转基因番茄的研究进展

合集下载

番茄遗传转化影响因素及其应用研究进展

可达２０【。
老等功能，其食用价值和经济价值一直受到消费者青睐＿１］。同时，番茄生长周期短、基因组较小、遗传学基础雄厚，具有许多拟南芥、水稻等模式植物所不具备的生物学现象（如果实的发育、成熟过程等）［引，而且番茄基因
北方园艺２ｏ１３（２ｏ）：１８５～１８９
・专题综述・
番茄遗传转化影响因素及其应用研究进展
贺玺强，徐恒戬，赵汝凤
（山东理工大学生命科学学院，山东淄博２５５０４９）
摘
要：该丈在介绍农杆菌介导的番茄遗传转化的影响因素和番茄转基因应用的基础上，重
‘ ＬＢＡ４４０４ ’ 菌株转化番茄的转化率高达８０， ‘ Ｃ５８Ｃ１ ’
转化率为４ｏ［， ‘ ＡＢＩ，转化率高达２４～８Ｏ［，
‘ ＧＶ３１０１ ’ 转化率高达４ＯＡ～６ｏ０＿６］， ‘ ＥＨＡ１０５ ’ 转化率
组已经完成测序，因此番茄已成为肉质果实植物遗传转
化研究的模式植物。
１．２番茄基因型番茄的再生和转化均受到基因型影响，不同基因型
的番茄在相同浓度的激素条件下，再生率和转化率有很大的不同。陈珍等［。］研究了“ 中蔬４号” 、 ‘ Ｔ０１ ’ 和‘ Ｔ０３ ’
关键词：番茄；农杆菌介导；遗传转化；进展

转基因番茄植株中通过细菌酶的表达调控乙烯合成

转基因番茄植株中通过细菌酶的表达调控乙烯合成摘要：乙烯，作为一种植物激素，其合成对于植物的多种发育过程是至关重要的。

乙烯对于跃变型果实和蔬菜成熟过程的调控是其中最具特点的。

降低乙烯合成的方法之一是调控乙烯的直接前体物质，1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）。

土壤细菌中含有一种酶，称为ACC脱氨酶，这种酶可以使土壤细菌把ACC作为唯一氮源而生长。

编码ACC脱氨酶的基因已被成功转入番茄植株。

转基因植株中乙烯合成的降低没有引起任何植物表征的改变。

但是，这些转基因植株结出的果实在成熟过程中却存在明显的延迟，而且，已经成熟的果实较没有转基因的植株果实会出现至少六周或者更长的时间才能软化。

这些结果都表明，ACC脱氨酶对于检验乙烯在植物诸多发育过程和应急过程具有重要作用，同时还可以检验对那些被乙烯调控成熟的过程的果实和蔬菜的保质期的影响。

引言乙烯是一种强有力的植物生长调控因子，影响多种生长发育过程，包括果实的成熟，衰老，以及应激反应。

尤其是在跃变型果实的成熟过程中具有重要作用。

乙烯合成和作用的化学抑制剂会使多种植物物种的果实成熟及花的衰老过程完全停止。

在分子水平上，乙烯被认为是能够诱导许多基因的表达，其中包括成熟和病原体反应过程中涉及的基因。

乙烯从S-腺苷甲硫氨酸通过中间物质ACC进而合成得到。

近期，编码ACC合成酶和ACC氧化酶的cDNA克隆成功。

这些后来的基因的cDNA反向表达就会导致乙烯合成的减少和减慢离体的番茄果实的成熟。

在植物中，对于乙烯合成抑制的效力，要去除外源性功能作用以及其他化学抑制剂的摄取，应该允许确定的实验可以阐明乙烯在不同发育过程和应激反应现象中起的精确作用。

在这里我们提供了一套系统来显示生长和生殖组织中的乙烯合成的下降，并描述其在番茄果实成熟过程中的影响。

结论对于ACC降解酶的克隆阻止乙烯合成的方法一般来说包括将乙烯前体，ACC，不可逆地降解，转化成非活性的复合物。

目前，对于乙烯在植物体中的生物合成的认识指出，ACC是生理条件下乙烯合成过程的中间代谢前体。

转基因番茄的机理及现状

转基因番茄的机理及现状
王傲雪;李景富
【期刊名称】《辽宁农业科学》
【年(卷),期】1998(000)006
【总页数】4页(P33-36)
【作者】王傲雪;李景富
【作者单位】东北农业大学;东北农业大学
【正文语种】中文
【中图分类】S641.201
【相关文献】
1.转基因番茄的研究现状及其产业化 [J], 常洪伟
2.测一测番茄玉米是否转基因——上海市转基因农产品检测技术有重大突破 [J], 石达祺
3.利用转基因标记NPTⅡ快速、规模化纯合转基因番茄 [J], 欧阳波;龙芳;张扬勇;叶志彪
4.转基因番茄的研究现状及其产业化 [J], 王傲雪;陈秀玲
5.转基因“身份证”问世—我国市场上出售的转基因大豆、油菜、玉米和番茄将首批获证 [J],
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

硕士论文--番茄LeEIN2基因的克隆及其功能研究

重庆大学硕士学位论文番茄LeEIN2基因的克隆及其功能研究姓名：汪佳申请学位级别：硕士专业：药物化学指导教师：陈国平20060401摘要乙烯作为一种内源性植物激素，对植物的生长发育有着重要影响。

目前，乙烯信号转导途径及其调控机理已成为植物分子生物学的研究热点。

EIN2基因处于乙烯信号转导途径的中心位置，作用于CTR1的下游，EIN3的上游。

EIN2不仅在乙烯信号转导中具有重要作用，还可能涉及其它植物激素和胁迫因子的信号转导。

因此，明确EIN2基因的功能及其参与信号转导的机制，是研究乙烯信号转导的一个重要内容。

番茄是研究果实成熟的模式植物，迄今为止国内外尚未见从番茄中分离和克隆全长EIN2基因。

对番茄EIN2基因的研究，将使我们对乙烯信号转导、果实成熟及环境胁迫中防卫反应相关基因调控的机理更加明确，为利用基因工程技术改良番茄等作物提供理论依据。

本文比较了GenBank中已登录的多种植物的EIN2基因的氨基酸序列和核苷酸序列，根据保守序列设计简并引物，利用RT－PCR和RACE技术，首次从普通番茄中，克隆出番茄LeEIN2基因的cDNA序列；采用LA PCR及Inverse PCR，从番茄基因组DNA中扩增出全长LeEIN2基因。

在GenBank中登录号分别为AY566238和DQ409173。

序列分析表明，LeEIN2DNA全长6838bp，有6个内含子；cDNA全长4343bp，包含一个长3951bp的开放阅读框，5’端非编码区和3’端非编码区分别为85bp、257bp。

该cDNA编码一个含有1316个氨基酸的膜结合蛋白，具有11个跨膜区域。

推测其蛋白质分子量为142.63kDa，等电点为6.48，与拟南芥及矮牵牛EIN2的氨基酸序列同源性分别为50.6%、86.0%。

利用Northern杂交技术分析LeEIN2基因的表达特性，结果显示LeEIN2基因在番茄幼叶中的表达水平明显高于成熟叶和衰老叶；在果实发育过程中，LeEIN2基因均有表达，在绿熟期和破色期表达水平达到最高峰，破色期以后表达水平迅速降低。

番茄育种现状及发展趋势研究

河南农业2023年第22期
茄抗病性。

3. 抗除草剂。

实践表明，番茄转基因法、杂交法和诱变育种等方法都能够培育出对除草剂具有良好抗性的品种。

4. 抗青枯病。

早在20世纪中旬，我国就已经开始着手培育对青枯病具有良好抗性的番茄，经过数十年的发展，现已成功培育出包括抗青1号和丰顺在内的多种番茄。

5. 抗TYLCVD。

TYLCVD 具有波及范围广、传播速度快等特点，科研人员利用传统育种、分子标记等方法，对可抵抗该病的品种进行培育。

在已培育出的品种中，最具代表性的是西大樱粉1号，研究人员以抗病樱桃番茄作父本、具有良好口感及形状的番茄作母本，成功培育出了兼具良好口感及抗病性的新品种。

育鲜食及加工品种进行选择，充分利用我国在育种方面所具有的优势，对拥有良好性状的番茄进行培育，增强番茄所具有的竞争力。

在此过程中，应当注意以下几点：一是单一抗性所能发挥的作用十分有限，应重点培育拥有复合抗性的番茄，其中，种植在保护地的番茄，应拥有3~4种抗性；露地种植的番茄，则应拥有2~3种抗性。

二是做到因地制宜，优先培育耐热及耐低温的品种。

（四）创新育种方法
种子作为农业生产不可或缺的材料，种子质量决定了农作物生长的质量及产量。

要以番茄的特点为依据，将生物技术与常规技术充分结合。

在保证育种质量的前提下，精简育种步骤，加快育种速度，实现稳产、高产，为番茄行业稳定、持续发展奠定良好基础。

（责任编辑程丽红）
LIANGZHONG LIANGFA
良种良法
Copyright ©博看网. All Rights Reserved.。

转基因番茄研究进展

转基因番茄研究进展摘要：利用转基因技术培育，已经获得延熟、抗病、抗虫、抗逆、抗除草剂和品质改良的转基因番茄，并主要介绍转基因技术在这些方面的研究成果和研究进展，此外简单介绍了转基因番茄的优势及其展望。

关键词：转基因番茄进展番茄（Lycopersicon eseulentem．Mil）是茄科( Solanaceae) 番茄属( Lycopersicon) 的一年生或多年生植物，是世界上重要的蔬菜作物之一。

番茄需求量大，种植广泛，同时对其的遗传理论研究较为深入，番茄已经成为蔬菜基因工程研究的模式植物之一，且在1994年成为世界上第一例商品化生产的转基因作物——转基因延熟番Flavr-SavrTM，其由美国Calgene公司培育成功并获准进入市场。

其后几年利用转基因技术培育出抗病虫害、抗除草剂、抗逆和高品质的优良番茄品种。

番茄的基因转化技术主要采用农杆菌介导的基因转化方法。

此外，黄永芬等[1]利用花粉管导入法进行番茄的基因转化，将整合了抗冻蛋白基因的Ti 质粒直接注入番茄子房或花粉管中进行转化获得了抗冻番茄。

1．转基因番茄研究进展1．1 延熟转基因番茄目前利用基因转化技术延熟番茄有两种方法，一是抑制细胞壁的降解，二是抑制乙烯的合成，在防止其腐烂方面取得了较好的效果。

1．1．1 抑制番茄细胞壁降解的研究细胞壁水解酶对果实的成熟有促进作用，通过抑制阻止细胞壁水解酶活性，可抑制果实细胞壁的降解，延缓成熟与衰老。

主要包括两类酶，一类是多聚半乳糖醛酸酶(PG)，可将细胞壁中的多聚半乳糖苷降解为低聚半乳糖苷，在果实成熟过程中，PG的mRNA水平可提高100倍。

叶志彪等[2]将PG基因的Hindfi 片段反向克隆在植物转化载体Bin19的花椰菜病毒( CaMV) 的35S启动子和3' 端非翻译区( nos) 终止子之间，经农杆菌与番茄无菌苗子叶外植体共培养，获得转化植株，这种转反义PG基因的番茄果实中，PGmRNA水平及PG酶活性在果实成熟阶段明显降低。

