细胞培养工作流程
SOP-细胞常规维持培养
SOP-细胞常规维持培养细胞培养操作-sop一、实验目的：通过维持培养得到一定数量状态良好的细胞，为后续预实验、筛靶、验证实验做准备。
二、实验器材：超净工作台37℃二氧化碳恒温培养箱离心机倒置显微镜移液枪6cm培养皿 1.5mL EP管枪头（1mL 200ul 20ul）废液桶 CO2三、实验试剂：0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液PBS高糖DMEM或RPMI 1640完全培养基贴壁细胞系培养（6cm培养皿为例）四、操作流程：1）镜下观察细胞密度及培养基颜色，颜色微黄，密度80％以上可进行传代2）用1mL移液器吸起原有培养基，弃去3）沿着6cm培养皿的侧壁，缓慢加入1mL的PBS液,稍微换匀6cm培养皿以洗掉残余的培养基4）加入500uL的0.25%胰蛋白酶或含0.53mMOL EDTA胰蛋白酶溶液迅速放入培养箱，2min后在倒置显微镜下观察，细胞开始回缩变圆，弃去胰酶溶液5）加入1ml培养基终止细胞消化，吹打使细胞脱离分散，然后收集于1.5mL EP管中准备离心6）离心机离心1000rpm 2min7）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液8）根据实验需要，接入适量的细胞到培养皿中，最后补足到5mL，摇匀后放入培养箱培养。
悬浮细胞一、操作流程：1）接收客户提供的悬浮细胞，观察细胞状态，直立T25瓶使细胞沉降下去2）吸去上清培养基，余下细胞收集与1.5Ml EP管中离心3）离心机离心1000rpm 2min4）离心后弃去上清，加入1mL新鲜培养基重悬，轻轻吹打成均匀细胞悬液5）根据实验需要，接入适量的细胞到实验孔板中，余下细胞在T25瓶中继续培养半贴壁细胞半贴壁细胞传代时，首先把悬浮于培养基中的细胞收集于管中，然后贴壁的细胞操作手法跟贴壁细胞相同，两者混合离心传代即可。
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤细胞培养是一种在体外培养和繁殖细胞的方法，广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域。
下面是细胞培养的操作步骤，包括细胞的收获、传代和检测。
1.材料准备：- 细胞培养基：选择适合细胞类型和培养要求的培养基，常用的包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）等。
-细胞：选择合适的细胞系，如人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。
-细胞培养器具：包括培养皿、细胞培养瓶、细胞离心管等。
2.细胞收获：-细胞培养器具消毒：用70%乙醇或其他消毒剂将培养器具进行消毒。
-细胞培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞培养皿涂覆：将培养皿或瓶子内壁涂覆一层细胞黏附物，如明胶或聚-卵氨酸等，以增加细胞附着。
3.细胞传代：-培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞收获：将细胞培养瓶中的培养基倒掉，用生理盐水等缓冲液洗涤细胞。
- 细胞分离：使用胰酶（Trypsin）或胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）将细胞从细胞培养瓶上析离下来。
-细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。
-细胞培养：将细胞培养在新的细胞培养瓶中，加入适量的预热培养基。
4.细胞检测：-细胞形态观察：使用倒置显微镜或显微摄像系统观察细胞的形态变化和增殖情况。
- 细胞活力检测：使用细胞活力检测试剂，如MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）或CCK-8（Cell Counting Kit-8）等，评估细胞的存活率和代谢活力。
- 细胞凋亡检测：使用凋亡检测试剂盒，如Annexin V-FITC和PI （Propidium Iodide）等，评估细胞凋亡的程度。
细胞培养工作流程
细胞培养工作流程细胞培养是一种将动植物细胞在体外条件下进行繁殖和生长的技术。
它是许多生物学研究和应用领域的重要工具，广泛应用于细胞生物学、分子生物学、药物研发、生物工程等领域。
细胞培养的工作流程包括以下几个主要步骤：2.细胞株的建立：细胞株是一组具有相同遗传特性的细胞，通常可以通过原代培养、扩增和传代等方法建立。
原代细胞通常来自新鲜组织，将其接种在含有合适培养基和营养物的培养皿中，细胞在适宜条件下会开始生长和分裂形成细胞株。
3.细胞培养基的选择：细胞培养基是提供细胞生长和繁殖所需的营养物和生长因子的培养介质。
根据不同细胞类型的要求，可以选择不同的培养基配方。
培养基常见的成分包括无菌水、氨基酸、糖类、脂质、无菌血清、维生素等。
4.细胞的传代：细胞在培养皿中进行繁殖和分裂，当细胞密度达到一定程度时，需要将细胞进行传代以保持细胞的健康和增殖能力。
传代的目的是将细胞分离并分散在新的培养皿中，以便细胞可以继续生长和繁殖。
5.细胞的准备和植入：根据实验设计和研究目的，将所需的细胞接种在含有合适培养基和营养物的培养皿中。
细胞培养条件通常包括适宜温度（通常为37摄氏度）、无菌条件、恒定的pH值、适宜的气氛（如5%CO2），以及提供细胞所需的营养物和生长因子。
6.细胞的观察和维护：细胞在培养过程中需要定期观察其生长状态和形态特征。
可以使用显微镜对细胞进行观察和记录，以判断细胞的健康和增殖情况。
细胞的培养过程中还需要定期更换培养基，补充营养物和生长因子，以维持细胞的正常生长和繁殖。
7.细胞的实验应用：培养的细胞可以用于各种不同的实验研究和应用，包括细胞分离、细胞特征分析、药物筛选、基因表达研究等。
在实验中，细胞可能需要通过一些特殊处理，如细胞冻存、细胞分离、染色等。
细胞培养常规操作流程
