细胞凋亡实验合集.ppt
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《细胞凋亡信号通路》课件
细胞增殖与细胞凋亡的平衡
研究细胞凋亡与细胞增殖之间的平衡关系，理解其在组织发育和肿瘤形成中的作用。
细胞凋亡与自噬的相互作用
探索细胞凋亡与自噬之间的相互影响，揭示其在维持细胞稳态和疾病发展中的作用。
细胞凋亡与细胞信号转导通路的关系
解析细胞凋亡与其他信号转导通路之间的联系和相互作用，为药物研发提供新的靶点。
01
02
03
肿瘤细胞通过抑制细胞凋亡信号通路，逃逸机体免疫监视，实现恶性增殖。
细胞凋亡信号通路的异常与肿瘤的发生、发展密切相关，为肿瘤的诊断和治疗提供了新的思路。
针对肿瘤细胞中细胞凋亡信号通路的异常，开发新型抗肿瘤药物和治疗策略，具有重要的临床意义。
神经退行性疾病如阿尔茨海默病、帕金森病等，其发病机制与细胞凋亡信号通路的异常密切相关。
神经元细胞的凋亡是神经退行性疾病发生发展的重要病理过程，对神经元细胞的保护和凋亡的抑制是治疗神经退行性疾病的重要方向。
研究细胞凋亡信号通路在神经退行性疾病中的作用，有助于深入理解疾病的发病机制，为治疗提供新的思路和方法。
心肌细胞的凋亡可以导致心肌功能减退、心室重构等病理改变，进一步加重心血管疾病的发展。
细胞凋亡的调控机制
CATALOGUE
03
基因突变与细胞凋亡
基因突变可以影响细胞凋亡的敏感性，一些基因的突变可以促进或抑制凋亡过程。
基因组稳定性与细胞凋亡
基因组的稳定性对于细胞的生存和凋亡具有重要意义，某些基因与维持基因组稳定性相关，从而影响细胞凋亡。
基因表达调控
基因表达的改变是细胞凋亡的重要调控方式之一，某些基因在凋亡过程中被激活或抑制，从而影响细胞命运。
线粒体通路概述：线粒体通路是一种由线粒体释放的凋亡相关分子介导的凋亡信号转导通路。当细胞受到某些刺激时，线粒体会释放出凋亡相关分子，如细胞色素C和Smac等，这些分子会进一步激活下游的caspase级联反应，导致细胞凋亡。
实验十三放线菌素D诱导细胞凋亡形态学观察PPT课件
7
• 最后凋亡小体被周围的细胞或者单核细 胞吞噬。
8
凋亡小体
9
• 生化特征： 内源性核酸内切酶基
因的活化和表达，导致 凋亡细胞的染色质 DNA的有控裂解，得 到的DNA片段的长度 为200bp的倍数。
10
二、程序性细胞死亡的意义
• 1.动物机体靠对细胞增殖和细胞周期的 正负控制以及对程序性细胞死亡的正负 控制来维持细胞总数的平衡和机体的生 命活力。
You Know, The More Powerful You Will Be
18
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
14
材料及设备：
HeLa贴壁培养细胞、250 mg/ml 放线菌素D （Actinomycin D）、吖啶橙荧光染料、 卡诺氏固定液、0.9%生理盐水、10%甘 油
荧光显微镜、盖玻片、载玻片、镊子、一 次性吸管、离心机、EP管、培养皿、小 烧杯等。
15实验步骤ຫໍສະໝຸດ • 1.诱导： 向处于对数生长期的Hela细胞中加入250mg/ml的放
16
• 3.细胞预固定和固定：
加入0.9毫升生理盐水，悬浮细胞， 使细胞分散，加入0.1毫升卡诺氏固定 液，混匀；离心，去上清（保留0.1毫 升生理盐水）；
加入固定液至1毫升，小心悬浮 细胞，室温下固定处理10min，离心， 去上清，加入0.1毫升固定液，小心充 分混匀细胞；
17
学习总结
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
• 最后凋亡小体被周围的细胞或者单核细 胞吞噬。
8
凋亡小体
9
• 生化特征： 内源性核酸内切酶基
因的活化和表达，导致 凋亡细胞的染色质 DNA的有控裂解，得 到的DNA片段的长度 为200bp的倍数。
10
二、程序性细胞死亡的意义
• 1.动物机体靠对细胞增殖和细胞周期的 正负控制以及对程序性细胞死亡的正负 控制来维持细胞总数的平衡和机体的生 命活力。
You Know, The More Powerful You Will Be
18
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
14
材料及设备：
HeLa贴壁培养细胞、250 mg/ml 放线菌素D （Actinomycin D）、吖啶橙荧光染料、 卡诺氏固定液、0.9%生理盐水、10%甘 油
荧光显微镜、盖玻片、载玻片、镊子、一 次性吸管、离心机、EP管、培养皿、小 烧杯等。
15实验步骤ຫໍສະໝຸດ • 1.诱导： 向处于对数生长期的Hela细胞中加入250mg/ml的放
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• 3.细胞预固定和固定：
加入0.9毫升生理盐水，悬浮细胞， 使细胞分散，加入0.1毫升卡诺氏固定 液，混匀；离心，去上清（保留0.1毫 升生理盐水）；
加入固定液至1毫升，小心悬浮 细胞，室温下固定处理10min，离心， 去上清，加入0.1毫升固定液，小心充 分混匀细胞；