Micro-Tom番茄转基因植株再生体系的优化

第24卷第2期2018年4月（自然科学版）JOURNAL OF SHANGHAI UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE)Vol.24No.2Apr.2018DOI:10.12066/j.issn.1007-2861.1773Micro-Tom番茄转基因植株再生体系的优化邱实1,张文举1,许馥慧2,邓志瑞1(1.上海大学生命科学学院,上海200444;2.同济大学生命科学与技术学院,上海200092)摘要:转基因植株的再生频率较低一直是植物基因工程研究的瓶颈之一.以番茄的Micro-Tom突变体为材料,探索了外植体植物激素配比、预培养时间、共培养时间、筛选剂对愈伤组织发生和不定芽生长的影响.结果表明:子叶比下胚轴更适合作为愈伤组织和不定芽诱导的外植体;当玉米素(zeatin,ZT)质量浓度为0.5mg/L,吲哚乙酸(indole acetic acid,IAA)质量浓度为1.0mg/L时最有利于不定芽诱导;外植体预培养的适宜时间为3d,农杆菌和外植体共培养的适宜时间为2d;外植体对卡那霉素的耐受上限为40mg/L,替门汀的适宜质量浓度为150mg/L.实验所建立的转基因再生体系为Micro-Tom番茄的遗传工程应用奠定了基础.关键词:Micro-Tom番茄;玉米素;替门汀;遗传转化;农杆菌中图分类号:S641.2文献标志码:A文章编号:1007-2861(2018)02-0322-09 System optimization for tomato Micro-Tom transgenicregenerationQIU Shi1,ZHANG Wenju1,XU Fuhui2,DENG Zhirui1(1.School of Life Sciences,Shanghai University,Shanghai200444,China;2.School of Life Sciences and Technology,Tongji University,Shanghai200092,China)Abstract:Low rediﬀerentiation frequency of transgenic plant is a major barrier in plant gene engineering.Tomato species Micro-Tom was used as the experimental material.Eﬀects of plant hormone combination,preculture time,and co-culture time of kanamycin and timentin on callusogenesis and adventitious bud growth were explored.The results show that cotyledon is more suitable than hypocotyledon as explants for callusogenesis and adventitous bud bination of0.5mg/L zeatin(ZT)with1.0mg/L indole acetic acid(IAA)brings about the highest adventitous bud induction.Suitable preculture time for explants is3d,and that for co-culture with Agrobacterium tumefaciens is2d.The upper tolerance limit of explant to kanamycin for selection is40mg/L and suitable timentin concentration for Agrobacterium tumefaciens inhibition is150mg/L.The estab-lished system may provide a good base for genetic engineering for Micro-Tom tomato.Key words:Micro-Tom tomato;zeatin(ZT);timentin;genetic transformation;Agrobac-terium tumefaciens番茄(Solanum lycopersicum)作为重要的模式植物,其基因组大小为950Mbp,共编码35000个基因,遗传学背景较为清楚.Micro-Tom是一种番茄突变体,具有生命周期短、株型收稿日期:2016-04-25通信作者:邓志瑞(1964—),男,副教授,博士,研究方向为植物生理与分子生物学.E-mail:dengzhirui@第2期邱实,等:Micro-Tom番茄转基因植株再生体系的优化323矮小,比普通番茄更适合用于遗传转化的特点[1-2].但与其他植物一样,Micro-Tom在遗传转化后往往出现愈伤组织和再生植株诱导频率下降的问题.这主要与所使用的遗传转化条件和植株再生体系有关.有研究表明,外植体的选用对于愈伤组织诱导和植株再生有较大的差异.卡那霉素常被用来筛选转基因阳性候选植株,但过高浓度的卡那霉素也会对候选植株的生长造成影响.不同的外植体所适用的浓度有所不同[3],一般用量为100∼200mg/L[4].在遗传转化体系中,往往选用羧苄青霉素或头孢霉素作为抑菌抗生素,用于抑制多余农杆菌和杂菌的生长,但因用量较大,在一定程度上也会抑制外植体的生长[5].替门汀作为相对较新的抑菌抗生素,其抑菌应用在选择培养过程中还处于早期尝试阶段.本实验选用番茄Micro-Tom的子叶和下胚轴作为外植体,以愈伤组织发生和不定芽的生长作为指标,对植物激素配比、预培养时间、共培养时间、抗生素浓度等参数进行了探索,初步建立了番茄Micro-Tom的遗传转化体系,为后续的遗传转化研究奠定了基础.1实验材料与方法1.1实验材料外植体来源与选择.首先将Micro-Tom种子(PanAmerican Seed公司)依次用75%乙醇、20%次氯酸钠和无菌水进行灭菌处理,然后将种子置于种子萌发培养基(1/2MS+3%蔗糖+0.2%植物凝胶)中进行培养.1周后种子萌发并生长到子叶期.选取幼苗子叶和下胚轴,分别切成0.5cm2的叶盘和0.5cm的茎段,置于预培养基中,使切口接触培养基.菌种、质粒与引物.用于转化的农杆菌株为ATHV(KWS种子公司),载体质粒为含抗卡那霉素的nptⅡ基因pGPTV-ESK1i(KWS种子公司).根据载体质粒的外源DNA片段(同一片段正向和反向插入在不同的位置)序列设计了用于鉴定转基因阳性植株的一对引物(由上海生工生物工程公司合成).正向引物pRNAintroF序列为5’-GGAAAATGTCGTGTTGTGGTC-3’;反向引物pRNAiterR序列为5’-CCTGCAGGTCACTGGATT-3’.两个引物间的片段长度为720bp,如果其聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)产物长度为720bp,就说明携带外源基因的质粒进入了植物组织.培养基的制备.MS培养基、1/2MS培养基购自于Phyto Technology公司;蔗糖、植物凝胶、吲哚乙酸(indole acetic acid,IAA)、玉米素(zeatin,ZT)、卡那霉素、替门汀等均购自于上海生工生物工程公司.激素和抗生素采用过滤灭菌,在培养基灭菌后且未冷却时加入.预培养基、共培养基、选择培养基、生根培养基的基本组分均为MS+3%蔗糖+0.2%植物凝胶.农杆菌的制备与侵染.将携带表达载体质粒的农杆菌单菌落置于YEB培养基中,28◦C 黑暗条件下震荡培养.OD600=1.0时收集菌体,悬浮于MS培养基中.侵染预培养后的外植体10min,并用无菌滤纸吸去外植体表面的多余菌液.将侵染后的外植体置于共培养基上,28◦C 避光培养.转基因植株的鉴定.DNA提取使用Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程公司),PCR反应使用即用型PCR扩增试剂盒(上海生工生物工程公司).1.2实验方法1.2.1ZT浓度对愈伤组织发生和不定芽生长的影响选取IAA作为组织培养的生长素,ZT作为细胞分裂素.培养基中保持IAA质量浓度为1.0mg/L不变[6],同时加入不同浓度的ZT进行配比组合.将子叶和下胚轴外植体置于培养基中,在温度25◦C,光照强度6000lx,光周期16h条件下进行培养.对比不同ZT浓度下愈伤324（自然科学版）第24卷组织和不定芽的生长情况,确定适宜愈伤组织和不定芽诱导的ZT浓度.1.2.2不同外植体愈伤组织形成和再分化的差异将子叶和下胚轴外植体置于MS培养基中,在温度25◦C,光照强度6000lx,光周期16h 条件下进行培养.每14d将外植体继代一次,连续培养6周.每天观察并记录生长情况.1.2.3预培养时间对外植体不定芽生长的影响在温度25◦C,光照强度6000lx,光周期16h条件下培养子叶外植体.分别在培养0,3, 5和7d后用农杆菌侵染,然后共培养和选择培养.待出芽情况稳定后,统计出芽的外植体数量,计算不定芽诱导率.1.2.4共培养时间对外植体不定芽生长的影响将5组经过侵染的子叶外植体分别共培养1,2,3,4和5d.每天观察外植体生长及农杆菌污染情况,将未长出农杆菌菌苔的子叶外植体转移至选择培养基继续培养.待出芽情况稳定(大约14d)后,统计出芽的外植体数量,计算不定芽诱导率.凡是共培养之后出现农杆菌的就认为是被污染,并计算污染率.1.2.5抗生素对愈伤组织发生和不定芽生长的影响将外植体直接接种到含不同浓度卡那霉素的MS培养基上.待出芽情况稳定后,统计愈伤组织形成率和不定芽诱导率,确定番茄遗传转化中用于筛选阳性株的卡那霉素浓度.将经过预培养、农杆菌侵染和共培养后的外植体,转至含不同浓度替门汀的MS培养基上,在温度25◦C,光照强度6000lx,光周期16h条件下进行培养.根据外植体不定芽诱导率,确定番茄遗传转化中用于抑菌的替门汀浓度.1.2.6再生植株的获得根据1.2.1∼1.2.5节所确定的实验条件,待不定芽长成2∼3cm的幼苗时,单独切下,转移至生根培养基(MS+1.0mg/L IBA+3%蔗糖+0.2%植物凝胶)上,每个培养瓶放置1∼2株.取生根的幼苗,洗净根部的琼脂后,移栽于装有草炭、蛭石和珍珠岩(体积比为3∶1∶1)的花盆中,并在上面加盖保湿薄膜,保持3∼5d,再逐渐揭去保湿薄膜,得到初步炼苗成功的番茄植株.将幼苗移至土壤中进行培养,直至生长稳定.1.2.7转基因阳性候选植株的鉴定随机选择转基因阳性候选植株的叶片,按照DNA抽提试剂盒说明书提取DNA,并使用引物pRNAiterR和pRNAintroF进行PCR鉴定.PCR反应程序如下:首先94◦C预变性5min;然后以94◦C变性30s、55◦C退火30s、72◦C延伸30s为一个循环,共进行35个循环;最后72◦C延伸10min.1.2.8数据处理愈伤组织形成率和不定芽诱导率的计算如式(1)和(2)所示.每组实验培养90个外植体,重复3次.显著性分析方法选用邓肯新复极差测验.愈伤组织形成率=产生愈伤组织的外植体数接种总外植体数×100%,(1)不定芽诱导率=分化出芽的愈伤组织数接种总外植体数×100%.(2)2结果与分析2.1ZT浓度对愈伤组织发生和不定芽生长的影响在不同的ZT浓度下,子叶和下胚轴诱导愈伤组织和不定芽的情况如表1所示.可以看出,子叶和下胚轴的愈伤组织诱导率随ZT浓度的增加而升高,但不定芽诱导率呈先升高后降低的第2期邱实,等:Micro-Tom番茄转基因植株再生体系的优化325趋势.这说明在一定浓度范围内,较高浓度的ZT有利于不定芽的分化,但ZT浓度过高对不定芽的诱导却产生了抑制作用.由表1可见,当ZT质量浓度在0.5mg/L时,子叶和下胚轴的不定芽诱导率都是最高的,与0.2mg/L ZT组和2.0mg/L ZT组存在显著差异.结果表明,不定芽分化适宜的培养基激素配比为1.0mg/L IAA+0.5mg/L ZT.表1ZT浓度对愈伤组织形成和再分化的影响Table1Eﬀects of ZT concentrations on callus formation and rediﬀerentiationZT浓度/(mg·L−1)愈伤组织诱导率/%不定芽诱导率/%子叶下胚轴子叶下胚轴0.291.11±2.94a97.8±1.11a78.89±4.01a76.67±1.11b0.598.89±1.11b100.00±0.00b87.78±2.94b81.11±5.09c1.0100.00±0.00b100.00±0.00b83.33±3.85ab72.22±6.19b2.0100.00±0.00b100.00±0.00b77.78±4.99a55.56±5.88a注:不同字母表示差异达到显著水平(P<0.05).2.2不同外植体愈伤组织形成和再分化的差异在同样条件下,子叶和下胚轴愈伤组织的形成和再分化有一定的差异(见表2),在愈伤组织和不定芽诱导以及生根所需时间上,前者都少于后者,分别为29和35d(前者比后者少了近六分之一).根据表1和2的实验结果可以确定,子叶比下胚轴更适合作为遗传转化体系所使用的外植体.表2愈伤组织形成和再分化所需要的培养时间Table2Time needed for callus formation and rediﬀerentiation d 外植体类型愈伤组织形成时间不定芽形成时间根形成时间子叶61529下胚轴81635注:培养基组分为MS+3%蔗糖+0.5mg/L ZT+1.0mg/L IAA+0.2%植物凝胶.2.3预培养时间对不定芽生长的影响表3为预培养天数对不定芽生长的影响.可见,预培养3d的外植体不定芽诱导率明显高于预培养0,5和7d,且分别是预培养0d的2.7倍,以及预培养5,7d的1.7倍.这说明不经过预培养或预培养时间过长均不利于不定芽的形成.因此,用于转化的外植体预培养的适宜时间为3d.表3预培养时间对不定芽生长的影响Table3Eﬀects of preculture time on adventitous bud growth预培养时间/d出芽外植体数/个不定芽诱导率/%07.33±2.088.15±2.31a319.67±4.7321.85±5.25b511.67±1.5312.96±1.70a711.33±2.3112.59±2.57a 注:(1)培养基组分为MS+3%蔗糖+0.5mg/L ZT+1.0mg/L IAA+0.2%植物凝胶;(2)不同字母表示差异达到显著水平(P<0.05).326（自然科学版）第24卷2.4共培养时间对不定芽生长的影响经过14d的选择培养,外植体不定芽诱导率及农杆菌污染率如表4所示.