细胞培养常规操作流程英文回答：Cell culture is a fundamental technique in biological research, allowing scientists to study and manipulate cells in a controlled environment. The standard procedure forcell culture involves several key steps.First, I need to prepare the culture medium. This is the nutrient-rich solution that provides cells with the necessary nutrients and growth factors to survive and multiply. The medium is usually composed of a basal medium, such as DMEM or RPMI, supplemented with fetal bovine serum, antibiotics, and other additives. I carefully measure and mix the components to ensure a proper balance of nutrients.Next, I sterilize all the equipment and materials that will come into contact with the cells. This includes the culture dishes, pipettes, and media bottles. Sterilization can be achieved by autoclaving, which uses high-pressuresteam to kill any microorganisms present. Alternatively, I can use a filter to remove bacteria and fungi from the media.Once everything is sterilized, I can start the cell culture process. I thaw frozen cells or obtain fresh cells from a tissue sample. I then count the cells using a hemocytometer or an automated cell counter. This step is important to determine the cell density and ensure that I seed the appropriate number of cells for the experiment.After counting the cells, I seed them into the culture dishes or flasks. The dishes are usually coated with a substance that promotes cell attachment, such as collagen or gelatin. I carefully distribute the cells evenly across the surface and place the dishes in an incubator set at the appropriate temperature and CO2 concentration. The incubator provides a controlled environment that mimics the conditions inside the body.Over the next few days, I regularly check the cells under a microscope to monitor their growth and health. Ialso change the culture medium every 2-3 days to provide fresh nutrients and remove waste products. This process is known as feeding the cells.Sometimes, I need to subculture the cells to maintain their health and prevent overcrowding. This involves detaching the cells from the culture dish using an enzyme called trypsin, and then transferring them to a new dish with fresh medium. Subculturing allows the cells to continue growing and dividing without becoming too dense.Throughout the cell culture process, I need to maintain aseptic technique to prevent contamination. This means working in a clean and sterile environment, wearing gloves, and using sterile tools. Contamination can lead to the growth of unwanted microorganisms and compromise the experiment.In conclusion, cell culture is a meticulous processthat involves preparing the culture medium, sterilizing equipment, seeding the cells, maintaining them in the incubator, and regularly feeding and monitoring theirgrowth. It requires attention to detail, patience, and aseptic technique to ensure successful cell culture experiments.中文回答：细胞培养是生物研究中的一项基本技术，允许科学家在受控环境中研究和操作细胞。
细胞培养整体流程
细胞复苏（快融）准备工作：1ml 灭菌Tip一盒，DMEM，D+F+P（DMEM90%+FBS10%+PS400µl），1.5ml离心管，水浴锅（42℃）1、25mm小皿各加入1mlD+F+P，置超净台预热备用，1.5ml EP管各加入500ulD+F+P；2、液氮中取出冻存管（注意不要用手直接触摸冻存管袋），置于水浴锅42℃快融，一般为2min（具体情况看冻存管溶解状况）；若在-80℃取出，40℃快融。
3、将1.5ml冻存液（1350ul细胞悬液+150ul DMSO）离心，1000rpm,5min离心，弃上清。
4、将超净台中的D+F+P加入离心管，吹散底部沉淀（轻轻吹打）；5、将细胞悬液加入培养皿中，注意点样均匀，镜检，入箱培养。