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学习总结
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
细胞凋亡检测方法ppt课件
1. 大分子染色体DNA片段的测定
• 细胞凋亡的早期,染色体断裂成为50~300kbp长的DNA大 片段。所有超过一定分子量大小的双链DNA分子在琼脂糖 凝胶中的迁移速度相同。线性DNA的双螺旋半径超过凝胶 半径时，即达到分辨力的极限。此时凝胶不再按分子量的 大小来筛分DNA，DNA像通过弯管一样，以其一端指向电 场一极而通过凝胶，这种迁移模式称之为"爬行"。因此， 细胞凋亡早期产生的50~300kbp长的DNA大片段不能用普 通的琼脂糖凝胶电泳来分离。通常采用脉冲电泳技术可圆 满地解决这一问题。这个方法是在凝胶上外加正交的交变 脉冲电场。每当电场方向改变后，大的DNA分子便滞流在 爬行管中，直至新的电场轴向重新定向后，才能继续向前 移动。DNA分子量越大，这种重排所需要的时间就越长。 当DNA分子变换方向的时间小于电脉冲周期时，DNA就可 以按其分子量大小分开。
• 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如 Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增 强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。
结果
注意事项：1. 整个操作动作要尽量 轻柔，勿用力吹打细胞。 2. 操作时注意避光，反应完毕后尽 快在一小时内检测。
三、线粒体膜势能的检测
• 线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡 刺激因子均可诱导不同的细胞发生亡，而线粒体跨膜电 位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的 事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂 ）出现之前，一旦线粒体DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆 转
《细胞凋亡》幻灯片PPT
细胞坏死
apoptosis 概述
一般过程：因补体反响或烈性病毒感染破坏了质 膜，或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等 离子沿着各自的浓度梯度进入细胞，从而导致细 胞吸水膨胀，最终破膜而死。
特征：线粒体膨胀，细胞骨架降解，溶酶体释放酶， 细胞核内染色质沉淀靠近核膜边，蛋白质合成下降， 由于膜破裂，出现炎症反响。
移，使骨架蛋白交联形成，有利于凋亡小体形成。
3〕激活核转录因子，加速细胞凋亡相关基因的转录。
4〕Ca 2+在ATP的配合下使DNA舒展，暴露出核小体之 间的连接区内的酶切位点。
apoptosis
〔二〕细胞凋亡信号的转导
多样性：不同种类的细胞有不同的信号转导系统
偶联性：死亡信号的转导系统与细胞增殖、分化过 程中的信号转导系统在某些环节上有穿插、偶联。
apoptosis 概述
凋亡的病理意义
•器官功能障碍 •恶性肿瘤发生
apoptosis
细胞凋亡过程的三个阶段
• 诱导期 • 效应期 • 降解期
apoptosis
凋亡
诱导 +受体 因素
cAMP
死
Ca2+
亡
神经酰胺
信
〔第二信使〕 号
诱导期
Dnase激活 Caspases激活
降解期
凋亡相关基因激活
效应期 巨噬细胞吞噬 分解凋亡细胞
分布：造血细胞，上皮细胞，淋巴细胞等多 种瘤细胞
抗凋亡机制： •直接抗氧化 •抑制线粒体释放促凋亡蛋白质 •抑制凋亡调节蛋白对细胞的毒作用 •抑制凋亡蛋白酶的激活
P53基因
wtP53
修复受损的DNA，如修复失败那么诱导细胞
凋亡
射线，毒素
细胞凋亡的分子机制PPT课件
• PT孔道作为许多生理效应的感受器，整合了电 生理、氧化还原与细胞代谢状态的信息
• PT孔道的组成成分ADP-ATP在提示能量代谢的 重要分子，其表达有严格的组织专一性
• PT孔道的作用有自放大效应
2021
25
The Molecular Mechanisms Of Apoptosis
细胞凋亡的分子机制
有证据表明，Ca2+浓度的升高引起细胞凋亡并 非是普遍现象，因此，可能起决定作用的因素 是维系某一细胞生存的Ca2+浓度的失衡亡
• PKA和PKC是体内主要催化蛋白质磷酸化的激酶
• PKA受cAMP激活，PKC的直接活化分子是DAG
• PKC促进细胞凋亡的机制可能与PKC的活化可激 活离子通道，使G蛋白发生磷酸化，导致GP活 化或表达的下调，引起cAMP水平升高有关
• 不同的PKC同工酶在凋亡调节中担负着不同的功 能
2021
13
（2）酶蛋白信号途径与细胞凋亡
Ras-MAPK 途径与细 胞凋亡信 号的传导
Activation of the MAPK-signalling pathway.