可以看出:共培养2d的外植体的不定芽诱导率最高,达26.3%,且没有出现农杆菌污染;共培养3d或更长时间的外植体,从共培养的第3天起,子叶切口处就开始褐化,培养基出现农杆菌菌落,不定芽诱导率降低.分析该现象的原因,可能是由于过度生长的农杆菌严重影响了外植体的生长,导致不定芽诱导率快速下降.而当共培养少于2d时,农杆菌对植物细胞不能有效转化,不定芽诱导率更低.根据上述结果,在遗传转化过程中,适宜的共培养时间为2d.表4共培养时间对不定芽生长的影响Table4Eﬀects of co-culture time on adventitous bud growth共培养时间/d不定芽诱导率/%污染率/%18.52±2.57a0.00±0.00a226.30±3.90c0.00±0.00a315.93±2.57b 1.11±0.64a412.96±1.70ab 6.30±2.80b513.33±1.93ab13.33±2.94c 注:(1)培养基组分为MS+3%蔗糖+0.5mg/L ZT+1.0mg/L IAA+0.2%植物凝胶;(2)不同字母表示差异达到显著水平(P<0.05).2.5抗生素对不定芽生长的影响抗生素对不定芽生长影响的统计结果如表5和6所示,其中CK表示对照组.从表5可以看出:随着卡那霉素浓度的增加,子叶外植体的不定芽诱导率显著下降;当卡那霉素浓度达到40mg/L时,子叶外植体生长停止,不定芽诱导率为0.根据上述结果,确定用于筛选抗性不定芽的卡那霉素浓度下限为40mg/L.表5卡那霉素对不定芽生长的影响Table5Eﬀects of kanamycin on adventitous bud growth卡那霉素浓度/(mg·L−1)出芽外植体数/个不定芽诱导率/% CK81.00±6.2590.00±6.94e1066.00±4.3673.33±4.84d2018.00±1.7320.00±1.93c30 6.00±1.00 6.67±1.11b400.00±0.000.00±0.00a500.00±0.000.00±0.00a 注:(1)培养基组分为MS+3%蔗糖+0.5mg/L ZT+1.0mg/L IAA+0.2%植物凝胶;(2)不同字母表示差异达到显著水平(P<0.05).由表6可知,外植体的不定芽诱导率随替门汀浓度的增加呈先升高后降低的趋势.当替门汀浓度较低时,培养基会出现较为明显的农杆菌污染.随着替门汀浓度的增加,污染率逐渐降低.当浓度达到150mg/L时,替门汀可以完全抑制农杆菌的生长,同时不定芽诱导率也最高.根据上述结果,确定遗传转化过程中用于抑菌目的的替门汀的适宜浓度为150mg/L.第2期邱实,等:Micro-Tom番茄转基因植株再生体系的优化327表6替门汀对不定芽生长的影响Table6Eﬀects of timentin on adventitous bud growth替门汀浓度/(mg·L−1)不定芽诱导率/%污染率/%CK40.00±6.78a53.33±7.78d5066.67±1.93bc16.67±1.93c10073.33±4.84cd 6.67±1.11b15076.67±6.67d0.00±0.00a20070.00±3.85bcd0.00±0.00a25063.33±2.22b0.00±0.00a 注:(1)培养基组分为MS+3%蔗糖+0.5mg/L ZT+1.0mg/L IAA+0.2%植物凝胶;(2)不同字母表示差异达到显著水平(P<0.05).2.6再生植株的获得再生植株的获得经历了愈伤组织诱导、不定芽发生、生根、生根后的移栽和炼苗等多个过程,整个培养过程的典型结果如图1所示,其中种子萌发培养基组分为1/2MS+3%蔗图1Micro-Tom番茄遗传转化的不同生长阶段Fig.1Diﬀerent growth stages of Micro-Tom tomato for genetic transformation328（自然科学版）第24卷糖+0.2%植物凝胶,预培养基和共培养基组分为MS+3%蔗糖+0.5mg/L ZT+1.0mg/L IAA+0.2%植物凝胶,选择培养基组分为MS+0.5mg/L ZT+1.0mg/L IAA+40mg/L卡那霉素+150mg/L替门汀+3%蔗糖+0.2%植物凝胶,生根培养基组分为MS+1.0mg/L IBA+3%蔗糖+0.2%植物凝胶.2.7转基因阳性候选植株的鉴定以T0转基因植株的总DNA为模板,用引物pRNAiterR和pRNAintroF进行PCR检测,结果如图2所示,其中1为空白对照,2为阳性对照,3∼10为T0转基因候选植株,M为DM5000marker.可见,转基因阳性植株扩增出与阳性对照相同的720bp的目的片段,未扩增出任何条带的为假阳性植株.根据上述结果,初步确定目的基因已整合到Micro-Tom番茄基因组中.图2T0转基因番茄目标基因的PCR检测Fig.2PCR detection of target gene in T0transgenic tomato3讨论植物不同组织器官因分化程度和生理生化基础不同,其脱分化和再生潜能也有所区别.在番茄上已有用根、叶、花药、子叶和下胚轴进行离体培养获得再生植株的报道[7-8].有研究表明,由番茄花药等分化程度较高的组织培养形成愈伤组织的分化率不高,而利用根培养则对培养基中必需元素的要求非常严格[9].番茄的子叶和下胚轴作为外植体均能形成完整植株.虽然子叶、下胚轴的成苗明显优于其他外植体,但成苗的早晚和正常苗的比率有很大差异[10].本实验进一步比较了子叶和下胚轴作为番茄组织培养外植体的差异,发现在同样的激素配比条件下,子叶的不定芽诱导率高于下胚轴,并且子叶形成愈伤组织的时间、出芽时间和生根时间均少于下胚轴.在组织培养过程中,外源植物激素的使用必不可少.许多学者对不同激素配比和浓度进行了实验,但因激素种类和配比差异较大,结果不尽一致.外植体分化芽的能力除了要求一定的激素浓度外,更取决于培养基中细胞分裂素和生长素的种类和比例.在番茄的再生体系研究中,最常见的细胞分裂素为ZT和6-苄基腺嘌呤(6-benzyl aminopurine,6-BA)[11].陈丽萍等[12]和欧阳波等[13]的研究表明,在番茄再生体系中,ZT的效果好于6-BA,其一般用量为0.1∼2.0mg/L.番茄再生体系研究常选用IAA作为生长素,报道的用量为0.02∼4.00mg/L[6].本实验主要研究了ZT作为细胞分裂素对番茄外植体生长的影响,确定了培养基中ZT和IAA 的适宜质量浓度分别为0.5和1.0mg/L.这与已有的激素配比[11]类似,但也有一定的差异.例如王傲雪等[11]认为,更高浓度的ZT(2.0mg/L)和更低浓度的IAA(0.2mg/L)有利于番茄外植体的不定芽再生,激素浓度的差异也可能是由于实验所用的番茄品系不同所引起的.有些植物在转基因再生过程中不需要预培养.例如烟草和豇豆的叶片外植体不论是否经过预培养,其转化率均没有差异.有些植物的外植体在农杆菌侵染之前需要进行预培养,但对第2期邱实,等:Micro-Tom番茄转基因植株再生体系的优化329于预培养时间的长短,目前还没有定论,通常由基因型和外植体的种类来确定.以番茄叶片作为外植体时,其转化过程中一般需要进行2d的预培养[14],预培养后的番茄叶片转化率高于未经预培养的叶片[15].本实验发现,在Micro-Tom的遗传转化过程中,预培养时间为3d时对不定芽诱导最有利.这与之前报道的2d时间有所差别,但比较接近.推测产生这种差异的原因是因为Micro-Tom与张赛群等[15]研究的番茄品种(A21等)不同.遗传转化使用的载体质粒通常会携带某种抗生素抗性基因,以便于在遗传转化的选择培养阶段筛选到转化植株.培养基中的抗生素浓度对于筛选结果至关重要,既要保证杀灭非转化的外植体,又要保证对转化的材料没有明显的影响.因此,在进行遗传转化前有必要了解外植体对筛选抗生素的耐受能力,确定选择培养基中加入抗生素的最低浓度,从而实现杀死未成功转化的外植体并保留转基因外植体的目的.卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素,它通过与植物细胞器叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合,从而在翻译过程中干扰蛋白质的合成,导致植物细胞死亡.在筛选时,非转化的细胞因不含该抗性基因而被抑制或杀死,而转化细胞由于获得了抗性,可以在含一定浓度的卡那霉素培养基上存活下来[16].张丽华等[3]比较了B01,B02, B03,B04这4个加工番茄品种对卡那霉素的耐受能力.结果表明,筛选番茄子叶、下胚轴外植体的卡那霉素适宜浓度约为75mg/L,并且子叶外植体相比下胚轴外植体对卡那霉素更为敏感.本实验结果也显示,Micro-Tom子叶外植体对卡那霉素更加敏感,当卡那霉素浓度为40mg/L时,即可完全抑制Micro-Tom子叶外植体的生长.在农杆菌介导的遗传转化中,常使用抑菌抗生素抑制转化后农杆菌的生长.因为共培养后,外植体的表面以及内部会残留农杆菌,容易发生污染,因此对于抑菌抗生素的选择,原则上要兼顾对农杆菌生长的有效抑制和对转化外植体再生的没有抑制.共培养之后,用于杀灭或抑制农杆菌的常用抗生素种类有羧苄青霉素(carbenecillin,Carb)、头孢霉素(cefotaxime,Cef)、替门汀等,其中Carb和Cef的应用最广泛.通常认为Cef可以抑制外植体的不定芽分化,Carb 能抑制根的形成[17].替门汀是一种新型的有效抑制农杆菌的特效抗生素,其组分为替卡西林钠及克拉维酸钾,二者质量比为15∶1.克拉维酸钾单独抗菌时作用甚微,这是因为多种革兰氏阳性菌(G+)和阴性菌(G−)都能产生β-内酰胺酶,这类酶能在青霉素作用于病原体之前将其破坏.替卡西林钠是一种β-内酰胺酶不可逆性高效抑制剂,通过阻断β-内酰胺酶破坏细菌的防御屏障,恢复细菌对克拉维酸钾的敏感性.因此,克拉维酸钾与替卡西林钠配合使用使替门汀成为具有广谱杀菌作用的抗生素[18].替门汀在抑制农杆菌的同时,对于植物材料的影响很小,特别适合较难转化材料的转基因[19].Cheng等[20]的研究结果表明,替门汀在烟草遗传转化中的使用浓度一般为500mg/L左右,但本实验结果表明,当替门汀浓度达到150mg/L时即可完全抑制外植体表面的农杆菌生长.推测原因可能是Cheng等[20]研究中使用的农杆菌菌株LBA4404与本实验中的菌株AHTV对替门汀的敏感程度不同.4结束语本实验优化了番茄Micro-Tom的转基因再生体系,为Micro-Tom的基因工程研究奠定了基础.除了本实验中的这些较为重要的因素外,植物遗传转化还受到许多其他因素的影响.因此,Micro-Tom的遗传转化体系还需要进一步深入研究.参考文献:[1]M eissner R,J acobson Y,M elamed S,et al.A new model system for tomato genetics[J].The Plant Journal,1997,12(6):1465-1472.330（自然科学版）第24卷[2]S cott J W.Micro-Tom—a miniature dwarf tomato[J].Florida Agric Exp Stn Circ,1989,370:1-6.[3]张丽华,许小勇,魏榕.加工番茄品种卡那霉素抗性的筛选[J].西北农业学报,2006,15(3):124-127.[4]罗素兰,陈若,长孙东亭.番茄组培苗的不同阶段对抗生素和PPT的抗性筛选试验[J].海南大学学报(自然科学版),2003,21(1):58-64.[5]杨亚萍,李永兰,梁月荣,等.发根农杆菌抑菌剂的抑菌效果及对茶组培苗丛生芽的影响[J].茶叶科学,2015,35(5):437-442.[6]B hatia P,A shwath N,S enaratna T,et al.Tissue culture studies of tomato(Lycopersiconesculentum)[J].Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2004,78(1):1-21.[7]卫志明,许智宏.番茄叶组织培养中植株再生的初步研究[J].植物生理学通讯,1979(1):10-11.[8]佟新萍.番茄幼叶愈伤组织诱导与再生植株[J].植物生理学通讯,1993,29(3):190-192.[9]李浚明,朱登云.植物组织培养教程[M].3版.北京:中国农业大学出版社,2005:128.[10]叶志彪,李汉霞.番茄子叶离体培养与再生成株[J].华中农业大学学报,1994,13(3):291-295.[11]王傲雪,赵越,陈秀玲,等.不同激素组合对番茄芽分化率的影响[J].东北农业大学学报,2013,44(7):85-90.[12]陈丽萍,张丽华,程智慧.加工番茄离体再生体系的建立[J].西北农业学报,2007,16(1):162-167.[13]欧阳波,李汉霞,叶志彪.玉米素和IAA对番茄子叶再生的影响[J].植物生理学通讯,2003,39(3):217-218.[14]王关林,方宏筠.植物基因工程[M].2版.北京:科学出版社,2009:85.[15]张赛群,叶志彪.异戊烯基转移酶基因导入番茄及转基因植株再生[J].园艺学报,1999,26(6):376-379.[16]N ap J P,B ijv J,司家钢.转基因植物中的卡那霉素抗性[J].生物技术通报,1998(1):29-31.[17]梁美霞,许向阳,李景富.抗生素对番茄愈伤组织诱导和分化的影响[J].东北农业大学学报,2005,36(1):19-22.[18]L abia R,M orand A,P eduzzi J.Timentin andβ-lactamases[J].Journal of AntimicrobialChemotherapy,1986,17(S1):17-26.[19]陆荣生,韩美丽,吴耀军,等.农杆菌介导AFT基因转入四季桔的研究[J].广东农业科学,2013,40(11):145-148.[20]C heng Z M,S chnurr J,K apaun J.Timentin as an alternative antibiotic for suppression ofAgrobacterium tumefaciens in genetic transformation[J].Plant Cell Reports,1998,17(8):646-649.本文彩色版可登陆本刊网站查询:。