细胞传代70~80%时就可以传代1、吸去原培养基，用基础培养基洗2次（大皿每次1ml）；2、0.25%胰酶（小皿600µl，大皿1ml，依据情况而定），静置1~2min（依据细胞贴壁状况而定）；3、吸去胰酶，可静置，胰酶残留物进一步消化；4、加D+F+P（DMEM90%+FBS10%+PS400µl）1ml（可进一步阻止胰酶），轻轻吹打（需沿同一方向吹打，不可产生气泡）；5、取出新培养皿分别标清细胞类型、时间、人物以及传代次数，并且加入1ml培养基；6、取200µl平均点缀至大皿，均匀加至各部分，8字晃匀；7、显微镜观察细胞状态以及是否铺匀，入箱培养。
细胞冻存（慢冻）准备工作工作液：每次使用前配制，用多少配多少 10%DMSO+90%D+F+P（DMEM90%+FBS10%+PS400µl）1、吸去原培养基，用基础培养基洗2次（大皿每次1ml）；2、0.25%胰酶（小皿600µl，大皿1ml，依据情况而定），静置1~2min（依据细胞贴壁状况而定）；3、吸去胰酶，可静置，胰酶残留物进一步消化；4、加工作液1ml（可进一步阻止胰酶），轻轻吹打（需沿同一方向吹打，不可产生气泡）；5、取出冻存管分别标清细胞类型、时间、人物，加500µl配好的工作液，终体积1.5ml；6、放置4℃（包棉花）放在PE手套，头向上10min，然后转至-20℃放置40min，再到-80℃过夜（最多保存1个月），最后放置到液氮中。
细胞培养车间工作流程
细胞培养车间工作流程一、准备工作准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，准备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。
准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。
二、取材在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器皿中，这一过程称为取材。
如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。
机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。
理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。
取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。
取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。
取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。
由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。
三、培养将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。
如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。
如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。
细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。
一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。
过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。
细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。
培养细胞的流程
培养细胞的流程
细胞培养是生物学实验中非常重要的一项技术，它可以用于细胞生物学研究、药物筛选、疾病模型建立等多个领域。
下面将介绍一般细胞培养的流程。
首先，准备工作。
在进行细胞培养前，需要准备培养皿、培养基、细胞传代所需的胰酶等材料。
同时需要消毒工作台和培养箱，确保实验环境的无菌。
接着，解冻细胞。
如果是从冷冻状态中取出细胞进行培养，首先需要将冻存管放入37摄氏度的水浴中迅速解冻，解冻后将细胞转移到预先加热的培养基中。
然后，传代细胞。
当细胞生长到一定密度时，需要进行传代操作，以保证细胞的健康生长。
传代操作需要用到胰酶等酶类物质，可以将细胞从培养皿中剥离出来，然后转移到新的培养皿中。
接下来，细胞培养。
将细胞悬浮在培养基中，放入培养箱中进行培养。
培养箱中需要保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度，以提供良好的生长环境。
最后，细胞观察和实验。
在细胞培养的过程中，需要定期观察细胞的形态和生长状态，确保细胞的健康生长。
同时可以进行相关的实验，如药物处理、基因转染等。
综上所述，细胞培养是一个复杂而又重要的实验技术，需要严格控制实验条件，确保细胞的健康生长。
通过以上流程，可以有效地进行细胞培养，并为后续的实验提供可靠的细胞基础。
细胞培养工作流程
细胞培养工作流程一、Vero细胞复苏流程1、准备1、1工作地点检查:检查台面、地面就是否洁净,确认无不相关物品。
1、2设施检查:确认空调、传递窗工作状态完好。
1、3层流罩准备:开启层流罩,观察其运行就是否正常,用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒。
并运行30分钟后开始生产操作。
1、4操作工具与试剂检查:检查本次操作所用灭菌物品外包装就是否严密,就是否在效期内。
检查本次操作所用溶液/试剂瓶内就是否有异物,瓶表面就是否有裂纹,瓶塞就是否松动,溶液名称、批号、数量、有效期就是否符合要求。
合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。
复苏、换液用液体:MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7、5%NaHCO3溶液。
1、5复苏用水准备:(1)融化种子用溶液:按1L/1支种子准备39±1℃含0、1%新洁尔灭溶液。
(2)百级内消毒种子用水:1L/1支种子准备36、5±1℃含0、1%新洁尔灭溶液。
1、6操作人员进入层流罩:穿一层无菌连体服并戴无菌手套,静止5分钟后方可操作。
1、7溶液使用前处理:辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面,旋转1周,操作人员将翻塞翻开,再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。
2、配液配方辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上,操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中,每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧,在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。