2021
14
（2）酶蛋白信号途径与细胞凋亡
• Ras-MAPK 途径与细 胞凋亡信 号的传导
• 第一信使系统与细胞膜结核并作用以后，可与 细胞内的激素受体相作用，或刺激第二信使系
统，如Ca2+、cAMP等
• 通过共同通道改变某些基因的表达，导致细胞 凋亡的发生
2021
6
2、调控细胞凋亡的传统信号途径
（1）G结合蛋白（GBP/GRP/GP）信号 途径与细胞凋亡
G结合蛋白信号途径是由GBP、G蛋白偶 联受体（GpCR）、腺苷酸环化酶（AC） 三部分组成
• PT孔道的组成成分ADP-ATP在提示能量代谢的 重要分子，其表达有严格的组织专一性
• PT孔道的作用有自放大效应
2021
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The Molecular Mechanisms Of Apoptosis
细胞凋亡的分子机制
有证据表明，Ca2+浓度的升高引起细胞凋亡并 非是普遍现象，因此，可能起决定作用的因素 是维系某一细胞生存的Ca2+浓度的失衡亡
• PKA和PKC是体内主要催化蛋白质磷酸化的激酶
• PKA受cAMP激活，PKC的直接活化分子是DAG
• PKC促进细胞凋亡的机制可能与PKC的活化可激 活离子通道，使G蛋白发生磷酸化，导致GP活 化或表达的下调，引起cAMP水平升高有关
• 不同的PKC同工酶在凋亡调节中担负着不同的功 能
2021
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（2）酶蛋白信号途径与细胞凋亡
Ras-MAPK 途径与细 胞凋亡信 号的传导
Activation of the MAPK-signalling pathway.
2021
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（2）酶蛋白信号途径与细胞凋亡
• Ras-MAPK 途径与细 胞凋亡信 号的传导
• 第一信使系统与细胞膜结核并作用以后，可与 细胞内的激素受体相作用，或刺激第二信使系
统，如Ca2+、cAMP等
• 通过共同通道改变某些基因的表达，导致细胞 凋亡的发生
2021
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2、调控细胞凋亡的传统信号途径
（1）G结合蛋白（GBP/GRP/GP）信号 途径与细胞凋亡
G结合蛋白信号途径是由GBP、G蛋白偶 联受体（GpCR）、腺苷酸环化酶（AC） 三部分组成
细胞衰老及凋亡PPT课件
胞质内蛋白变性、凝固或碎裂，以及嗜碱性核蛋白的降解，细胞质呈现强嗜酸性， 故坏死组织或细胞在苏木精/伊红染色切片中，胞质呈均一的深伊红色
荧光法: FDA:双醋酸荧光）
美国科学情报研究所（ISI）1997年SCI（Science Citation Index）收录及引用 论文检索，全世界自然科学研究中论文发表最集中的三个领域分别是：
单基因突变，可提高平均寿命65%，提高最大寿命110%。
第15页/共63页
一个37岁的成人早衰症患者
第16页/共63页
正常儿童（左）和婴幼儿早衰症患者（右）
第17页/共63页
研究表明当细胞衰老时，一些衰老相关基因（SAG）表达特别活跃，其表 达水平大大高于年轻细胞，已在人1号染色体、4号染色体及X染色体上发 现SAG。
1. DNA：复制与转录受到抑制，但也有个别基因会异常激活，端粒DNA丢 失，线粒体DNA特异性缺失，DNA氧化、断裂、缺失和交联，甲基化程度 降低。 2. RNA：mRNA和tRNA含量降低。