转基因番茄的可见近红外光谱快速无损检测方法

转基因番茄的可见近红外光谱快速无损检测方法一、本文概述随着生物技术的快速发展，转基因技术在农业领域的应用日益广泛，转基因作物的商业化种植已经成为全球趋势。

然而，转基因作物的安全性和品质问题一直备受公众关注。

为了实现对转基因作物的有效监管和品质评估，无损检测技术的研究和应用显得尤为重要。

本文旨在探讨利用可见近红外光谱技术，对转基因番茄进行快速无损检测的方法，以期为转基因作物的品质控制和安全监管提供新的技术手段。

转基因番茄作为转基因作物的一种，其基因结构的改变可能导致光谱特性的变化。

可见近红外光谱技术作为一种非破坏性的检测方法，能够反映物质内部的结构信息，因此在转基因作物的检测中具有潜在的应用价值。

本文将详细介绍可见近红外光谱技术在转基因番茄检测中的应用原理、实验方法、数据处理以及结果分析等方面，为相关领域的研究提供参考和借鉴。

本文首先介绍转基因技术的背景、发展现状及其在农业领域的应用，然后阐述可见近红外光谱技术在作物检测中的应用原理和优势。

接着，本文将详细介绍实验材料、光谱采集设备、光谱预处理方法和数据分析方法，并通过实验验证可见近红外光谱技术在转基因番茄检测中的可行性和准确性。

本文将对实验结果进行讨论，分析可见近红外光谱技术在转基因番茄检测中的优势和局限性，并提出未来研究方向和建议。

通过本文的研究，希望能够为转基因作物的无损检测提供新的技术手段，为转基因作物的品质控制和安全监管提供科学依据，同时推动可见近红外光谱技术在农业领域的应用和发展。

二、文献综述转基因技术在现代农业中的应用越来越广泛，特别是在提高作物产量、增强抗病性、优化营养品质等方面发挥着重要作用。

然而，随着转基因作物的普及，其安全性和消费者接受度问题也日益受到关注。

因此，发展快速、无损的转基因作物检测方法对于确保食品安全、保护消费者权益具有重要意义。

近红外光谱技术作为一种快速、无损的检测方法，在农业和食品领域的应用逐渐受到重视。

该技术利用物质在近红外区域内的光谱特性，结合化学计量学方法，可以快速获取样品内部成分和结构信息。

转基因西红柿的发现及其历史

一．最早的转基因西红柿Flavr Savr 的出现及其发展的命运转基因西红柿是第一种上市的转基因食品。

以前，农民要趁西红柿还没有成熟，果实还是绿色的时候就采摘下来。

没有成熟的西红柿被运送到商店后，喷上乙烯将它们催熟，变成红色再摆出去卖。

这种人工催熟的西红柿没有自然成熟的西红柿好吃。

为什么不等西红柿成熟、变红再采摘呢？因为西红柿成熟后，皮也软了，运输过程中容易破。

能不能让成熟的西红柿皮不变软呢？西红柿的皮变软，是因为有一种叫做多聚半乳糖醛酸酶的酶把细胞壁中的胶质给分解了。

科学家们把编码这种酶的基因克隆出来，测定了它的序列。

然后合成一个和它相反的“反义基因”。

把“反义基因”转入到西红柿细胞中去，会干扰原来基因的活动，让它再也没有办法合成多聚半乳糖醛酸酶，细胞壁中的胶质不会被分解掉，西红柿即使成熟了，皮也不会变软。

我们就可以等到它自然成熟了再采摘，不用担心不好运输。

这样，自然成熟的转基因西红柿吃起来就要比人工催熟的普通西红柿好吃。

这种转基因西红柿不仅容易运输，而且可以存放很长时间也不会坏。

用转基因西红柿做的番茄酱比较稠，吃起来口感好，这是因为番茄酱的稠度和细胞壁中胶质的含量有关，胶质含量高，稠度也高。

还有，这种转基因西红柿不容易发霉，可以避免因为吃了发霉的西红柿而把霉菌分泌的毒素吃进去。

由于转入的“反义基因”只干扰聚半乳糖醛酸酶的基因，不会干扰其他基因，因此转基因西红柿的营养成分没有发生变化。

早在1994年，美国食品药品管理局就批准了转基因西红柿Flavr Savr上市，然而仅仅过了四年，1998年美国的市场上就再也见不到这种西红柿的踪影，无疾而终了！1987, Calgene公司研究人员克隆出多聚半乳糖醛酸酶基因并完成测序。

随后，转基因西红柿FLAVR SAVR研发成功。

1992，美国农业部批准种植FLAVR SAVR。

1994年，美国食品药品管理局批准FLAVR SAVR上市1996年到1999年，由于成本的下降，这种西红柿的售价减低了20%。

转基因番茄及其核酸检测技术研究进展

82
中国测试
2009 年 11 月
盟、日本、韩国、中国等国家和地区先后出台了转基因产品的标签制度，欧盟和日本等国确定了食品和饲料中因疏忽混入转基因材料的阈值水平，如欧盟为 0.9％，日本为 5％等，对转基因植物检测技术的番茄作为灵敏度和准确性提出了高标准严要求[1-2]。重要的 GMCs/GMF 之一，在我国已被列入第一批实施标识管理的农业 GMOs 目录，建立可与国际接轨的番茄转基因成分标准化检测手段已是必需。文章就全球转基因番茄及其转基因成分核酸检测的相关研究进展综述如下。
2
2.1
转基因番茄研究概况
转基因番茄的主要研究方向
番茄在全球广泛种植，是最早作为基因转化研究的高等植物之一，番茄基因转化技术主要采用根癌农杆菌介导方法。1994 年 Flavr Savr 延熟番茄成转基因为全球首例批准上市的转基因作物。目前，番茄主要研究方向，一方面集中在研发抗病毒 [3-5]、抗真菌及细菌[6-8]、抗虫[9-10]、抗除草剂[4]、抗盐碱[11-12]、抗冷[13-14]、延熟[14-15]等改良番茄新品系；另一方面，在当前传染性疾病尤其是人兽共患病依然肆意威胁
转基因番茄及其核酸检测技术研究进展人类和动物生命安全隋况下发展价廉易用的植物口服疫苗意义重大番茄资源丰富且属广为人们喜爱的果蔬类植物在此方面已显现良好的应用潜能而被广泛应用于疫苗及其他药用蛋白的生物反应器研究已在番茄成功表达了手足口病病毒ev71的病毒衣壳蛋白vp1tt61人乳头瘤病毒hpv16早期蛋白e7t切诺瓦克病毒衣壳蛋白n8聊乙肝病毒表面抗原hbsagtl霍乱毒素b亚单位23241狂犬病病毒g蛋白呼吸道合胞病毒f蛋白变形链球菌表面蛋白多肽i刎等多种病原体优势疫苗分子抗原等以及il一12t矧人表皮生长因子别等药用蛋白

农杆菌介导的番茄遗传转化的研究进展

农杆菌介导的番茄遗传转化的研究进展苗青;李正国;杨迎伍【摘要】番茄(Lycopersicon esculentum)传转化体系对其功能基因的研究和基因工程育种有重要影响,对农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的番茄遗传转化的研究进展进行了综述,主要包括影响番茄遗传转化效率的几个因素,如番茄的基因型、外植体状态、预培养和侵染过程、分化培养基中的激素和抗生素配比以及不同的外源基因等问题.并对今后的番茄遗传转化研究进行了展望.【期刊名称】《热带亚热带植物学报》【年(卷),期】2011(019)006【总页数】6页(P585-590)【关键词】番茄;遗传转化;农杆菌;研究进展【作者】苗青;李正国;杨迎伍【作者单位】重庆大学生物工程学院基因工程研究中心,重庆市高校功能基因与调控新技术重点实验室,重庆400030;重庆大学生物工程学院基因工程研究中心,重庆市高校功能基因与调控新技术重点实验室,重庆400030;重庆大学生物工程学院基因工程研究中心,重庆市高校功能基因与调控新技术重点实验室,重庆400030【正文语种】中文【中图分类】Q785植物遗传转化是将外源遗传物质导入植物受体细胞，使其在受体细胞中整合表达并且能够稳定遗传。

目前植物的遗传转化是植物基因工程的核心技术，该技术的建立和发展，使人们能够根据需求将特定的基因在不同种属植物之间进行表达，为植物改良提供了新的途径。

目前常见的植物遗传转化技术有以下几种：农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化法、基因枪法、显微注射法、PEG 法、花粉管通道法和超声波法等。