复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧,充分混匀待用。
辅助人员打开混匀后的复苏液,放置盐水瓶架上。
操作人员将培养瓶(T175)盖打开,倾斜或直立放置酒精灯附近,将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中(加量:0、3～0、4 ml/cm2),拧紧瓶盖并放在恒温室待用。
3、种子支领依据种子库管理规定进行支领,依据生产指令按数量支领。
本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。
实验室细胞培养的一般步骤
实验室细胞培养的一般步骤细胞培养是一项重要的实验室技术，广泛应用于生命科学研究以及医药产业中。
下面将为您介绍一般的细胞培养步骤，希望能为您提供一些指导意义。
第一步：制备培养基细胞培养的第一步是制备适合细胞生长的培养基。
培养基通常包括营养物质、氨基酸、维生素、生长因子等，可以为细胞提供足够的养分和环境条件。
根据不同的细胞类型和实验目的，制备不同种类和浓度的培养基。
第二步：分离细胞在细胞培养之前，需要将细胞从组织、器官或已有培养物中分离出来。
通常采用酶消化、机械剪切或离心等方法来分离细胞。
分离后，细胞可以在培养基中生长和繁殖。
第三步：细胞接种将分离出的细胞接种到含有培养基的培养皿或培养瓶中。
接种密度要适当，不宜过稀或过密。
同时，需要将培养基中的氧气和二氧化碳平衡，通常使用CO2培养箱来提供适宜的气体环境。
第四步：细胞培养经过接种后，细胞开始在培养基中生长和分裂。
在培养过程中，需要控制细胞的温度、湿度和pH值，保持适宜的生长条件。
此外，定期更换新鲜的培养基可以提供足够的营养物质，维持细胞的正常生长。
第五步：细胞检测和观察细胞培养的过程中，需要定期对细胞进行检测和观察。
包括细胞数量的计数、形态的观察和生长曲线的绘制等。
通过这些检测和观察，可以了解细胞的健康状态、增殖速率以及其他相关参数。
第六步：细胞应用或冻存根据研究或实验的需要，可以选择将细胞用于进一步的实验、传代培养或冻存保存。
冻存细胞需要使用适当的冻存液，将细胞缓慢冷冻并存放在液氮罐中，以便长期保存。
细胞培养是一项需要耐心和细心的工作，每一步都需要严格控制条件和遵循操作规范。
只有如此，才能获得可靠的实验结果和高质量的细胞培养。
希望本文能为您提供参考，更好地开展细胞培养工作。
细胞培养工作流程
细胞培养工作流程细胞培养指的是将体外细胞放入适宜的培养基中，通过人工控制环境提供养分、温度、湿度和气氛等条件，使细胞能够在体外生长和繁殖的过程。
它是现代生物科学研究的重要手段之一、下面是细胞培养的基本工作流程：1.选择细胞系：根据研究目的，选择合适的细胞系进行培养。
常用的细胞系包括动物细胞系（如人类细胞系、小鼠细胞系）和植物细胞系（如拟南芥细胞系、水稻细胞系）等。
2.培养皿处理：将培养皿（常用的有细胞培养板、细胞培养瓶等）进行反应器瓶内蒸气温度消毒，消毒完后平行设置以备用。
3.准备培养基：根据细胞系的要求，配制适合的培养基。
培养基可以分为基本培养基和特殊培养基两种。
基本培养基是常规使用的培养基，包含至少4个组分：基础培养液（如DMEM、RPMI1640等）、热灭菌的胎牛血清、青霉素-链霉素溶液和培养液调节剂。
特殊培养基则根据细胞系的需要，添加特定的因子和配方，以满足特殊细胞的生长和繁殖要求。
4. 细胞接种：将细胞接入培养皿中。
首先需要将细胞接种得到的细胞进行计数，根据细胞密度和细胞系特性合理的安排接种密度。
常规的细胞接种密度为1×10^5 到5×10^5个细胞/ml。
然后将培养基加入培养皿中。
5.培养条件控制：将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的环境条件。
常见的条件有：温度通常为37℃，CO2浓度通常为5%，相对湿度约95%。
这样可以提供适宜的温度、气氛和湿度，保证细胞正常生长和繁殖。
6.细胞观察和维护：每天对细胞进行观察、记录和维护。
观察细胞的形态、增殖情况和污染情况等。
细胞一般分为贴壁生长和悬浮生长两种，贴壁细胞需要定期更换培养基，悬浮细胞则需要掌握细胞的密度从而进行传代。
7.细胞传代：当细胞密度到达一定程度（通常为80-90%）时，需要进行细胞传代，以维持细胞的生长和繁殖。
传代的方法包括机械切割、酶解等。
细胞传代的时机和方法由细胞的适应性和特性决定。
8.细胞冻存：为了保证细胞库的保存和维持，需要进行细胞的冻存。
细胞培养流程
细胞培养流程细胞培养是生物学实验中常用的一种技术手段，通过细胞培养可以使细胞在体外环境中持续生长和繁殖。
细胞培养流程包括细胞的分离、传代、培养和检测等步骤，下面将详细介绍细胞培养的流程及注意事项。
1. 细胞分离。
细胞培养的第一步是从组织或细胞悬液中分离出需要的细胞种群。
常用的方法包括机械分离、酶消化和细胞筛选等。
在进行细胞分离时，需要注意避免对细胞造成损伤，保证细胞的完整性和活力。
2. 细胞传代。
细胞传代是指将细胞从一个培养皿中移植到另一个培养皿中，以维持细胞的生长和增殖。
在进行细胞传代时，需要注意细胞的密度和培养基的配比，以确保细胞的正常生长和分裂。
3. 细胞培养。
细胞培养是指将分离和传代后的细胞放置在含有营养物质和生长因子的培养基中进行培养。
培养基的选择和配制对细胞的生长和表型具有重要影响，需要根据不同类型的细胞进行合理选择。
4. 细胞检测。
在细胞培养过程中，需要对细胞进行定期的检测，包括形态学观察、生长曲线分析、细胞纯度检测等。
通过对细胞的检测，可以及时发现细胞的异常情况，并采取相应的措施进行处理。
细胞培养过程中需要注意的事项：保持无菌操作，细胞培养过程需要在无菌条件下进行，避免细胞受到外界污染。
控制培养条件，包括温度、湿度、CO2浓度等，确保细胞在适宜的环境中生长。
定期更换培养基，培养基中的营养物质和生长因子会随着时间逐渐耗尽，需要定期更换新的培养基。
避免细胞过度传代，过度传代会导致细胞老化和突变，影响细胞的生长和功能。
总之，细胞培养是一项复杂而又重要的实验技术，正确的细胞培养流程和操作规范对于细胞生物学研究具有至关重要的意义。
希望本文介绍的细胞培养流程及注意事项能够对您有所帮助，祝您的细胞培养工作顺利进行！。
细胞培养标准操作程序
细胞培养标准操作程序（SOP）1．目的：为了保证培养细胞的正常生长，实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤，特制订实验室细胞培养操作流程。
2．适用范围：适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3．操作规程：培养液、PBS、胰蛋白酶的配制1000ml培养液的配制1、准备用品：培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶（100ml×10个玻璃瓶）、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min。
