC
G
(2) 分类、作用
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ (基因工程技术中常用Ⅱ型)
与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统:限 制外源DNA,保护自身DNA,稳定细菌遗传性状。
(3)命名
EcoRⅠ
属 种 株 序 Escherichia coli RY13株
微生物基因工程制药
第一节 第二节 第三节 第四节
概述 基因工程基本技术与策略 基因药物生产的基本过程 基因工程药物制造实例
一、基因工程建立的基础
(一)、理论方面的三个重要的发现 1.生物遗传物质—DNA的发现
2. DNA双螺旋结构和半保留复制机理的建立
1953年,沃森(Watson) 和克里克 (Crick) 首次提出 了DNA双螺旋结构和半保留复制机理。这一重大发现大大 地促进了现代生物科学的发展。
(二)、基因工程的工具酶
克隆和进行基因操作需要对遗传物质进行剪切、修饰和连 接,这些过程都是在工具酶的催化下完成的。按功能将工 具酶分类,
可分为剪切酶类、 连接酶类和修饰酶类
如下所示
分子剪刀和分子针线
1.限制性核酸内切酶
(restriction endonuclease, RE)
(1) 定义
是一类由细菌产生的能专一识别和切割双链 DNA中的特定碱基序列的核酸内切酶,简称限制酶 或切割酶。
2.DNA克隆 在体外外来遗传物质与载体DNA结合成具自我复制的DNA分子, 通过转化或转染宿主细胞、筛选出转化子细胞,再扩增提取 获得大量同一DNA分子,即DNA克隆又称重组DNA。
3.目的基因 有时应用重组DNA技术的分离、获得某一感兴趣的基因或 DNA序列,有时是为获得感兴趣基因的表达产物--蛋白质。 4.基因载体 也称克隆载体。这是为“携带”感兴趣的外源DNA、实现 外源DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些 DNA分子。其中,为使插入的外源DNA序列可转录、进而翻 译成多肽链而设计的克隆载体又称表达载体。可充当克隆 载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。
具有RNase H 活性,能水解RNA:DNA杂交链中的 RNA
⑶
以DNA为模板,催化合成cDNA双链。
逆转录酶的应用:
⑴ ⑵ ⑶ ⑷ ; 代替Klenow酶用于DNA序列分析; 制备杂交探针等。
1972年,美国斯坦福大学Berg研究小组利用限制性内切酶 EcoR I 和T4 DNA连接酶成功地进行了首例体外基因重组实验。
1973年,科恩(Cohen) 等人用EcoR I内切酶处理 大肠杆菌的抗四环素和抗 青霉素及磺胺的质粒,并 连接成一个新的重组质粒。 将这种工程化的质粒转入 大肠杆菌,在含有四环素 和青霉素的平板中筛选重 组菌落。 同年,加利福尼亚的博耶 (Boyer)也进行了类似 的实验。 重组子转化的成功标志着 基因工程的诞生。
G + GATCC CCTAG G
A +GATCT A TCTAG
2. DNA聚合酶Ⅰ (全酶)
E.Coli DNA聚合酶Ⅰ(DNA pol Ⅰ) 是一个具有 3 种酶活性的多功能性酶。 包括: 5ˊ→3ˊDNA 聚合酶活性 5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性
3.TaqDNA聚合酶
3.遗传信息传递方式的确立
(二)、技术上三个重要成果
1.基因工程的工具酶
1966年,发现DNA连接酶。1970年Smith和Wilcox在流感嗜 血杆菌中分离并纯化限制性内切酶 Hind Ш,使DNA分子的 切割成为可能。1979年,Bltimore和Temin领导的两个研究 小组分别在各自的工作中发现了逆转录酶。