细胞凋亡实验合集.ppt
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凋亡细胞体积变小，细胞 质浓缩。凋亡Ⅰ期 （pro-apoptosis nuclei） 的细胞核内染色质高度 盘绕，出现许多称为气 穴现象（cavitations） 的空泡结构(图2)；Ⅱa 期细胞核的染色质高度 凝聚、边缘化；细胞凋 亡的晚期，细胞核裂解 为碎块，产生凋亡小体。
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10
荧光显微镜
Ⅰ•期的细胞核 呈波纹状 (rippled)或呈折 缝样(creased)， 部分染色质出 现浓缩状态; Ⅱa期细胞核的 染色质高度凝 聚、边缘化; Ⅱb期的细胞核 裂解为碎块， 产生凋亡小体 (图1）
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11
2、DNA片断化检测
• 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核 小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300 kbp长的DNA大片段, 或 180~200 bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图 谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行 琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧 核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影， 观察凋亡细胞中DNA ladder的形成
生理性或病理性，特异性
诱导因素 强烈刺激，随机发生
较弱刺激，非随机发生
生化特点 DNA电泳 形态变化
被动过程，无新蛋白质合成，不 主动过程，有新蛋白质合成，耗
耗能
能
弥散性降解，电泳呈均一DNA片 状
细胞结构全面溶解、破坏、细胞 肿胀
DNA片段化（180—200 bp），电 泳呈“梯”状条带
胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩， 核固缩
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12
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13
3、流式细胞仪检测 flow cytometer
• （一）PI 单染 • （二）Annexinⅴ/ PI双染色
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14
（一） PI 单染
• 荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染 色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后 释放红色荧光。
（一）形态学改变
初期：
中期：
细胞变圆 微绒毛消失 胞质浓缩 空泡化
核染色质高度浓缩 凝集在核周边,边集 细胞体积缩小
胞膜内陷 出芽
浓缩核裂解 膜自行分割
凋亡小体
后期：
邻近的上皮细胞、MΦ、
瘤细精胞心整等理吞噬凋亡小体
5
Normal Cell
Apoptotic cell
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6
（二）、生化改变
１、DNA片段化－主要特征 2、内源性核酸内切酶（Ｄnase)激活 3、凋亡蛋白酶（Caspases）激活
Байду номын сангаас
炎症反应 凋亡小体 基因调控
溶酶体破裂，局部炎症反应
无
无
精心整理
溶酶体相对完整，局部无炎症反 应
有
有
3
三、细胞凋亡的生理意义
1. 确保正常发育、生长 如：指（趾）间隙的形成
2. 维持内环境稳定 如：清除受损、突变或衰老的细胞
3. 发挥防御功能 如：使受到病毒感染的细胞凋亡
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4
四、凋亡时细胞的主要变化
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20
• 亲脂性阳离子荧光探针JC-1以单体形式存在，可发出绿色荧光 （527 nm），若以多聚体形式存在，可发出红色荧光（590 nm）.
• JC-1可透过正常细胞膜以单体状态进入胞内，正常健康线粒体 的膜电位（△ψ）具有极性，JC-1依赖于△ψ的极性被迅速摄 入线粒体内，并形成多聚体，发出红色荧光（590 nm，线粒体） 和绿色荧光（527 nm，胞液）.
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7
内源性核酸内切酶的作用
180-200 bp
内源性核酸内切酶
H1
核心颗粒
连接区
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Zn2+ Ca2+ Mg2+
8
五、细胞凋亡的检测方法
1、形态学检测 • （一） HE染色（凋亡细胞呈圆形，胞浆红染，细胞
核染色质聚集成团块状）
• （二）透射电镜观察
• （三）荧光显微镜观察
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9
透射电镜观察
细胞凋亡与检测方法
汇报人：
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1
一、细胞的死亡方式
凋亡(apoptosis)：机体在正常生理或 病理状态下发生的一种自发的、程序化 的死亡过程。
坏死（Necrosis）：各种致病因子，干 扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成 细胞的意外死亡。
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2
二、细胞坏死与凋亡的比较
坏死
凋亡
性质
病理性、非特异性
• 正常细胞：Annexin ⅴ-FITC (-)；PI (-)；
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18
凋亡结果
坏死结果
C-myc ASO 200 nmol/L
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19
4、线粒体膜势能的检测
线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因 子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降， 被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细 胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体 DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如可结合 到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增 高或降低。
• 细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体 间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞浆中， 但是细胞膜完整，不能离开细胞。
• 乙醇固定，PBS洗涤，使细胞膜通透性增加，并从细胞浆 弥散出胞外。但是大分子DNA在胞内，不能被抽提。
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15
• 判断：在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。 （检测晚期凋亡，但不能判断是晚期凋亡还是坏死）
A
B
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16
（二）Annexinⅴ/PI双染色
• 原理：磷脂酰丝氨酸（PS）主要存在于细胞膜内侧，细胞凋 亡时，它移向细胞外侧。可能是PS膜内外转位酶的早期激活 有关。Annexinⅴ是一种Ca2＋依赖磷脂结合蛋白，对PS有高度 亲和性。
• PS外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。 • 两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而坏死
细胞膜完整性受到破坏, • 可用PI区分。
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17
• 检测标准： • 早期凋亡细胞：Annexin ⅴ-FITC (+)；PI (-)；
• 坏死细胞和晚期凋亡继发性坏死细胞：