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）溶解，并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌，按说明添加成分（如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉，Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉等），再充分搅拌。
无需加谷氨酰胺，因该培养基里已含有。
4、用1M（1mol/L）HCl 调PH至左右（细胞适宜在～生长，配制好后PH值会升高～，故配时调PH 至左右）。
5、用新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）定容到1000ml。
6、配青霉素80万/瓶+ 4ml 蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶+ 4ml 蒸馏水溶解取青霉素和链霉素加入到1000ml培养液中，使其终浓度均为100U/ml，充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用的除菌滤膜过滤配制好的培养液，并分装到到100ml玻璃瓶中，玻璃瓶口用薄膜封口，盖上橡皮塞，放-20℃保存备用。
注意：（1）配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl和（或）NaOH均需新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）配制。
一般于配制当天制备，以保证水的纯度和质量。
（2）准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）的容器均不需高压灭菌，干净即可。
PBS（平衡盐溶液）的配制NaCl 8gKCl ＋新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000mlNa2HPO4*H2OKH2PO4（1）无需调PH值，其成分溶解后PH为，不需除菌滤膜过滤除菌，放于4℃保存，用前直接高压灭菌（高压时，装PBS的瓶子的瓶盖要插针头!）（2）Na2HPO4*H2O 则Na2HPO4*12 H2O需（3）如欲配制500ml，以上成分减半即可%胰蛋白酶的配制胰蛋白酶粉EDTA（乙二胺四乙酸二钠）NaClKCl` +新鲜三蒸水（或新鲜反渗水）至1000ML NaHCO3Glucose(葡萄糖)酚红（1）配出来的PH值为，在PH值～范围内，故不需调PH值。
医学实验中细胞培养的基本操作教程
医学实验中细胞培养的基本操作教程细胞培养是医学实验中常用的技术手段，可以通过培养细胞体外研究细胞结构、功能、代谢以及疾病的发病机制。
本文将介绍医学实验中细胞培养的基本操作教程，包括无菌操作、细胞传代和细胞培养基的制备。
一、无菌操作1. 器具准备：将工作区域和培养器具用70%乙醇喷雾消毒，将所需器具放入无菌工作台，待干燥后再进行后续操作。
2. 细胞培养基准备：将所需的细胞培养基放入无菌环境中，根据实验需求添加适量的血清、抗生素等。
3. 细胞取样：取出培养物中所需的细胞，使用吸管或移液器将细胞转移到无菌的培养基中。
4. 细胞传播：将细胞和培养基混合均匀后，转移到培养皿或培养瓶中，注意避免皿壁的污染。
5. 无菌操作结束：将使用过的培养器具进行无菌处理，清理工作区域并进行必要的消毒。
二、细胞传代1. 始代细胞收获：当细胞在培养器中达到一定密度后，使用细胞解离液将细胞从底物上解离下来。
2. 离心：将解离的细胞转移到离心管中，以适当的转速离心沉淀细胞。
3. 上清液去除：倒掉离心管中上清液，注意尽量不要干扰到细胞沉淀。
4. 细胞悬浮液制备：使用无菌PBS洗涤离心沉淀的细胞，再添加适量的细胞培养基将其悬浮均匀。
5. 细胞传代操作：将悬浮细胞转移到新的培养器具中，注意避免气泡的产生，并将培养基置于CO2孵化箱中培养。
三、细胞培养基的制备1. 培养基组成：根据实验需求，制备含有特定成分的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 液体消毒：将容器进行高温高压灭菌，确保培养基的无菌。
3. 配方调整：按照实验需求向培养基中添加适量的血清、抗生素、谷氨酸等。
4. 混合均匀：使用无菌器具将添加好成分的培养基搅拌均匀，确保各成分充分溶解。
5. 培养基保存：将制备好的培养基用无菌器具装入培养瓶中，标明日期和成分，存放于4℃的冰箱中，避免阳光直射。
以上就是医学实验中细胞培养的基本操作教程，从无菌操作、细胞传代到培养基的制备，这些基本技术对于医学实验中的细胞研究至关重要。
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程细胞培养实验是指将动植物组织或细胞从体内分离并在无菌条件下培养的一种技术手段。
这种技术可以用于研究细胞的生物学特性、疾病的发生机制以及药物的筛选等方面。
以下是细胞培养实验的基本流程和无菌操作的相关知识。
一、细胞培养的基本知识1.细胞培养的种类：常用的细胞培养种类有原代细胞培养、细胞株的维持和传代培养以及细胞系的培养。
2.细胞培养的培养基：细胞培养的培养基可以分为无血清培养基和含血清培养基。
其中，无血清培养基是通过添加一定的生长因子和营养物质来满足细胞生长的需要，而含血清培养基则是使用含有细胞生长因子和营养物质的胎牛血清来供养细胞。
3.传代培养的液氮保存：为了保持细胞株的可用性，可以将细胞株保存在液氮中，以备将来使用。
4.细胞培养中的无菌操作：细胞培养实验需要在无菌条件下进行操作，以防止细胞污染和外源性菌落的输入。
1.工作台和操作区域的消毒：操作前，需要用75％的酒精或其他合适的消毒剂彻底清洁工作台面、培养箱、玻璃器皿等操作区域。
2.培养器具的消毒：需要对培养器具如离心管、移液枪、显微镜等进行高温高压的无菌处理。
3.培养基的制备和滤过：制备培养基时需要将培养基溶液进行高温高压的杀菌处理，并使用0.22微米的滤膜滤过杂质。
4.无菌技术的掌握：在细胞培养实验中，需要学习和掌握无菌技术，如无菌操作台、细菌灯和无菌手套等的正确使用方法。
5.细胞的分离和悬浮：将组织样本放入消化液中，进行细胞的分离和悬浮，并通过离心和过滤的方式获得单个细胞悬浮液。
6.细胞培养的接种：将细胞悬浮液接种在含有培养基的培养皿或离心管中，放入培养箱中进行培养。
7.细胞传代的操作：当细胞达到一定密度后，需要进行细胞传代操作。
传代操作时，需要将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，并加入新的培养基进行细胞的维持和生长。