在这些方法中，农杆菌介导的遗传转化目前在植物中应用最广泛[1-2]。

番茄(Lycopersicon esculentum)是一种世界性种植的最重要的鲜食和加工原料。

它的基因组较小，是一种理想的模式植物[3]。

另外，番茄还具有自花授粉易于纯合、生长周期短(45～100 d)、在温室内可周年生长等优点，因而其遗传转化研究备受关注。

利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代

㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(４):１~８ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０４.００１收稿日期:２０２３－０４－２１基金项目:国家重点研发计划项目(２０２２ＹＦＤ１２００５００)ꎻ国家大宗蔬菜产业技术体系项目(ＣＡＲＳ－２３－Ａ０６)ꎻ国家自然科学基金项目(３１８７２９４９)作者简介:章力(１９９５ )ꎬ女ꎬ博士研究生ꎬ研究方向为番茄遗传育种ꎮＥ－ｍａｉｌ:９８７７２５９９９＠ｑｑ.ｃｏｍ通信作者:黄泽军(１９７４ )ꎬ男ꎬ湖南郴州人ꎬ研究员ꎬ博士生导师ꎬ研究方向为番茄遗传育种ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｈｕａｎｇｚｅｊｕｎ＠ｃａａｓ.ｃｎ利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代章力１ꎬ２ꎬ魏凯１ꎬ２ꎬ李珊珊１ꎬ宁宇１ꎬ路菲菲１ꎬ王孝宣１ꎬ国艳梅１ꎬ刘磊１ꎬ李鑫１ꎬ杜永臣１ꎬ李君明１ꎬ黄泽军１(１.中国农业科学院蔬菜花卉研究所/蔬菜生物育种全国重点实验室ꎬ北京㊀１０００８１ꎻ２.中国农业大学园艺学院ꎬ北京㊀１０００８１)㊀㊀摘要:转基因技术有助于番茄基因功能研究和遗传改良ꎬ其中转基因后代的筛选是一个非常重要但工作量大的环节ꎮ本研究基于番茄油体蛋白基因家族序列分析和番茄基因表达数据库ＳＧＮ－ＴＥＡ搜索结果ꎬ克隆了一个种子特异且高水平表达的油体蛋白基因ＳｌＯＬＥ１(Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０)ꎮ利用无缝克隆的方法将红色荧光蛋白基因ＴａｇＲＦＰ的编码区序列插入到ＳｌＯＬＥ１基因的终止密码子前ꎬ形成一个嵌合基因ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰꎮ将嵌合基因插入到ｐＢＩ１２１双元载体ꎬ构建植物表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰꎬ利用农杆菌介导法转化番茄品种ＭｏｎｅｙＭａｋｅｒ ꎬＴ０代植株的自交种子在荧光显微镜下呈现出明亮红色荧光或无荧光ꎮＰＣＲ分子标记进一步验证发现ꎬ红色荧光种子萌发的幼苗均存在ＴａｇＲＦＰ序列ꎬ表明在种子阶段检测红色荧光筛选转基因番茄后代的准确率为１００％ꎮ由此ꎬ本研究建立了一种利用ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因ꎬ可以通过种子红色荧光可视化分析ꎬ简单快速㊁低成本地鉴定转基因番茄后代的方法ꎮ关键词:番茄ꎻ种子ꎻ红色荧光蛋白ꎻ油体蛋白ꎻ转基因鉴定中图分类号:Ｓ６４１.２:Ｑ７８１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０４－０００１－０８ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＴｏｍａｔｏＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＯｆｆｓｐｒｉｎｇｗｉｔｈＲｅｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＭａｒｋｅｒｏｆＳｅｅｄｓＺｈａｎｇＬｉ１ꎬ２ꎬＷｅｉＫａｉ１ꎬ２ꎬＬｉＳｈａｎｓｈａｎ１ꎬＮｉｎｇＹｕ１ꎬＬｕＦｅｉｆｅｉ１ꎬＷａｎｇＸｉａｏｘｕａｎ１ꎬＧｕｏＹａｎｍｅｉ１ꎬＬｉｕＬｅｉ１ꎬＬｉＸｉｎ１ꎬＤｕＹｏｎｇｃｈｅｎ１ꎬＬｉＪｕｎｍｉｎｇ１ꎬＨｕａｎｇＺｅｊｕｎ１(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅｓａｎｄＦｌｏｗｅｒｓꎬＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＶｅｇｅｔａｂｌｅＢｉｏｂｒｅｅｄｉｎｇꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００８１ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅꎬＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０００８１ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｈａｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄｔｏｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｔｕｄｉｅｓａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｔｏｍａｔｏ.Ｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｏｆｆｓｐｒｉｎｇｉｓａｃｏｓｔ/ｌａｂｏｒ￣ｉｎｔｅｎｓｉｖｅａｎｄｔｉｍｅ￣ｃｏｎｓｕｍｉｎｇｐｒｏｃｅｓｓ.Ｗｅｃｌｏｎｅｄａｓｅｅｄ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｏｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅＳｌＯＬＥ１(Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０)ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｏｍａｔｏｏｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅｆａｍｉｌｙａｎｄａｓｅａｒｃｈｉｎｔｈｅｔｏｍａｔｏｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｄａｔａｂａｓｅＳＧＮ￣ＴＥＡ.ＴｈｅｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅＴａｇＲＦＰｗａｓｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｕｐｓｔｒｅａｍｏｆｔｈｅｓｔｏｐｃｏｄｏｎｏｆＳｌＯＬＥ１ｇｅｎｅｔｏｐｒｏｄｕｃｅａｃｈｉｍｅｒｉｃｇｅｎｅＳｌＯＬＥ１￣ＴａｇＲＦＰꎬｗｈｉｃｈｗａｓｔｈｅｎｉｎｓｅｒｔｅｄｉｎｔｏｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒｐＢＩ１２１ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｐｌａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＳｌＯＬＥ１￣ＴａｇＲＦＰ.Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗａｓｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏｔｏ￣ｍａｔｏｖａｒｉｅｔｙＭｏｎｅｙＭａｋｅｒｂｙＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｍｅｔｈｏｄ.Ｔｈｅｓｅｅｄｓｆｒｏｍｓｅｌｆ￣ｃｒｏｓｓｅｄＴ０ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｐｌａｎｔｓｄｉｓｐｌａｙｅｄｂｒｉｇｈｔｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｏｒｎｏｔｕｎｄｅｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ.ＦｕｒｔｈｅｒｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｈＰＣＲｍｏｌｅｃｕ￣ｌａｒｍａｒｋｅｒｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＴａｇＲＦＰｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｐｒｅｓｅｎｔｉｎｔｈｅｓｅｅｄｌｉｎｇｓａｒｉｓｉｎｇｆｒｏｍｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｅｅｄｓꎬｉｎｄｉｃａ￣ｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅａｃｃｕｒａｃｙｏｆｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｍａｔｏｐｒｏｇｅｎｙｂｙｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｔｓｅｅｄｓｔａｇｅｗａｓ１００％.Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬｔｈｉｓｓｔｕｄｙｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｓｉｍｐｌｅꎬｆａｓｔａｎｄｌｏｗ￣ｃｏｓｔｍｅｔｈｏｄｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｍａｔｏｏｆｆｓｐｒｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈｓｅｅｄｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｕｓｉｎｇＳｌＯＬＥ１￣ＴａｇＲＦＰｃｈｉｍｅｒｉｃｇｅｎｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＴｏｍａｔｏꎻＳｅｅｄꎻＲｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎꎻＯｌｅｏｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎꎻＴｒａｎｓｇｅｎｉｃｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ㊀㊀转基因技术以及借助转基因的基因编辑技术ꎬ促进了植物基因功能研究ꎬ而且有助于改良植物性状和培育优良新品种ꎮ植物遗传转化后ꎬ转化植株及其后代中外源ＤＮＡ的检测是一个十分必要的环节ꎬ但工作量大㊁效率有待提高ꎮ在植物的遗传转化工作中ꎬ常借助选择基因和报告基因筛选转基因植株ꎮ以卡那霉素(ｎｐｔＩＩ)和潮霉素(ｈｐｔ)等抗生素或者ＥＰＳＰＳ和Ｂａｒ等除草剂抗性基因作为选择基因进行筛选[１－２]ꎬ不同植物材料对筛选剂所需的最适浓度差别较大ꎬ会出现假阳性结果ꎬ甚至有时会影响植株的正常生长ꎮ利用ＧＵＳ作为报告基因筛选时ꎬ需要对转基因植株组织进行ＧＵＳ染色检测[３]ꎬ会破坏植物组织ꎮＦＡＳＴ(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇｓｅｅｄｔｅｃｈｎｏｌ￣ｏｇｙ)是一种通过种子特异性启动子驱动荧光融合蛋白表达ꎬ利用种子荧光快速筛选转基因植株的方法ꎬ最早应用于模式植物拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ)[４]ꎮ荧光蛋白是一类在特定波长下激发强烈荧光的蛋白质ꎬ可作为报告基因用于检测基因特异性表达和融合蛋白分子的定位㊁迁移㊁构象变化以及分子间的相互作用[５－９]ꎮ红色荧光蛋白(ｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＲＦＰ)是从海葵(Ｄｉｓｃｏｓｏ￣ｍａｓｐｓｐ.)中分离出的与绿色荧光蛋白(ｇｒｅｅｎｆｌｕｏ￣ｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＧＦＰ)同源的荧光蛋白[１０]ꎬ激发波长和发射波长均较长ꎬ其中ꎬＴａｇＲＦＰ的激发波长和发射波长分别为５５５ｎｍ和５８４ｎｍꎬ其亮度大约是ｍＣｈｅｒｒｙ蛋白的３倍ꎬ具有高ｐＨ稳定性和荧光寿命长等特点ꎬ是目前所报道的相对较亮的单体红色荧光蛋白[１１]ꎮＦＡＳＴ技术将荧光蛋白作为可视化筛选标记直接鉴定转基因种子ꎬ方法简便且不会对植株产生破坏ꎬ能够降低大面积种植的成本ꎬ有效提高筛选效率[４]ꎮ油体蛋白(ｏｌｅｏｓｉｎ)是一类特殊的贮藏蛋白ꎬ有些油体蛋白在植物种子中特异表达ꎮ当外源小分子量蛋白插入到油体蛋白的Ｎ端或Ｃ端后不会影响其表达和定位ꎬ且融合蛋白非常稳定[１２－１３]ꎮ番茄(Ｓｏｌａｎｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ)是一种具有重要经济价值的蔬菜作物ꎬ也是果实发育基础研究的模式植物ꎮ转基因技术和基因编辑技术已经大量应用于番茄基础研究和性状改良ꎬ然而传统的方法无法在种子阶段区分转基因和非转基因材料ꎬ转基因后代鉴定效率比较低ꎮ本研究参考ＦＡＳＴ技术ꎬ利用番茄种子特异且高水平表达的油体蛋白基因ＳｌＯＬＥ１启动子驱动ＴａｇＲＦＰ融合蛋白表达ꎬ利用种子红色荧光快速有效筛选番茄转基因后代ꎬ为后续的基因功能研究和性状改良带来便利ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀植物材料与菌株番茄品种ＲｉｏＧｒａｎｄｅ来自美国俄亥俄州立大学ＥｓｔｈｅｒｖａｎｄｅｒＫｎａａｐ实验室ꎬ于２０２０年种植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所南区温室ꎮ番茄品种ＭｏｎｅｙＭａｋｅｒ (ＭＭ)的种子由中国农业科学院蔬菜花卉研究所番茄遗传育种课题组扩繁保存ꎮ大肠杆菌ＤＨ５α和农杆菌ＧＶ３１０１购自上海唯地生物技术有限公司ꎮ１.２㊀番茄油体蛋白的鉴定与分析根据拟南芥油体蛋白研究结果[１４－１６]ꎬ从ＴＡＩＲ(ｔｈｅａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｒｅｓｏｕｒｃｅ)数据库下载１７个拟南芥油体蛋白序列ꎮ以拟南芥油体蛋白序列为查询序列ꎬ采用ＢＬＡＳＴＰ(ｅ－ｖａｌｕｅ<１Ｅ－５)在茄科基因组数据库ＳＧＮ(ｓｏｌａｎａｃｅａｅｇｅ￣ｎｏｍｉｃｓｎｅｔｗｏｒｋ)中检索番茄油体蛋白ꎮ从ＮＣＢＩ数据库获得水稻(Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ)油体蛋白序列ꎮ利用ＣｌｕｓｔａｌＷ软件进行番茄㊁拟南芥和水稻油体蛋白多序列比对ꎬ使用ＭＥＡＧ－Ｘ软件㊁采用最大似然法(ｍａｘｉｍｕｍｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ)构建油体蛋白序列的进化树ꎮ利用番茄果实发育成熟高分辨率时空转录图谱数据库ＳＧＮ－ＴＥＡ(ｈｔｔｐｓ://ｔｅａ.ｓｇｎ.ｃｏｒｎｅｌｌ.２山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀ｅｄｕ/)分析油体蛋白基因在成熟期果实组织的表达模式ꎮ１.３㊀ＴａｇＲＦＰ和番茄油体蛋白基因的克隆以中国农业科学院蔬菜花卉研究所张金喆老师惠赠的含红色荧光蛋白基因ＴａｇＲＦＰ编码序列的番茄ＤＮＡ为模板ꎬ使用引物ＺＰ３１１ꎬ利用高保真聚合酶预混液ＡｐｅｘＨＦＦＬＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ(艾科瑞生物)ꎬ对ＴａｇＲＦＰ进行ＰＣＲ扩增ꎮ反应程序为:９４ħ１ｍｉｎꎻ９８ħ１０ｓꎬ６０ħ１５ｓꎬ６８ħ１ｍｉｎꎬ３５个循环ꎮ以ＣＴＡＢ法[１７]提取的番茄品种ＲｉｏＧｒａｎｄｅ幼嫩叶片的基因组ＤＮＡ为模板ꎬ使用引物Ｏｌｅ００２扩增番茄油体蛋白基因ＳｌＯＬＥ１(Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０)全长序列ꎮ引物序列见表１ꎮＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测后ꎬ采用ＥａｓｙＰｕｒｅ®ＱｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ(全式金)进行胶回收纯化ꎮＴａｇＲＦＰ和ＳｌＯＬＥ１的回收产物均与ＢｌｕｎｔＺｅｒｏ克隆载体(全式金)连接ꎬ转化至ＤＨ５α感受态细胞ꎬ挑选阳性克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序ꎮ表１㊀基因克隆引物引物名称正向引物序列(５'－３')反向引物序列(５'－３')ＺＰ３１１ＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＡＣＴＡＴＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＡＧＣＴＣＡＣＴＴＧＴＧＣＣＣＣＡＧＯｌｅ００２ＧＡＣＧＡＡＴＧＧＡＴＴＡＡＴＧＴＧＧＴＴＣＣＧＣＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＴＧＴＣＴＡＴＡ１.４㊀种子ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ红色荧光表达载体的构建根据ＳｌＯＬＥ１克隆载体序列和ＴａｇＲＦＰ编码序列ꎬ采用软件ＣＥＤｅｓｉｇｎ设计无缝克隆引物(表２)ꎮ无缝克隆采用ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓⅡＯｎｅＳｔｅｐＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ(诺唯赞)ꎬ反应条件为３７ħ连接３０ｍｉｎꎮ以Ｓｌ￣ＯＬＥ１基因克隆载体为模板ꎬ使用引物Ｌｉｎｅ００５进行反向ＰＣＲꎻ以ＴａｇＲＦＰ克隆载体为模板ꎬ使用引物Ｉｎｓｅｒｔ００５扩增ＴａｇＲＦＰ编码序列ꎮ分别对ＰＣＲ产物进行胶回收纯化ꎬ然后进行无缝克隆ꎬ将ＴａｇＲＦＰ编码序列插入到ＳｌＯＬＥ１基因终止密码子前面ꎬ构建ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因克隆载体Ｂｌｕｎｔ－ＯＲꎬ嵌合基因序列中仅保留１个终止密码子ꎮ使用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ限制性内切酶对ｐＢＩ１２１植物双元表达载体(华越洋)进行双酶切ꎬ以克隆载体Ｂｌｕｎｔ－ＯＲ为模板ꎬ使用引物Ｉｎｓｅｒｔ０１０扩增ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因片段ꎬ胶回收纯化后与ｐＢＩ１２１双酶切产物进行无缝克隆ꎬ构建表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰꎮ表２㊀无缝克隆引物引物名称正向引物序列(５ᶄ－３ᶄ)反向引物序列(５ᶄ－３ᶄ)Ｌｉｎｅ００５ＧＣＴＡＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＡＣＴ￣ＴＣＴＡＧＡＴＴＴＡＧＴＣＴＧＡＴＧＧＧＴＴＣＣＡＧＴ￣ＧＡＴＧＴＧＩｎｓｅｒｔ００５ｔｃａｃｔｇｇａａｃｃｃａｔｃａｇａｃｔＡＴＧＡＧ－ＣＧＡＧＣＴＧＡＴＴＡＡＧＧＡＧＡＡａａｇｔａｇａｇａｇｔａｇｃｇｃｔａｇｃＴＣＡＣＴＴ￣ＧＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＴＧＣＩｎｓｅｒｔ０１０ｇａｃｃａｔｇａｔｔａｃｇｃｃａａｇｃｔｔＧＡＣＧＡＡＴＧ￣ＧＡＴＴＡＡＴＧＴＧＧＴＴＣＡＡａａａａｃｇａｃｇｇｃｃａｇｔｇａａｔｔｃＣＧ￣ＣＡＡＣＴＧＡＣＴＴＣＡＴＧＴＣ￣ＴＡＴＡＴＡＡＡＡＧ１.５㊀种子ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ红色荧光表达载体的遗传转化利用冻融法将表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ转入农杆菌ＧＶ３１０１ꎬ通过农杆菌介导法进行番茄ＭＭ子叶的遗传转化ꎮ遗传转化方案参照文献[１８]ꎬ将ＭＭ的种子消毒后置于１/２ＭＳ培养基ꎬ待子叶展开且真叶尚未长出时剪下子叶ꎬ在Ａ１培养基中暗培养２ｄ后进行侵染ꎬ侵染的子叶继续在Ａ１培养基中培养２ｄꎬ经Ａ２培养基诱导得到愈伤组织和分化的芽ꎬＡ３培养基分化培养得到小苗ꎬ最后由Ａ４培养基生根培养得到生根小苗后移栽至中国农业科学院蔬菜花卉研究所北圃场玻璃温室ꎮ１.６㊀转基因番茄的ＰＣＲ检测和种子荧光鉴定提取转基因番茄植株的ＤＮＡꎬ根据表达载体中ＴａｇＲＦＰ两侧序列设计引物Ｏ＋Ｒ－７(Ｆ:ＧＧＴＡ￣ＡＧＣＧＴＧＴＴＡＴＣＧＴＧＧＡꎻＲ:ＡＴＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣＣＴＣＧ￣ＴＡＧＣ)ꎬＰＣＲ检测Ｔ０代植株中是否插入ＴａｇＲＦＰ基因序列ꎮ将Ｔ０代阳性转基因植株自交授粉收获的干燥种子ꎬ置于徕卡体视荧光显微镜(ＬｅｉｃａＭＺ１０Ｆ)下进行荧光成像和拍照ꎮ挑选呈现荧光和无荧光的种子分别催芽ꎬ真叶长出后提取ＤＮＡꎬ进一步通过ＰＣＲ验证番茄转基因后代中是否含有ＴａｇＲＦＰ基因ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀番茄油体蛋白基因分析在ＳＧＮ数据库中检索到番茄中有９个油体蛋白编码基因ꎬ分别是Ｓｏｌｙｃ０２ｇ０８６４９０㊁Ｓｏｌｙｃ０３ｇ１１２４４０㊁Ｓｏｌｙｃ０３ｇ１１９８２０㊁Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０㊁Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０６０８４０㊁Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０６９２６０㊁Ｓｏｌｙｃ０８ｇ０６６０４０㊁Ｓｏｌｙｃ０８ｇ０７８１６０和Ｓｏｌｙｃ１２ｇ０１０９２０ꎮ在ＮＣＢＩ数３㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀章力ꎬ等:利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代据库中检索到６个水稻油体蛋白编码基因:Ｏｓ０１ｇ０６４３９００㊁Ｏｓ０３ｇ４９１９０㊁Ｏｓ０４ｇ０５４６５００㊁Ｏｓ０５ｇ０５７６７００㊁Ｏｓ０６ｇ０４７３８００和Ｏｓ０９ｇ０３２４０００ꎮ为了明确番茄㊁拟南芥和水稻油体蛋白之间的亲缘关系ꎬ对番茄９个㊁拟南芥１７个和水稻６个的油体蛋白构建分子进化树(图１Ａ)ꎮ在进化树中ꎬ番茄油体蛋白基因Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０与拟南芥中的ＡＴ４Ｇ２５１４０(ＡｔＯＬＥ１)和ＡＴ５Ｇ５１２１０基因以及水稻的Ｏｓ０９ｇ０３２４０００(ＯｓＯＬＥ４)和Ｏｓ０４ｇ０５４６５００(ＯｓＯＬＥ３)基因亲缘关系最近ꎮＡＴ４Ｇ２５１４０(ＡｔＯＬＥ１)是拟南芥种子中最丰富的油体蛋白[１９]ꎮ利用自身启动子分别驱动ＡＴ４Ｇ２５１４０(ＡｔＯＬＥ１)㊁Ｏｓ０９ｇ０３２４０００(ＯｓＯＬＥ４)基因与ＧＦＰ基因的融合蛋白基因表达ꎬ可使转基因拟南芥和水稻的种子呈现出绿色荧光[２０]ꎮ随后检索番茄基因表达数据库ＳＧＮ－ＴＥＡ(ｈｔｔｐｓ://ｔｅａ.ｓｇｎ.ｃｏｒｎｅｌｌ.ｅｄｕ/)ꎬ发现Ｓｏｌｙｃ０３ｇ１１２４４０㊁Ｓｏｌｙｃ１２ｇ０１０９２０和Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０基因在红熟期种子中的表达量居前三ꎬＲＰＭ值分别为２１１４.９４㊁１７１９.４１和１１８５.１５ꎮ由于Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０在番茄红熟期果实的其他组织中几乎不表达(图１Ｂ)ꎬ且其编码蛋白与拟南芥ＡＴ４Ｇ２５１４０(ＡｔＯＬＥ１)和水稻Ｏｓ０９ｇ０３２４０００(ＯｓＯＬＥ４)蛋白序列相似性最高ꎬ因此ꎬ推测Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０基因(以下简称ＳｌＯＬＥ１)启动子可以驱动融合蛋白在番茄种子中表达ꎮ图１㊀番茄㊁拟南芥和水稻的油体蛋白进化树(Ａ)及番茄ＳｌＯＬＥ１基因在红熟期果实和㊀㊀总果皮的表达模式(Ｂ)(基因表达数据来自ｈｔｔｐｓ://ｔｅａ.ｓｇｎ.ｃｏｒｎｅｌｌ.ｅｄｕ/)２.２㊀种子红色荧光表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ构建以番茄ＲｉｏＧｒａｎｄｅ的ＤＮＡ为模板ꎬ经引物Ｏｌｅ００２扩增得到长度为４００４ｂｐ的ＳｌＯＬＥ１基因全长片段(图２Ａ)ꎬ其中含启动子和终止子序列长度各约１.７ｋｂꎮ利用引物ＺＰ３１１扩增ＴａｇＲＦＰ编码区序列(７１５ｂｐꎬ图２Ｂ)ꎮＰＣＲ扩增片段分别连入ＢｌｕｎｔＺｅｒｏ克隆载体ꎬ测序后获得序列正确的克隆载体Ｂｌｕｎｔ－ＳｌＯＬＥ１和Ｂｌｕｎｔ－ＴａｇＲＦＰꎮ将质粒Ｂｌｕｎｔ－ＳｌＯＬＥ１通过反向ＰＣＲ线性化(引物Ｌｉｎｅ００５ꎬ表２)ꎬ与质粒Ｂｌｕｎｔ－ＴａｇＲＦＰ为模板的ＰＣＲ产物的胶回收纯化产物(引物Ｉｎ￣ｓｅｒｔ００５ꎬ表２)进行无缝克隆ꎬ成功在ＳｌＯＬＥ１基因终止密码子前面插入ＴａｇＲＦＰ编码区序列ꎬ获得重组质粒Ｂｌｕｎｔ－ＯＲꎮ将ｐＢＩ１２１双元载体的ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双４山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀酶切产物ꎬ与质粒Ｂｌｕｎｔ－ＯＲ为模板的ＰＣＲ产物的胶回收纯化产物无缝克隆(引物Ｉｎｓｅｒｔ０１０ꎬ表２)ꎮ无缝克隆产物转化大肠杆菌ＤＨ５αꎬ利用引物ＺＰ３１１进行菌液ＰＣＲ鉴定ꎬ以Ｂｌｕｎｔ－ＴａｇＲＦＰ质粒为阳性对照ꎬ有９份菌液扩增出条带ꎬ大小约为７１５ｂｐꎬ其中菌液ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ－１４的测序结果完全正确ꎬ成功构建种子红色荧光表达载体ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ(图２Ｃ㊁图３)ꎮＭ:ＤＮＡ分子量参考ꎻ阳:Ｂｌｕｎｔ－ＴａｇＲＦＰ质粒阳性对照ꎮ图２㊀ＳｌＯＬＥ１基因全长(Ａ)㊁ＴａｇＲＦＰ编码区片段(Ｂ)以及ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ菌液(Ｃ)的ＰＣＲ扩增图３㊀ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ表达载体示意图２.３㊀ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ转基因阳性番茄植株获得将ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ质粒转入农杆菌ＧＶ３１０１ꎬ以番茄ＭＭ的子叶为外植体进行侵染ꎬ经组织培养共获得４５个再生植株ꎮ以转基因植株的ＤＮＡ为模板ꎬ使用引物Ｏ＋Ｒ－７对ＴａｇＲＦＰ基因进行ＰＣＲ检测ꎮ以ｐＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ质粒为阳性对照ꎬ野生型ＭＭ为阴性对照ꎬ水为空白对照ꎬ结果(图４)显示ꎬ有８株Ｔ０代番茄植株的扩增产物与野生型ＭＭ一致ꎬ为单一条带ꎬ表明没有插入ＴａｇＲＦＰ基因ꎻ其余３７株均扩增出杂合条带ꎬ表明成功插入了ＴａｇＲＦＰ编码区序列ꎬ遗传转化效率达到８２.２２％ꎮ图４㊀ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰＴ０代转基因植株的ＰＣＲ鉴定２.４㊀转基因番茄后代种子红色荧光观察及ＰＣＲ鉴定挑选９株生长健壮的ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ阳性转基因番茄幼苗ꎬ移栽至玻璃温室ꎬ振荡自交授粉ꎮ将Ｔ０代植株自交种子干燥后置于徕卡体视荧光显微镜下ꎬ以野生型ＭＭ的种子为阴性对照ꎬ分别在明场和荧光光源下检测ＴａｇＲＦＰ信号ꎮ结果(图５)显示ꎬ在明场下ꎬ野生型ＭＭ和转基因干燥种子颜色无明显差异ꎻ在荧光下ꎬ野生型种子均无红色荧光ꎬ转基因种子部分呈现明亮红色荧光ꎮ表明ＴａｇＲＦＰ可以作为一种标记筛选出转基因番茄后代中的红色荧光种子ꎮ５㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀章力ꎬ等:利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代图５㊀野生型ＭＭ和Ｔ０代转基因植株自交种子的ＴａｇＲＦＰ荧光检测㊀㊀为了验证通过种子红色荧光检测番茄转基因后代的准确性ꎬ进一步播种转基因植株的红色荧光种子和无荧光种子各９６粒ꎬ使用引物Ｏ＋Ｒ－７进行ＰＣＲꎬ鉴定后代植株是否存在ＴａｇＲＦＰ序列ꎮ结果表明ꎬ９６株红色荧光种子萌发的幼苗扩增产物均为杂合条带ꎬ表明含有ＴａｇＲＦＰ编码区序列ꎬ而９６株无荧光种子萌发的幼苗扩增产物均为单一条带ꎬ表明不含ＴａｇＲＦＰ编码区序列ꎮ荧光种子和无荧光种子各１２粒萌发的幼苗ＰＣＲ检测结果如图６所示ꎬ表明通过种子红色荧光鉴定番茄转基因后代的准确率达１００％ꎮ图６㊀红色荧光(Ａ)和无荧光(Ｂ)种子的ＰＣＲ检测３㊀讨论与结论荧光蛋白有多种类型ꎬ其中ꎬ绿色荧光蛋白(ＧＦＰ)㊁蓝色荧光蛋白(ＢＦＰ)㊁青色荧光蛋白(ＣＦＰ)和黄色荧光蛋白(ＹＦＰ)等[２１－２４]的发射波长局限在４４０~５２９ｎｍ[２５]ꎬ在细胞内成像时会激发某些内源物质产生荧光ꎬ对结果造成不同程度的干扰ꎮ本研究所使用的ＴａｇＲＦＰ的发射波长为５８４ｎｍꎬ细胞内成像背景低ꎬ更容易检测ꎮ通过ＰＣＲ分子标记检测发现ꎬ利用ＴａｇＲＦＰ作为筛选标记ꎬ区分转基因与非转基因种子的准确率可达１００％ꎮ此外ꎬ使用荧光蛋白标记筛选转基因种子时ꎬ可利用荧光种子分选设备进一步提高鉴定效率[２６－２７]ꎮ种子特异性表达启动子驱动荧光蛋白基因ꎬ可用于转基因种子的可视化鉴定ꎮ在拟南芥中使用种子储藏蛋白基因ｎａｐｉｎ启动子驱动荧光蛋白进行表达ꎬ可以在荧光显微镜下识别转基因种子[２８]ꎮ拟南芥和水稻油体蛋白基因ＡｔＯＬＥ１㊁Ｏｓ￣ＯＬＥ４与ＧＦＰ的融合蛋白基因表达ꎬ可使转基因种子呈现绿色荧光ꎬ从而实现快速简便鉴定转基因后代[４ꎬ２０]ꎮ本研究发现ＳｌＯＬＥ１(Ｓｏｌｙｃ０６ｇ０３４０４０)是拟南芥ＡｔＯＬＥ１基因和水稻ＯｓＯＬＥ４基因的同源基因ꎬ而且在番茄种子中特异㊁高水平表达ꎮ利用Ｓｌ￣ＯＬＥ１基因启动子驱动ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ融合蛋白表达ꎬ成功实现了通过种子红色荧光快速简便鉴定转基因番茄后代的目的ꎮ由此推测ꎬ利用植物自身种子特异性启动子驱动油体蛋白与荧光蛋白融合基因的表达ꎬ可以应用于其他含油体蛋白种子植物的转基因后代鉴定ꎮ种子荧光标记系统已经逐步应用于基础研究６山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀和育种领域ꎮ基因编辑通常借助稳定的遗传转化ꎬ需要对阳性转基因植株和不含转基因成分的突变后代进行筛选ꎬ工作量大ꎬ费用高ꎮ玉米种子荧光报告系统辅助的ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ基因编辑技术通过胚中的红色荧光标记准确鉴别转基因或非转基因籽粒ꎬ显著提高了基因编辑工作效率[２９]ꎮ水稻智能不育育种技术将育性恢复基因㊁花粉失活基因和种子特异启动子驱动的红色荧光蛋白基因串联ꎬ一起导入到水稻雄性不育突变体中ꎬ自交可产生无荧光的雄性不育种子和有荧光的可育种子[３０]ꎮ玉米雄性不育制种新技术也可根据红色荧光实现不育系和保持系种子的分选[３１]ꎮ利用单倍体诱导系的单倍体育种技术可以加快纯系选育进程ꎬ提高育种效率ꎮ然而单倍体诱导效率一般不高ꎬ鉴别也较为困难ꎮ利用基因编辑技术创制拟南芥㊁玉米和马铃薯等植物的单倍体诱导系ꎬ结合种子荧光标记ꎬ提高了单倍体鉴别效率[３２－３３]ꎮＺｈｏｎｇ等[３４]报道的番茄单倍体荧光鉴别技术体系中使用的是拟南芥ＦＡＳＴ￣Ｒｅｄ标记ꎮ本研究克隆了番茄自身的种子特异性表达基因ＳｌＯＬＥ１ꎬ并构建了ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因ꎮ稳定遗传转化ＳｌＯＬＥ１－ＴａｇＲＦＰ嵌合基因的番茄种子在激发光照射下发出明亮的红色荧光ꎬ准确率可达１００％ꎮ该种子红色荧光标记筛选体系将有望应用于番茄基因编辑㊁智能雄性不育系创制和单倍体鉴别等领域ꎬ具有一定基础研究和育种应用价值ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＯｒｔｉｚＪＰꎬＲｅｇｇｉａｒｄｏＭＩꎬＲａｖｉｚｚｉｎｉＲＡꎬｅｔａｌ.Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎｒｅ￣ｓｉｓｔａｎｃｅａｓａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｅｌｅｃｔａｂｌｅｍａｒｋｅｒｆｏｒｗｈｅａｔｓｔａｂｌｅｔｒａｎｓ￣ｆｏｒｍａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１５ꎬ１５(１２):８７７－８８１. [２]㊀ＮａｋａｍｕｒａＳꎬＭａｎｏＳꎬＴａｎａｋａＹꎬｅｔａｌ.Ｇａｔｅｗａｙｂｉｎａｒｙｖｅｃｔｏｒｓｗｉｔｈｔｈｅｂｉａｌａｐｈｏｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅꎬｂａｒꎬａｓａｓｅｌｅｃｔｉｏｎｍａｒｋｅｒｆｏｒｐｌａｎｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ[Ｊ].ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｃｈｅｍ￣ｉｓｔｒｙꎬ２０１０ꎬ７４(６):１３１５－１３１９.[３]㊀ＳｈｉｖａＰｒａｋａｓｈＮꎬＢｈｏｊａｒａｊａＲꎬＳｈｉｖｂａｃｈａｎＳＫꎬｅｔａｌ.Ｍａｒｋｅｒ￣ｆｒｅｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｃｏｒｎｐｌａｎｔｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｔｈｒｏｕｇｈｃｏ￣ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２００９ꎬ２８(１１):１６５５－１６６８. [４]㊀ＳｈｉｍａｄａＴＬꎬＳｈｉｍａｄａＴꎬＨａｒａ￣ＮｉｓｈｉｍｕｒａＩ.Ａｒａｐｉｄａｎｄｎｏｎ￣ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｓｃｒｅｅｎａｂｌｅｍａｒｋｅｒꎬＦＡＳＴꎬｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｓｅｅｄｓｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１０ꎬ６１(３):５１９－５２８.[５]㊀ＪａｃｈＧꎬＢｉｎｏｔＥꎬＦｒｉｎｇｓＳꎬｅｔａｌ.ＵｓｅｏｆｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＤｉｓｃｏｓｏｍａｓｐ.(ｄｓＲＥＤ)ａｓａｒｅｐｏｒｔｅｒｆｏｒｐｌａｎｔｇｅｎｅｅｘ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２００１ꎬ２８(４):４８３－４９１. [６]㊀ＭｉｚｕｎｏＨꎬＳａｗａｎｏＡꎬＥｌｉＰꎬｅｔａｌ.ＲｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＤｉｓｃｏｓｏｍａａｓａｆｕｓｉｏｎｔａｇａｎｄａｐａｒｔｎｅｒｆｏｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏ￣ｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ[Ｊ].Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２００１ꎬ４０(８):２５０２－２５１０.[７]㊀ＹａｒｂｒｏｕｇｈＤꎬＷａｃｈｔｅｒＲＭꎬＫａｌｌｉｏＫꎬｅｔａｌ.ＲｅｆｉｎｅｄｃｒｙｓｔａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＤｓＲｅｄꎬａｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍｃｏｒａｌꎬａｔ２.０￣Åｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉ￣ｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２００１ꎬ９８(２):４６２－４６７. [８]㊀ＪａｃｈＧꎬＰｅｓｃｈＭꎬＲｉｃｈｔｅｒＫꎬｅｔａｌ.ＡｎｉｍｐｒｏｖｅｄｍＲＦＰ１ａｄｄｓｒｅｄｔｏｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓꎬ２００６ꎬ３(８):５９７－６００.[９]㊀ＮｉｓｈｉｚａｗａＫꎬＫｉｔａＹꎬＫｉｔａｙａｍａＭꎬｅｔａｌ.Ａｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏ￣ｔｅｉｎꎬＤｓＲｅｄ２ꎬａｓａｖｉｓｕａｌｒｅｐｏｒｔｅｒｆｏｒｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｓｔａｂｌｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｉｎｓｏｙｂｅａｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２００６ꎬ２５(１２):１３５５－１３６１.[１０]ＭａｔｚＭＶꎬＦｒａｄｋｏｖＡＦꎬＬａｂａｓＹＡꎬｅｔａｌ.ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｆｒｏｍｎｏｎｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＡｎｔｈｏｚｏａｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙꎬ１９９９ꎬ１７(１０):９６９－９７３.[１１]ＭｅｒｚｌｙａｋＥＭꎬＧｏｅｄｈａｒｔＪꎬＳｈｃｈｅｒｂｏＤꎬｅｔａｌ.Ｂｒｉｇｈｔｍｏｎｏ￣ｍｅｒｉｃｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈａｎｅｘｔｅｎｄｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｌｉｆｅ￣ｔｉｍｅ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓꎬ２００７ꎬ４(７):５５５－５５７.[１２]ＲｏｏｉｊｅｎＧＪＨꎬＭｏｌｏｎｅｙＭＭ.Ｐｌａｎｔｓｅｅｄｏｉｌ￣ｂｏｄｉｅｓａｓｃａｒｒｉｅｒｓｆｏｒｆｏｒｅｉｇｎｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ１９９５ꎬ１３(１):７２－７７. [１３]ＨｕａｎｇＡＨ.Ｏｌｅｏｓｉｎｓａｎｄｏｉｌｂｏｄｉｅｓｉｎｓｅｅｄｓａｎｄｏｔｈｅｒｏｒｇａｎｓ[Ｊ].Ｐｌａｎｔｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ１９９６ꎬ１１０(４):１０５５－１０６１.[１４]ＳｈｉｍａｄａＴＬꎬＨａｙａｓｈｉＭꎬＨａｒａ￣ＮｉｓｈｉｍｕｒａＩ.Ｍｅｍｂｒａｎｅｄｙｎａｍ￣ｉｃｓａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｆｕｎｃｔｉｏｎｓｏｆｏｉｌｂｏｄｉｅｓｉｎｓｅｅｄｓａｎｄｌｅａｖｅｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ１７６(１):１９９－２０７.[１５]ＣｈｅｎＫꎬＹｉｎＹＴꎬＬｉｕＳꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｏｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅｓｉｎＢｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓＬ.[Ｊ].ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１９ꎬ１９:２９４.[１６]ＹｕａｎＹＣꎬＣａｏＸＺꎬＺｈａｎｇＨＪꎬｅｔａｌ.Ｇｅｎｏｍｅ￣ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａ￣ｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆＯｌｅｏｓｉｎｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎｆｏｕｒｃｏｔｔｏｎｓｐｅｃｉｅｓａｎｄｉｔｓｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎｏｉｌａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ[Ｊ].ＢＭＣＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０２１ꎬ２１(１):５６９.[１７]ＤｏｙｌｅＪＪꎬＤｏｙｌｅＪＬ.ＡｒａｐｉｄＤＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒｓｍａｌｌｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆｆｒｅｓｈｌｅａｆｔｉｓｓｕｅ[Ｊ].ＰｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌＢｕｌｌｅｔｉｎꎬ１９８７ꎬ１９:１１－１５.[１８]杨孟霞.利用基因编辑技术创制番茄雄性不育材料的研究[Ｄ].北京:中国农业科学院ꎬ２０２０.[１９]ＳｈｉｍａｄａＴＬꎬＳｈｉｍａｄａＴꎬＴａｋａｈａｓｈｉＨꎬｅｔａｌ.ＡｎｏｖｅｌｒｏｌｅｆｏｒｏｌｅｏｓｉｎｓｉｎｆｒｅｅｚｉｎｇｔｏｌｅｒａｎｃｅｏｆｏｉｌｓｅｅｄｓｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２００８ꎬ５５(５):７９８－８０９.[２０]ＳｈｉｍａｄａＴꎬＯｇａｗａＹꎬＳｈｉｍａｄａＴꎬｅｔａｌ.Ａｎｏｎ￣ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅｓｃｒｅｅｎａｂｌｅｍａｒｋｅｒꎬＯｓＦＡＳＴꎬｆｏｒｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｒｉｃｅｓｅｅｄｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＳｉｇｎａｌｉｎｇ＆Ｂｅｈａｖｉｏｒꎬ２０１１ꎬ６(１０):１４５４－１４５６.[２１]ＴｓｉｅｎＲＹ.Ｔｈｅｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆ７㊀第４期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀章力ꎬ等:利用种子红色荧光标记鉴定转基因番茄后代Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ１９９８ꎬ６７:５０９－５４４.[２２]ＰａｔｔｅｒｓｏｎＧＨꎬＤａｙＲＮꎬＰｉｓｔｏｎＤＪ.Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｐｅｃｔｒａ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌＳｃｉｅｎｃｅꎬ２００１ꎬ１１４(５):８３７－８３８. [２３]ＲｉｚｚｏＭＡꎬＳｐｒｉｎｇｅｒＧＨꎬＧｒａｎａｄａＢꎬｅｔａｌ.ＡｎｉｍｐｒｏｖｅｄｃｙａｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｖａｒｉａｎｔｕｓｅｆｕｌｆｏｒＦＲＥＴ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ￣ｎｏｌｏｇｙꎬ２００４ꎬ２２(４):４４５－４４９.[２４]ＧｒｉｅｓｂｅｃｋＯꎬＢａｉｒｄＧＳꎬＣａｍｐｂｅｌｌＲＥꎬｅｔａｌ.Ｒｅｄｕｃｉｎｇｔｈｅｅｎ￣ｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆｙｅｌｌｏｗｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｍｅｃｈａｎｉｓｍａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２００１ꎬ２７６(３１):２９１８８－２９１９４.[２５]樊晋宇ꎬ崔宗强ꎬ张先恩.红色荧光蛋白的光谱多样性及体外分子进化[Ｊ].生物化学与生物物理进展ꎬ２００８ꎬ３５(１０):１１１２－１１２０.[２６]中国科学院长春光学精密机械与物理研究所.一种用于荧光种子分选的光学装置:ＣＮ１１５１４４３３０Ａ[Ｐ].２０２１－０３－３０. [２７]中国科学院长春光学精密机械与物理研究所.荧光种子分选装置:ＣＮ２１４７１８４８２Ｕ[Ｐ].２０２１－１１－１６.[２８]ＳｔｕｉｔｊｅＡＲꎬＶｅｒｂｒｅｅＥＣꎬｖａｎｄｅｒＬｉｎｄｅｎＫＨꎬｅｔａｌ.Ｓｅｅｄ￣ｅｘ￣ｐｒｅｓｓｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓａｓｖｅｒｓａｔｉｌｅｔｏｏｌｓｆｏｒｅａｓｙ(ｃｏ)ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｈｉｇｈ￣ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｇｅｎｏｍｉｃｓｉｎＡｒａ￣ｂｉｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２００３ꎬ１(４):３０１－３０９.[２９]ＹａｎＹＹꎬＺｈｕＪＪꎬＱｉＸＴꎬｅｔａｌ.Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆａｎｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｅｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｐｏｒｔｅｒ￣ａｓｓｉｓｔｅｄＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９ｇｅｎｅｅｄｉｔｉｎｇｉｎｍａｉｚｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０２１ꎬ６３(９):１６７１－１６８０.[３０]ＣｈａｎｇＺＹꎬＣｈｅｎＺＦꎬＷａｎｇＮꎬｅｔａｌ.Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆａｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｉｔｙｓｙｓｔｅｍｆｏｒｈｙｂｒｉｄｒｉｃｅｂｒｅｅｄｉｎｇａｎｄｓｅｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｕ￣ｓｉｎｇａｎｕｃｌｅａｒｍａｌｅｓｔｅｒｉｌｉｔｙｇｅｎｅ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａ￣ｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２０１６ꎬ１１３(４９):１４１４５－１４１５０.[３１]ＣａｉＤＲꎬＺｈａｎｇＺＧꎬＺｈａｏＬꎬｅｔａｌ.Ａｎｏｖｅｌｈｙｂｒｉｄｓｅｅｄｐｒｏｄｕｃ￣ｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｂａｓｅｄｏｎａｕｎｉｌａｔｅｒａｌｃｒｏｓｓ￣ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙｇｅｎｅｉｎｍａｉｚｅ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｃｅＣｈｉｎａＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２３ꎬ６６(３):５９５－６０１.[３２]ＺｈｏｎｇＹꎬＣｈｅｎＢＪꎬＬｉＭＲꎬｅｔａｌ.ＡＤＭＰ￣ｔｒｉｇｇｅｒｅｄｉｎｖｉｖｏｍａｔｅｒｎａｌｈａｐｌｏｉｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｎｔｈｅｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｏｕｓＡｒａｂｉ￣ｄｏｐｓｉｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＰｌａｎｔｓꎬ２０２０ꎬ６(５):４６６－４７２.[３３]ＺｈａｎｇＪＺꎬＹｉｎＪꎬＬｕｏＪＹꎬｅｔａｌ.Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓｄｉｐ￣ｌｏｉｄｐｏｔａｔｏｔｈｒｏｕｇｈｍａｔｅｒｎａｌｈａｐｌｏｉｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].ａＢＩＯＴＥＣＨꎬ２０２２ꎬ３(３):１６３－１６８.[３４]ＺｈｏｎｇＹꎬＣｈｅｎＢＪꎬＷａｎｇＤꎬｅｔａｌ.Ｉｎｖｉｖｏｍａｔｅｒｎａｌｈａｐｌｏｉｄｉｎ￣ｄｕｃｔｉｏｎｉｎｔｏｍａｔｏ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０２２ꎬ２０(２):２５０－２５２.８山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀。