3. 蛋白质：含成下降，细胞内蛋白质发生糖基化、氨甲酰化、脱氨基等修 饰反应，导致蛋白质稳定性、抗原性，可消化性下降，自由基使蛋白质肽 断裂，交联而变性。氨基酸由左旋变为右旋。
正常细胞内存在清除自由基的防御系统，包括酶系统和非酶系统，前者如： 超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT），谷胱甘肽过氧化物酶 （GSH-PX），非酶系统有维生素E、醌类物质等电子受体。Orr WC和 Sohal RS（1994），将铜锌超氧化物岐化酶（copper-zinc superoxide dismutase）基因导入果蝇，使转基因株具有3个拷贝的SOD基因，其寿命 比野生型延长1/3。
。 • 继而溶酶体破裂, 细胞内容物流出, 引起炎症
医学专题流式细胞凋亡分析PPT文档
细胞凋亡的基因调控
诱导与抑制凋亡两大基因蛋白表达的平 衡，可对细胞的增殖、分化和死亡进行调 控，维持细胞群体的正常稳定性。当调控 失衡时，就会导致疾病，如肿瘤、AIDS、 霍奇金淋巴瘤等。
细胞凋亡的基因调控
常见的凋亡基因及其蛋白：
1 bcl-2 是研究最早的与凋亡有关的基因。 bcl-2基因是一种对细胞凋亡具有明显抑制 作用的癌基因。它是阻止细胞死亡的最后 途径，而对细胞周期无明显影响。它能抑 制由许多因子，如化疗药物、某些病毒、 p53、c-myc及生长因子等激发的凋亡。
细胞凋亡与疾病
细胞凋亡与皮肤病：
自身免疫性皮肤病，如皮肌炎、硬皮病 等，其免疫异常与自身反应性T、B淋巴细 胞凋亡缺陷有关。恶性黑色素瘤的发生、 发展与细胞凋亡基因调控失常而导致凋亡 障碍有关。此外，细胞凋亡与皮肤肿瘤自 动消退有关。
细胞凋亡与疾病
缺血性脑损伤和缺血性心脏病：
以往，脑缺血导致的细胞死亡被认为是 由于神经元广泛坏死所致。近来研究表明， 全脑或局部脑梗死均激活细胞凋亡过程。 大脑半球短暂缺血后，缺血中心区域神经 细胞很快坏死，但周围的神经细胞，以海 马CAI区的锥形细胞最为明显，要经过一个 潜伏期才出现延迟性神经细胞退化，即细 胞凋亡。
细胞凋亡与疾病
细胞凋亡与免疫系统疾病：
许多以免疫功能异常为主要特征的疾病 均存在细胞凋亡现象。细胞凋亡在免疫形 态的发生分化以及抗感染免疫和自身免疫 病的发生中起重要作用。
细胞凋亡与疾病
细胞凋亡与免疫系统疾病：
当凋亡过少、炎症反应过强时，易造成 变态反应或自身免疫病。当凋亡过多，机 体免疫力下降时，容易继发感染与肿瘤。 在细胞凋亡过程中， CD95(Fas)/CD95L(FasL)以及 CD40/CD40L之间的相互作用起了重要作 用。它们通过激活T淋巴细胞的自杀或杀伤 激活的B淋巴细胞，进一步调节免疫反应的 强弱。
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生理性或病理性，特异性
诱导因素 强烈刺激，随机发生
较弱刺激，非随机发生
生化特点 DNA电泳 形态变化
被动过程，无新蛋白质合成，不 主动过程，有新蛋白质合成，耗
耗能
能
弥散性降解，电泳呈均一DNA片 状
细胞结构全面溶解、破坏、细胞 肿胀
DNA片段化（180—200 bp），电 泳呈“梯”状条带
胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩， 核固缩
精心整理
20
• 亲脂性阳离子荧光探针JC-1以单体形式存在，可发出绿色荧光 （527 nm），若以多聚体形式存在，可发出红色荧光（590 nm）.
• JC-1可透过正常细胞膜以单体状态进入胞内，正常健康线粒体 的膜电位（△ψ）具有极性，JC-1依赖于△ψ的极性被迅速摄 入线粒体内，并形成多聚体，发出红色荧光（590 nm，线粒体） 和绿色荧光（527 nm，胞液）.