总之，细胞培养实验是生物学研究中不可或缺的一项实验技术，掌握细胞培养的基本知识和无菌操作流程对实验结果的准确性和可靠性至关重要。
细胞培养的操作流程
实验题目：细胞传代实验材料：细胞培养箱，安全柜，手套，酒精灯，吸管，移液管（5ml，10ml），50mL离心管，培养瓶（25cm2），移液枪，离心机，计时器，真空泵，抽滤瓶，水浴锅，记号笔，冰箱实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
实验步骤：以Hela细胞为例说明具体实验操作步骤一．实验前准备工作：进细胞室先换拖鞋，带上手套75%的酒精进行表面消毒；检查酒精灯有无95%酒精，电枪有无电；将实验过程中用到的实验器材（包括培养瓶、50mL离心管、移液管）放于安全柜里，实验前安全柜开紫外照15~20min；将细胞培养液放于37℃水浴中预热；抽滤瓶与真空泵相连，废弃缸套袋。
二．.准备实验：先关闭紫外等30min后再进行实验；75%酒精喷于纸上，将超净工作台仔细擦试干净；点燃酒精灯，小心的将细胞从孵箱中拿出。
1．吸除旧的DMEM培养液：拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的DMEM培养液，将用后的吸管弃于废弃缸里。
注意：一定要吸除干净，否则消化时间过长，细胞损伤过大。
2．消化：拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL 0.25%胰酶加入培养瓶中，混匀，放于37℃孵箱中消化5-6min。
取下用后的移液管。
3．中和：从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mLDMEM培养液终止消化。
反复吹打混匀；吸出中和液转移到50mL离心管中。
4．离心收集细胞：配平后离心200×g，3min。
将新的DMEM培养液加入新培养瓶中，2mL／瓶（培养瓶底面积为25cm2）。
5．重悬细胞：离心后吸出中和液，（先吸出表面泡沫，一定注意不要吸出细胞）。
细胞培养的操作流程
实验题目：细胞传代实验材料：细胞培养箱，安全柜，手套，酒精灯，吸管，移液管（5ml，10ml），50mL离心管，培养瓶（25cm2），移液枪，离心机，计时器，真空泵，抽滤瓶，水浴锅，记号笔，冰箱实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
实验步骤：以Hela细胞为例说明具体实验操作步骤一．实验前准备工作：进细胞室先换拖鞋，带上手套75%的酒精进行表面消毒；检查酒精灯有无95%酒精，电枪有无电；将实验过程中用到的实验器材（包括培养瓶、50mL离心管、移液管）放于安全柜里，实验前安全柜开紫外照15~20min；将细胞培养液放于37℃水浴中预热；抽滤瓶与真空泵相连，废弃缸套袋。
二．.准备实验：先关闭紫外等30min后再进行实验；75%酒精喷于纸上，将超净工作台仔细擦试干净；点燃酒精灯，小心的将细胞从孵箱中拿出。
1．吸除旧的DMEM培养液：拿出吸管（要拿吸管的上端），插入与抽滤瓶相连的橡胶管中，在酒精灯外焰灼烧灭菌，细胞培养瓶倾斜将吸管插入瓶底部一角，吸出旧的DMEM培养液，将用后的吸管弃于废弃缸里。
注意：一定要吸除干净，否则消化时间过长，细胞损伤过大。
2．消化：拿出5mL移液管，插入电枪中，酒精灯过火灼烧，吸取2mL 0.25%胰酶加入培养瓶中，混匀，放于37℃孵箱中消化5-6min。
取下用后的移液管。
3．中和：从孵箱中拿出培养瓶，显微镜下观察细胞是否被完全消化下来，5mL灭菌后移液管加入3mLDMEM培养液终止消化。
反复吹打混匀；吸出中和液转移到50mL离心管中。
4．离心收集细胞：配平后离心200×g，3min。
将新的DMEM培养液加入新培养瓶中，2mL／瓶（培养瓶底面积为25cm2）。
5．重悬细胞：离心后吸出中和液，（先吸出表面泡沫，一定注意不要吸出细胞）。
细胞培养车间工作流程
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在开展细胞培养车间工作之前，要进行充分的准备。
细胞培养标准操作程序(SOP)
细胞培养标准操作程序(SOP)1.目的:为了保证培养细胞的正常生长,实验技术人员必须明确并正确执行细胞培养的基本操作步骤,特制订实验室细胞培养操作流程。
2.适用范围:适用于来我院细胞室进行细胞培养工作的人员。
3.操作规程:3、1 培养液、PBS、胰蛋白酶的配制3、1、1 1000ml培养液的配制1、准备用品:培养粉、1000ml烧杯、玻棒、量筒、电子分析天平、PH仪、2～3天内的新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)、NaHCO3粉、1000ml无菌玻璃瓶(100ml×10个玻璃瓶)、青霉素、链霉素、2～3个过滤器、注射器。
紫外线照台30min。
2、将培养粉用900ml新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)溶解,并冲洗袋内残留粉末。
3、充分搅拌,按说明添加成分(如Invitrogen公司的RPMI-1640配制1000ml需加NaHCO3粉2、0g,Invitrogen 公司的DMEM需加NaHCO3粉3、7g等),再充分搅拌。
无需加谷氨酰胺,因该培养基里已含有。
4、用1M(1mol/L)HCl 调PH至7、0左右(细胞适宜在PH7、2～7、4生长,配制好后PH值会升高0、2～0、3,故配时调PH至7、0左右)。
5、用新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)定容到1000ml。
6、配青霉素 80万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解配链霉素100万/瓶 + 4ml 蒸馏水溶解取0、5ml青霉素与0、4ml链霉素加入到1000ml培养液中,使其终浓度均为100U/ml,充分搅拌混匀。
7、在无菌操作台里用0、22um的除菌滤膜过滤配制好的培养液,并分装到到100ml玻璃瓶中,玻璃瓶口用薄膜封口,盖上橡皮塞,放-20℃保存备用。
注意:(1)配制培养液及调节培养液PH值所使用的HCl与(或)NaOH均需新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)配制。
一般于配制当天制备,以保证水的纯度与质量。
(2)准备的100ml×10个玻璃瓶必须事先高压灭菌！烧杯、量筒、玻棒、盛新鲜三蒸水(或新鲜反渗水)的容器均不需高压灭菌,干净即可。
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细胞培养工作流程一、Vero细胞复苏流程1、准备1.1工作地点检查：检查台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。
1.2设施检查：确认空调、传递窗工作状态完好。