转基因番茄研究进展

转基因番茄研究进展摘要：利用转基因技术培育，已经获得延熟、抗病、抗虫、抗逆、抗除草剂和品质改进的转基因番茄，并主要介绍转基因技术在这些方面的研究成果和研究进展，此外简单介绍了转基因番茄的优势及其展望。

关键词：转基因番茄进展番茄〔Lycopersicon eseulentem．Mil〕是茄科( Solanaceae) 番茄属( Lycopersicon) 的一年生或多年生植物，是世界上重要的蔬菜作物之一。

其后几年利用转基因技术培育出抗病虫害、抗除草剂、抗逆和高品质的优良番茄品种。

番茄的基因转化技术主要采用农杆菌介导的基因转化方法。

此外，黄永芬等[1]利用花粉管导入法进展番茄的基因转化，将整合了抗冻蛋白基因的Ti 质粒直接注入番茄子房或花粉管中进展转化获得了抗冻番茄。

1．转基因番茄研究进展1．1延熟转基因番茄目前利用基因转化技术延熟番茄有两种方法，一是抑制细胞壁的降解，二是抑制乙烯的合成，在防止其腐烂方面取得了较好的效果。

1．1．1抑制番茄细胞壁降解的研究细胞壁水解酶对果实的成熟有促进作用，通过抑制阻止细胞壁水解酶活性，可抑制果实细胞壁的降解，延缓成熟与衰老。

主要包括两类酶，一类是多聚半乳糖醛酸酶(PG)，可将细胞壁中的多聚半乳糖苷降解为低聚半乳糖苷，在果实成熟过程中，PG的mRNA水平可提高100倍。

番茄下胚轴转化获得转基因植株

图! "#$% !
=75）
下胚轴转化再生 &’()*)+’, -.$./.-0+#)/
（箭头所示为再生芽） +,-.’./,0 .1 /23 4!" (3567(（ )88.923:5 ;2.9; 83;6;/:1/ ;2../; 96/2 :5<31/6/6.7; )* 选择性再生培养基上的下胚轴（放大倍数， >* 下胚轴上的转化再生芽 #& ? ） @8:1;A.8(35 ;2../; .1 2,-.’./,0（(:B16A6’:/6.1，#& ? ） %* 转化再生植株 @8:1;B316’ -0:1/; 61 /23 A0:;C;
・ #S ・
下胚轴有一部分玻璃化，有一部分则形成逐渐增大（图 # $ %），少数则不能生根。生根的再生苗长至 & 的白色疏松状愈伤，二者都失去分化能力。经过炼苗，将培养基冲洗干净，栽入装有 ’( 以上时，由绿色愈伤分化形成的小芽在 !" 中培养 # 周，灭菌土的塑料杯中，待幼苗长到比较健壮后，移栽至其生长正常。多数能正常生根，有些根长得很长，并长出许多须根瓦钵或大田，
而后在 /#? 的次氯酸钠（有效氯 -? ）中消毒 .4 =&@，灭菌蒸馏水冲洗 " 次，接种于 . A / %,# 培养基（. A / 含量 %, 盐类和维生素 B .4 C A D 蔗糖 B $ ( 4 C A D 琼脂，中。/4 E 黑暗中发芽， 984 ( 2） " F 后转入光照培光养室，幼苗生长条件为 /4 E 、 .- G 光照 A 2 G 黑暗，照强度 . 2## ’H。悬浮细胞培养：烟草悬浮细胞 56. 在 >*%, 液体培养基（ %, 盐类 B .## =C A D 肌醇 B # ( -4

2023年转基因耐贮藏番茄行业分析报告及未来五至十年行业发展报告

转基因耐贮藏番茄行业分析报告及未来五至十年行业发展报告目录序言 (4)一、转基因耐贮藏番茄行业发展状况及市场分析 (4)(一)、中国转基因耐贮藏番茄市场行业驱动因素分析 (4)(二)、转基因耐贮藏番茄行业结构分析 (5)(三)、转基因耐贮藏番茄行业各因素（PEST）分析 (6)1、政策因素 (6)2、经济因素 (7)3、社会因素 (7)4、技术因素 (8)(四)、转基因耐贮藏番茄行业市场规模分析 (8)(五)、转基因耐贮藏番茄行业特征分析 (8)(六)、转基因耐贮藏番茄行业相关政策体系不健全 (9)二、2023-2028年转基因耐贮藏番茄企业市场突破具体策略 (10)(一)、密切关注竞争对手的策略，提高转基因耐贮藏番茄产品在行业内的竞争力 (10)(二)、使用转基因耐贮藏番茄行业市场渗透策略，不断开发新客户 (10)(三)、实施转基因耐贮藏番茄行业市场发展战略，不断开拓各类市场创新源 (11)(四)、不断提高产品质量，建立覆盖完善的服务体系 (11)(五)、实施线上线下融合，深化转基因耐贮藏番茄行业国内外市场拓展 (11)(六)、在市场开发中结合渗透和其他策略 (12)三、转基因耐贮藏番茄行业（2023-2028）发展趋势预测 (13)(一)、转基因耐贮藏番茄行业当下面临的机会和挑战 (13)(二)、转基因耐贮藏番茄行业经营理念快速转变的意义 (14)(三)、整合转基因耐贮藏番茄行业的技术服务 (14)(四)、迅速转变转基因耐贮藏番茄企业的增长动力 (14)四、转基因耐贮藏番茄产业未来发展前景 (15)(一)、我国转基因耐贮藏番茄行业市场规模前景预测 (15)(二)、转基因耐贮藏番茄进入大规模推广应用阶 (16)(三)、中国转基因耐贮藏番茄行业的市场增长点 (16)(四)、细分转基因耐贮藏番茄产品将具有最大优势 (17)(五)、转基因耐贮藏番茄行业与互联网等行业融合发展机遇 (17)(六)、转基因耐贮藏番茄人才培养市场广阔，国际合作前景广阔 (18)(七)、转基因耐贮藏番茄行业发展需要突破创新瓶颈 (19)五、转基因耐贮藏番茄企业战略目标 (20)六、转基因耐贮藏番茄企业战略实施要点 (20)(一)、打造自主品牌 (20)(二)、重塑企业价值链 (21)1、规范研发设计流程 (21)2、优化生产制造 (21)(三)、重视市场营销 (22)(四)、整合线上线下平台 (24)(五)、宏观环境下转基因耐贮藏番茄行业的定位 (24)(六)、转基因耐贮藏番茄行业发展趋势 (24)七、2023-2028年转基因耐贮藏番茄业竞争格局展望 (25)(一)、转基因耐贮藏番茄业经济周期分析 (25)(二)、转基因耐贮藏番茄业的增长与波动分析 (26)(三)、转基因耐贮藏番茄业市场成熟度分析 (26)八、未来转基因耐贮藏番茄企业发展的战略保障措施 (27)(一)、根据公司发展阶段及时调整组织结构 (27)(二)、加强人才培养和引进 (28)1、制定总体人才引进计划 (28)2、渠道人才引进 (29)3、内部员工竞聘 (29)(三)、加速信息化建设步伐 (30)九、“疫情”对转基因耐贮藏番茄业可持续发展目标的影响及对策 (30)(一)、国内有关政府机构对转基因耐贮藏番茄业的建议 (31)(二)、关于转基因耐贮藏番茄产业上下游产业合作的建议 (31)(三)、突破转基因耐贮藏番茄企业疫情的策略 (32)序言依据编者的深度调查分析及专业预测,本次行业报告将从下面九个方面全方位对转基因耐贮藏番茄行业过去的发展情况进行详细的研究与分析,并将对转基因耐贮藏番茄行业进行专业的未来发展趋势预测,还将对转基因耐贮藏番茄行业前景进行展望及提出合理化的建议。

基因工程在番茄育种中的应用

基因工程在番茄育种中的应用摘要：文章简单介绍了基因工程的概念，特点及其意义，并对基因工程在番茄抗虫害，抗病害，抗除草剂，抗逆性，雄性不育，改善番茄品质和终结种子育种上的原理，应用级研究进展进行了综述，同时探讨了基因工程在番茄育种中存在的问题，解决方法和发展前景，并且对基因工程在番茄育种中的应用进行了简单总结与概括。

关键词：基因工程；番茄；育种基因工程是指用人工方法把不同生物的遗传物质分离出来，在体外进行切割、拼接，然后按照人们的意愿重新组合成重组体，再把重组体放回到宿主细胞内进行大量复制，并使遗传信息在新宿主细胞或个体中高效表达，最终获得基因产物。

这种人工创造新生物并给与生物新功能的过程称为基因工程，或称为分子水平上的遗传工程。

基因工程又称作DNA体外重组技术。

这种DNA分子的新组合克服了固有的生物种间的限制，扩大和带来了定向创造新生物的可能。

这是基因工程的最大的特点。

此外，基因工程还已经深入到细胞水平、亚细胞水平，特别是基因水平来改造生物的本性，同时大大的扩大了育种的范围，打破了物种之间杂交的障碍，加快了育种的进程。

学科起源:基因工程是在分子生物学和分子遗传学综合发展基础上于20世纪70年代诞生的一门崭新的生物技术科学。

一般来说，基因工程是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为方法将所需要的某一供体生物的遗传物质--DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源遗传物质在其中"安家落户"，进行正常复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。

这个定义表明，基因工程具有以下几个重要特征：首先，外源核酸分子在不同的寄主生物中进行繁殖，能够跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因放置到新的生物中，而这种生物可以与原来生物毫无亲缘关系，这种能力是基因工程的第一个重要特征。

第二个特征是，一种确定的DNA小片段在新的寄主细胞中进行扩增，这样实现很少量DNA样品"拷贝"出大量的DNA，而且是大量没有污染任何其它DNA序列的、绝对纯净的DNA分子群体。

2023年转基因耐贮藏番茄行业洞察报告及未来五至十年预测分析报告

法规政策逐步完善
随着转基因技术的不断发展和应用，相关法规政策有望逐步完善，为转基因耐贮藏番茄行业的健康发展提供有力保障。
行业标准逐步建立
行业标准的建立有助于提高转基因耐贮藏番茄产品的质量和安全性，促进行业的规范化发展。
企业战略布局调整和优化建议
加强技术研发
企业应注重技术研发，提高转基因耐贮藏番茄的育种技术、生产技术和加工技术，增强核心竞争力。
完善应急预案和处置机制
制定完善的应急预案和处置机制，明确应急处置流程和责任人员，确保在突发事件发生时能够及时、有效地进行应对和处理。
持续改进方向和目标设定
提高生产效率和质量水平
通过不断优化生产流程和管理体系，提高生产效率和质量水平，降低生产成本和产品不良率。
加强技术创新和研发能力
科研机构合作与交流平台搭建
1 2 3
国际合作与交流
积极与国际知名农业科研机构开展合作，共同推进耐贮藏番茄的研究与开发，提升我国在该领域的国际影响力。
产学研一体化模式探索
与企业、高校等合作，构建产学研一体化创新平台，加速科研成果的转化和应用，推动耐贮藏番茄产业的快速发展。
学术交流与人才培养
定期举办学术研讨会、培训班等活动，加强同行之间的交流与合作，提升科研人员的专业素养和创新能力。
加大技术创新和研发投入力度，引进和培养高素质的研发人才团队，推动新技术、新工艺、新产品的研发和应用。
拓展市场应用领域和客户群体
积极开拓新的市场应用领域和客户群体，扩大产品的市场份额和品牌影响力，提高企业的市场竞争力和盈利能力。
推动绿色可持续发展
加强环保意识和社会责任感的培养和引导，推动绿色生产方式和可持续发展理念在企业的贯彻和落实。