细胞凋亡实验(课堂PPT)

3、流式细胞仪检测 flow cytometer
• （一）PI 单染 • （二）Annexinⅴ/ PI双染色
（一） PI 单染
• 荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染 色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后 释放红色荧光。
初期：
中期：
细胞变圆 微绒毛消失 胞质浓缩 空泡化
胞膜内陷 出芽
后期：
核染色质高度浓缩 凝集在核周边,边集 细胞体积缩小
浓缩核裂解 膜自行分割
凋亡小体
邻近的上皮细胞、MΦ、 瘤细胞等吞噬凋亡小体
Normal Cell
Apoptotic cell
（二）、生化改变
１、DNA片段化－主要特征 2、内源性核酸内切酶（Ｄnase)激活 3、凋亡蛋白酶（Caspases）激活
细胞凋亡与检测方法
汇报人：
一、细胞的死亡方式
凋亡(apoptosis)：机体在正常生理或 病理状态下发生的一种自发的、程序化 的死亡过程。
坏死（Necrosis）：各种致病因子，干 扰和中和了细胞的正常代谢活动，造成 细胞的意外死亡。
二、细胞坏死与凋亡的比较
坏死
凋亡
性质
病理性、非特异性
生理性或病理性，特异性
• 正常细胞：Annexin ⅴ-FITC (-)；PI (-)；
凋亡结果
坏死结果
C-myc ASO 200 nmol/L
4、线粒体膜势能的检测
线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因 子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位DYmt的下降， 被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细 胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体 DYmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。 线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如可结合 到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增 高或降低。
• 而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体 内释放，线粒体内红光强度减弱（590 nm），以单体的形式存 在于胞液内而发绿色荧光（527 nm）.
• 亲脂性阳离子荧光探针JC-1以单体形式存在，可发出绿色荧光 （527 nm），若以多聚体形式存在，可发出红色荧光（590 nm）.
• JC-1可透过正常细胞膜以单体状态进入胞内，正常健康线粒体 的膜电位（△ψ）具有极性，JC-1依赖于△ψ的极性被迅速摄 入线粒体内，并形成多聚体，发出红色荧光（590 nm，线粒体） 和绿色荧光（527 nm，胞液）.
炎症反应 溶酶体破裂，局部炎症反应 凋亡小体 无 基因调控 无
溶酶体相对完整，局部无炎症反 应 有
有
三、细胞凋亡的生理意义
1. 确保正常发育、生长 如：指（趾）间隙的形成
2. 维持内环境稳定 如：清除受损、突变或衰老的细胞
3. 发挥防御功能 如：使受到病毒感染的细胞凋亡
四、凋亡时细胞的主要变化
（一）形态学改变
A
B
（二）Annexinⅴ/PI双染色
• 原理：磷脂酰丝氨酸（PS）主要存在于细胞膜内侧，细胞凋 亡时，它移向细胞外侧。可能是PS膜内外转位酶的早期激活 有关。Annexinⅴ是一种Ca2＋依赖磷脂结合蛋白，对PS有高度 亲和性。
• PS外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。 • 两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而坏死
细胞膜完整性受到破坏, • 可用PI区分。
• 检测标准：பைடு நூலகம்• 早期凋亡细胞：Annexin ⅴ-FITC (+)；PI (-)；
• 坏死细胞和晚期凋亡继发性坏死细胞：
•
Annexin ⅴ-FITC (+)；PI (+)；
• 机械性坏死及非特异性染色：
•
Annexin ⅴ-FITC (-)；PI (+)；
诱导因素 强烈刺激，随机发生
较弱刺激，非随机发生
生化特点 DNA电泳 形态变化
被动过程，无新蛋白质合成，不 主动过程，有新蛋白质合成，耗
耗能
能
弥散性降解，电泳呈均一DNA片 状
细胞结构全面溶解、破坏、细胞 肿胀
DNA片段化（180—200 bp），电 泳呈“梯”状条带
胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩， 核固缩
• 细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体 间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞浆中， 但是细胞膜完整，不能离开细胞。
• 乙醇固定，PBS洗涤，使细胞膜通透性增加，并从细胞浆 弥散出胞外。但是大分子DNA在胞内，不能被抽提。
• 判断：在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。 （检测晚期凋亡，但不能判断是晚期凋亡还是坏死）
内源性核酸内切酶的作用
180-200 bp
内源性核酸内切酶
H1 核心颗粒 连接区
Zn2+ Ca2+ Mg2+
五、细胞凋亡的检测方法
1、形态学检测 • （一） HE染色（凋亡细胞呈圆形，胞浆红染，细胞
核染色质聚集成团块状）
• （二）透射电镜观察
• （三）荧光显微镜观察
透射电镜观察
凋亡细胞体积变小，细胞 质浓缩。凋亡Ⅰ期 （pro-apoptosis nuclei） 的细胞核内染色质高度 盘绕，出现许多称为气 穴现象（cavitations） 的空泡结构(图2)；Ⅱa 期细胞核的染色质高度 凝聚、边缘化；细胞凋 亡的晚期，细胞核裂解 为碎块，产生凋亡小体。
荧光显微镜
Ⅰ•期的细胞核 呈波纹状 (rippled)或呈折 缝样(creased)， 部分染色质出 现浓缩状态; Ⅱa期细胞核的 染色质高度凝 聚、边缘化; Ⅱb期的细胞核 裂解为碎块， 产生凋亡小体 (图1）
2、DNA片断化检测
• 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核 小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300 kbp长的DNA大片段, 或 180~200 bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图 谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行 琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧 核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影， 观察凋亡细胞中DNA ladder的形成