1.3层流罩准备：开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩设备进行清洁消毒。
并运行30分钟后开始生产操作。
1.4操作工具和试剂检查：检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期。
检查本次操作所用溶液/试剂瓶是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。
合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。
复苏、换液用液体：MEM 液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3溶液。
1.5复苏用水准备：（1）融化种子用溶液：按1L/1支种子准备39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液。
（2）百级消毒种子用水：1L/1支种子准备36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液。
1.6操作人员进入层流罩：穿一层无菌连体服并戴无菌手套，静止5分钟后方可操作。
1.7溶液使用前处理：辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外表面，旋转1周，操作人员将翻塞翻开，再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞。
2、配液配方辅助人员将配制所需的液体按顺序打开后放至盐水瓶架上，操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中，每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧，在其瓶身用记号笔注明用量、日期等。
复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧，充分混匀待用。
辅助人员打开混匀后的复苏液，放置盐水瓶架上。
操作人员将培养瓶（T175）盖打开，倾斜或直立放置酒精灯附近，将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.3～0.4 ml/cm2），拧紧瓶盖并放在恒温室待用。
3、种子支领依据种子库管理规定进行支领，依据生产指令按数量支领。
本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作。
若支领数量变化培养瓶面积按比例调整，后续操作各项用量按比例调整。
4、种子速溶种子库管理员从细胞库刚取出细胞种子时，在液氮罐颈部停留几秒，核对所支领的种子标签容与细胞种子申领单上的容是否一致。
核对无误后，迅速全部浸入39±1℃含0.1%新洁尔灭溶液（1000ml /支种子），顺时针不停摇动直至融化，将每次的速融时间控制在1分钟。
然后用75%的酒精消毒容器外表面，放置在传递窗风淋2分钟。
同时马上通知细胞区人员将种子从传递窗取走。
迅速传递并浸入百级36.5±1℃含0.1%新洁尔灭溶液中，百级操作人员取出擦干。
5、移种操作人员左手拿冻存管，右手打开，用1ml的吸管将融化后细胞种子吸出，缓慢滴加到1个T75 cm2培养瓶中，拧紧瓶盖。
6、培养辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置恒温室静置培养。
24小时（细胞贴壁80%）进行换液。
7、清场将废液倒入下水道，废物、待清洗物品由传递窗传到粗洗间，层流罩用75%酒精消毒，再用纯水清洁整个房间。
8、复苏后观察第二天观察培养液颜色（PH）是否正常，在显微镜下观察细胞形态数量。
9、换液换液前准备与复苏前相同。
观察培养液颜色是否正常，有无漏液，看细胞是否生长良好。
用消毒剂擦拭表面后放入层流罩，操作人员进入层流罩换好无菌连体服后静止5分钟方可操作。
辅助人员用酒精棉球外焰消毒瓶塞外表面，操作人员将翻塞翻开，再用火焰消毒瓶口及瓶塞。
操作人员右手拿住培养瓶底部，左手拧开瓶盖，轻轻翻转培养瓶使上清液沿其顶面流至废液缸。
辅助人员打开装生长液的瓶口，并将其在火焰外焰旋转1圈后，放置盐水瓶架上待用。
操作人员将培养瓶盖拧松放置酒精灯附近，将生长液用吸管吸取或直接倒入其中（加量：0.3～0.4 ml/cm2）。
拧紧瓶口，平放到恒温室培养。
最后按规定清场二、细胞传代流程1、准备1.1工作地点检查：检查台面、地面是否洁净，确认无不相关物品。
1.2设施检查：确认空调、蠕动泵工作状态完好。
1.3层流罩准备：开启层流罩，观察其运行是否正常，用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩设备进行清洁消毒。
并运行30分钟后开始生产操作。
1.4操作工具和试剂检查：检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密，是否在效期。
检查本次操作所用溶液/试剂瓶是否有异物，瓶表面是否有裂纹，瓶塞是否松动，溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求。
合格后用消毒剂擦拭外表面后拿入层流罩。
细胞传代用液体：MEM液，新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3溶液、0.01MPBS溶液、细胞消化液（含0.25%的胰蛋白酶溶液）。
2、传代1操作2.1配液配方向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3。
辅助人员盖紧瓶口，在瓶身用记号笔注明用量、日期等，混匀待用。
注意事项：无菌吸管不得碰触除尾部以外的任何地方，否则弃用。
2.2洗涤辅助人员将PBS打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将培养瓶打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。
然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：30ml/ T75 cm2瓶。
（加量：0.2～0.4 ml/cm2）盖上盖子，PBS交由辅助人员盖紧塞子，标记用量、日期。
操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS。
注意事项：倒废液时注意不能污染瓶口。
2.3消化辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
同时将培养瓶盖子打开交由操作人员。
操作人员用吸管吸3ml细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：0.02~0.04 ml /cm2）盖好瓶盖。
辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。
操作人员翻转培养瓶，使细胞消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中，盖紧瓶盖置36.5±0.5℃恒温或室温继续作用5～10分钟。
注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要45°倾斜，操作完成后马上盖好盖子。
室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱落。
2.4悬液制备辅助人员将生长液打开，用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将消化好的培养瓶打开，用吸管吸10ml至T75 cm2瓶中，用吸管冲洗下细胞，吹打分散，制成均匀的细胞悬液。
注意事项：分散细胞要充分，肉眼观察细胞无团块方可。
2.5分种操作人员将细胞悬液平均分种至2个T175 cm2培养瓶中，，加生长液至75ml。
2.6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在2个T175 cm2细胞培养瓶上，将接种细胞的培养瓶放置恒温室静置培养。
2.7清场按规定清场2.8观察每天观察细胞生长状态3、传代2操作3.1配液配方向MEM中依次加入新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCO3。
辅助人员盖紧瓶口，在瓶身用记号笔注明用量、日期等，混匀待用。
注意事项：无菌吸管不得碰触除尾部以外的任何地方，否则弃用。
3.2洗涤辅助人员将PBS打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将培养瓶打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。
然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：60ml/ T175 cm2瓶。
（加量：0.2～0.4 ml/cm2）盖上盖子，PBS交由辅助人员盖紧塞子，标记用量、日期。
操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS。
注意事项：倒废液时注意不能污染瓶口。
3.3消化辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
同时将培养瓶盖子打开交由操作人员。
操作人员用吸管吸7ml细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：0.02~0.04 ml /cm2）盖好瓶盖。
辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。
操作人员翻转培养瓶，使细胞消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中，盖紧瓶盖置36.5±0.5℃恒温或室温继续作用5～10分钟。
注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要45°倾斜，操作完成后马上盖好盖子。
室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱落。
3.4悬液制备辅助人员将生长液打开，用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将消化好的培养瓶打开，将生长液直接倒入至T175 cm2瓶中，每瓶倒入量：75ml,用吸管冲洗下细胞，吹打分散，制成均匀的细胞悬液。
注意事项：分散细胞要充分，肉眼观察细胞无团块方可。
3.5分种操作人员将细胞悬液平均分种至8个T175 cm2培养瓶中，加生长液至75ml。
3.6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞培养瓶上，将接种细胞的培养瓶放置恒温室静置培养。
3.7清场按规定清场3.8观察每天观察细胞生长状态4、传代3操作4.1配液配方辅助人员先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口，拧松桶盖，操作人员解开线绳将外包装纸向外翻至露出传液瓶塞顶部位置右手拿住空气过滤器及出液口管道，左手将包装袋松动，一次性取出管道并放入MEM桶中，辅助人员需要将点燃的酒精棉球一直放在桶口附近创造无菌环境。
辅助人员将所需溶液依次打开，操作人员用配液直管将溶液吸入MEM桶，加完后混匀待用。
然后拔掉直管，将带细胞工厂接头的不锈钢管道与之相连，待用。
注意事项：无菌吸管使用过程中禁止接触其他部位（除吸管后端的任何位置），如不慎碰到应立即废弃。
安装管道过程中，如管道不慎碰到其他部位应立即废弃。
4.2洗涤辅助人员将PBS打开，用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用。
操作人员将培养瓶打开，将上清液沿培养瓶上表面倒至废液桶。
然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶，倒入量：60ml/ T175 cm2瓶。
（加量：0.2～0.4 ml/cm2）盖上盖子，PBS交由辅助人员盖紧塞子，标记用量、日期。
操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS。
注意事项：倒废液时注意不能污染瓶口。
4.3消化辅助人员将消化液瓶口打开，将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。
同时将培养瓶盖子打开交由操作人员。
操作人员用吸管吸7ml细胞消化液到培养瓶底，（消化液加量：0.02~0.04 ml /cm2）盖好瓶盖。
辅助人员将消化液盖好，标记用量、日期。
操作人员翻转培养瓶，使细胞消化液铺满整个细胞面，静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶，使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中，盖紧瓶盖置36.5±0.5℃恒温或室温继续作用5～10分钟。
注意事项：细胞培养瓶开盖后最好要45°倾斜，操作完成后马上盖好盖子。
室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液，避免细胞脱落。
4.4悬液制备辅助人员将生长液打开，用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用。