凋亡细胞体积变小，细胞 质浓缩。凋亡Ⅰ期 （pro-apoptosis nuclei） 的细胞核内染色质高度 盘绕，出现许多称为气 穴现象（cavitations） 的空泡结构(图2)；Ⅱa 期细胞核的染色质高度 凝聚、边缘化；细胞凋 亡的晚期，细胞核裂解 为碎块，产生凋亡小体。
精心整理
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荧光显微镜
• 正常细胞：Annexin ⅴ-FITC (-)；PI (-)；
精心整理
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凋亡结果
坏死结果
C-myc ASO 200 nmol/L
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4、线粒体膜势能的检测
线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因 子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降， 被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细 胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体 DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如可结合 到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增 高或降低。
A
B
精心整理
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（二）Annexinⅴ/PI双染色
• 原理：磷脂酰丝氨酸（PS）主要存在于细胞膜内侧，细胞凋 亡时，它移向细胞外侧。可能是PS膜内外转位酶的早期激活 有关。Annexinⅴ是一种Ca2＋依赖磷脂结合蛋白，对PS有高度 亲和性。
• PS外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。 • 两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而坏死
• 细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体 间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞浆中， 但是细胞膜完整，不能离开细胞。
• 乙醇固定，PBS洗涤，使细胞膜通透性增加，并从细胞浆 弥散出胞外。但是大分子DNA在胞内，不能被抽提。
精心整理
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• 判断：在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。 （检测晚期凋亡，但不能判断是晚期凋亡还是坏死）
Ⅰ•期的细胞核 呈波纹状 (rippled)或呈折 缝样(creased)， 部分染色质出 现浓缩状态; Ⅱa期细胞核的 染色质高度凝 聚、边缘化; Ⅱb期的细胞核 裂解为碎块， 产生凋亡小体 (图1）
精心整理
11
2、DNA片断化检测
• 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核 小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300 kbp长的DNA大片段, 或 180~200 bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图 谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行 琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧 核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影， 观察凋亡细胞中DNA ladder的形成
细胞膜完整性受到破坏, • 可用PI区分。
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17
• 检测标准： • 早期凋亡细胞：Annexin ⅴ-FITC (+)；PI (-)；
• 坏死细胞和晚期凋亡继发性坏死细胞：
•
Annexin ⅴ-FITC (+)；PI (+)；
• 机械性坏死及非特异性染色：
•
Annexin ⅴ-FITC (-)；PI (+)；
炎症反应 凋亡小体 基因调控
溶酶体破裂，局部炎症反应
无
无
精心整理
溶酶体相对完整，局部无炎症反 应
有
有
3
三、细胞凋亡的生理意义
1. 确保正常发育、生长 如：指（趾）间隙的形成
2. 维持内环境稳定 如：清除受损、突变或衰老的细胞
3. 发挥防御功能 如：使受到病毒感染的细胞凋亡
精心整理
4
四、凋亡时细胞的主要变化
细胞凋亡与检测方法
汇报人：
精心整理
1
一、细胞的死亡方式
凋亡(apoptosis)：机体在正常生理或 病理状态下发生的一种自发的、程序化 的死亡过程。
坏死（Necrosis）：各种致病因子，干 扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成 细胞的意外死亡。
精心整理
2
二、细胞坏死与凋亡的
精心整理
7
内源性核酸内切酶的作用
180-200 bp
内源性核酸内切酶
H1
核心颗粒
连接区
精心整理
Zn2+ Ca2+ Mg2+
8
五、细胞凋亡的检测方法
1、形态学检测 • （一） HE染色（凋亡细胞呈圆形，胞浆红染，细胞
核染色质聚集成团块状）
• （二）透射电镜观察
• （三）荧光显微镜观察
精心整理
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透射电镜观察
（一）形态学改变
初期：
中期：
细胞变圆 微绒毛消失 胞质浓缩 空泡化
核染色质高度浓缩 凝集在核周边,边集 细胞体积缩小
胞膜内陷 出芽
浓缩核裂解 膜自行分割
凋亡小体
后期：
邻近的上皮细胞、MΦ、
瘤细精胞心整等理吞噬凋亡小体
5
Normal Cell
Apoptotic cell
精心整理
6
（二）、生化改变
１、DNA片段化－主要特征 2、内源性核酸内切酶（Ｄnase)激活 3、凋亡蛋白酶（Caspases）激活
精心整理
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精心整理
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3、流式细胞仪检测 flow cytometer
• （一）PI 单染 • （二）Annexinⅴ/ PI双染色
精心整理
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（一） PI 单染
• 荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染 色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后 释放红色荧光。