•
Annexin ⅴ-FITC (+)；PI (+)；
• 机械性坏死及非特异性染色：
•
Annexin ⅴ-FITC (-)；PI (+)；
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荧光显微镜
Ⅰ•期的细胞核 呈波纹状 (rippled)或呈折 缝样(creased)， 部分染色质出 现浓缩状态; Ⅱa期细胞核的 染色质高度凝 聚、边缘化; Ⅱb期的细胞核 裂解为碎块， 产生凋亡小体 (图1）
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2、DNA片断化检测
• 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核 小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300 kbp长的DNA大片段, 或 180~200 bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图 谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行 琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧 核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影， 观察凋亡细胞中DNA ladder的形成
生理性或病理性，特异性
诱导因素 强烈刺激，随机发生
较弱刺激，非随机发生
生化特点 DNA电泳 形态变化
被动过程，无新蛋白质合成，不 主动过程，有新蛋白质合成，耗
耗能
能
弥散性降解，电泳呈均一DNA片 状
细胞结构全面溶解、破坏、细胞 肿胀
DNA片段化（180—200 bp），电 泳呈“梯”状条带
胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩， 核固缩
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3、流式细胞仪检测 flow cytometer
• （一）PI 单染 • （二）Annexinⅴ/ PI双染色
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（一） PI 单染
• 荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染 色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后 释放红色荧光。
（一）形态学改变
初期：
中期：
细胞变圆 微绒毛消失 胞质浓缩 空泡化
核染色质高度浓缩 凝集在核周边,边集 细胞体积缩小
胞膜内陷 出芽
浓缩核裂解 膜自行分割
凋亡小体
后期：
邻近的上皮细胞、MΦ、
瘤细精胞心整等理吞噬凋亡小体
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Normal Cell
Apoptotic cell
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（二）、生化改变
１、DNA片段化－主要特征 2、内源性核酸内切酶（Ｄnase)激活 3、凋亡蛋白酶（Caspases）激活
Байду номын сангаас
炎症反应 凋亡小体 基因调控
溶酶体破裂，局部炎症反应
无
无
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溶酶体相对完整，局部无炎症反 应
有
有
3
三、细胞凋亡的生理意义
1. 确保正常发育、生长 如：指（趾）间隙的形成
2. 维持内环境稳定 如：清除受损、突变或衰老的细胞
3. 发挥防御功能 如：使受到病毒感染的细胞凋亡
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四、凋亡时细胞的主要变化
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• 亲脂性阳离子荧光探针JC-1以单体形式存在，可发出绿色荧光 （527 nm），若以多聚体形式存在，可发出红色荧光（590 nm）.
• JC-1可透过正常细胞膜以单体状态进入胞内，正常健康线粒体 的膜电位（△ψ）具有极性，JC-1依赖于△ψ的极性被迅速摄 入线粒体内，并形成多聚体，发出红色荧光（590 nm，线粒体） 和绿色荧光（527 nm，胞液）.
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内源性核酸内切酶的作用
180-200 bp
内源性核酸内切酶
H1
核心颗粒
连接区
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Zn2+ Ca2+ Mg2+
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五、细胞凋亡的检测方法
1、形态学检测 • （一） HE染色（凋亡细胞呈圆形，胞浆红染，细胞
核染色质聚集成团块状）
• （二）透射电镜观察
• （三）荧光显微镜观察
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透射电镜观察
细胞凋亡与检测方法
汇报人：
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1
一、细胞的死亡方式
凋亡(apoptosis)：机体在正常生理或 病理状态下发生的一种自发的、程序化 的死亡过程。
坏死（Necrosis）：各种致病因子，干 扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成 细胞的意外死亡。
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二、细胞坏死与凋亡的比较
坏死
凋亡
性质
病理性、非特异性
• 正常细胞：Annexin ⅴ-FITC (-)；PI (-)；
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凋亡结果
坏死结果
C-myc ASO 200 nmol/L
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4、线粒体膜势能的检测
线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因 子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降， 被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细 胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体 DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如可结合 到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增 高或降低。
• 细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体 间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞浆中， 但是细胞膜完整，不能离开细胞。
• 乙醇固定，PBS洗涤，使细胞膜通透性增加，并从细胞浆 弥散出胞外。但是大分子DNA在胞内，不能被抽提。
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• 判断：在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。 （检测晚期凋亡，但不能判断是晚期凋亡还是坏死）
A
B
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（二）Annexinⅴ/PI双染色
• 原理：磷脂酰丝氨酸（PS）主要存在于细胞膜内侧，细胞凋 亡时，它移向细胞外侧。可能是PS膜内外转位酶的早期激活 有关。Annexinⅴ是一种Ca2＋依赖磷脂结合蛋白，对PS有高度 亲和性。
• PS外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。 • 两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而坏死
细胞膜完整性受到破坏, • 可用PI区分。
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• 检测标准： • 早期凋亡细胞：Annexin ⅴ-FITC (+)；PI (-)；
• 坏死细胞和晚期凋亡继发性坏死细胞：
•
Annexin ⅴ-FITC (+)；PI (+)；
• 机械性坏死及非特异性染色：
•
Annexin ⅴ-FITC (-)；PI (+)；