基因克隆步骤
基因克隆过程及注意事项
以猪APOA2基因为例一．提取总RNATRIzol法提取RNATRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。
它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。
加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。
RNA存在于水样层中。
收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。
在除去水样层后，样品中的DNA和总蛋白也能相继以沉淀的方式还原。
乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。
共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用Trizol试剂可以快速提取人、动物、植物、细菌不同组织的总RNA，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。
TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。
所有的操作可以在一小时内完成。
TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。
故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。
如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat. No. 18068)来处理抽提的总RNA。
并且利用DNA、RNA和蛋白质在不同溶液中的溶解性质，可以通过分层分别将不同层中的RNA（上层）、DNA（中层）、蛋白质（下层）分离纯化出来，效率极好。
Trizol试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。
例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb (28S)和~2 kb (18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间 (tRNA, 5S)。
当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8使用TRIzol注意事项TRIzol对人体有害，使用时应戴一次性手套，注意防止溅出。
基因克隆(包括DNA提取技术步骤)
基因克隆DNA克隆是指在体外将目的基因或DNA片段同能够自我复制的载体DNA 连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，又称为重组DNA技术。
DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等。
一 DNA的提取二目的DNA片段的获得（酶切）三体外重组1 LB培养基的配制2大肠杆菌感受态细胞的制备3载体的选择四导入受体细胞五重组子的筛选1插入失活法实验一DNA提取取0.5克以下的鱼类组织或20ul血液：1 准备1.5ml离心管，加入500ul裂解液，取组织放入离心管，破碎。
（常温操作）2 恒温箱裂解，55℃。
30min。
3 加等体积Tris饱和酚(酚：氯仿：异戊醇25：24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
（注意酚在油层下面）4 取上清（把枪头去掉部分，注意液面。
蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中），加入等体积CI(氯仿：异戊醇24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
5 汇集上清，加2倍无水乙醇(-30度保存)，颠倒混匀可观察到絮状DNA。
在-30度冰箱沉淀30min。
离心4度12000g 10分钟。
6 弃去上清，75%乙醇洗涤，7500g离心5分钟。
7 重复一次上述操作。
7 在无菌台干燥半小时，乙醇挥发。
8 溶解于200ulddwater。
9 定量DNA。
裂解液的配制1ml体系200ul 0.5M EDTA（PH=8.0高压灭菌。
作用抑制酶的活性。
）螯合DNA酶发挥作用需要的金属离子。
50ul 10%SDS（蛋白质变性剂）10ul 1MTris-cl（PH=8.0高压灭菌）缓冲溶液5ul PK（消化）735ul 灭菌超纯水EDTA（0.5 M，pH8.0）将186.1 g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H2O）加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
ta克隆原理及方法
ta克隆原理及方法随着科学技术的不断发展和进步，人类对生命的认知也越来越深入，其中涉及到许多重要的科学原理和方法，其中就包括“ta克隆原理及方法”。
这里就为大家详细阐述一下这个重要的科学概念。
1. 什么是“ta克隆原理及方法”？“ta克隆原理及方法”是一种基因克隆的技术，是将原始DNA断链，利用限制酶切割成一段片段，然后加入外源DNA，将新的DNA片段复制进入宿主细胞。
这种克隆方法通常是用来研究基因的功能、生命的本质和疾病发生机制的。
2. 具体的克隆步骤是什么？具体的克隆步骤包括以下几个方面：（1）选择限制酶：将DNA与限制酶一起切割是克隆的第一步，该酶会特异性的切割DNA的某些骨架部位，形成一条DNA的断点。
（2）连接DNA：将要克隆的DNA与载体DNA连接，可以使用克隆载体或自制的克隆载体，具体的操作需要根据不同的目的和载体而定。
（3）转化DNA：将克隆DNA浸入到感受态细胞中，让它被细胞吞噬。
（4）筛选转化细胞：将转化细胞浸入含有抗生素的培养基中，因为克隆载体中含有抗性基因，所以仅荣获克隆载体的细胞才能生长和繁殖。
（5）检验DNA：检验克隆的有效性和准确性，这个步骤既可以通过理论预测，也可以通过实验结果来验证。
3. “ta克隆原理及方法”在生物医学领域中的应用生物医学在人类健康与生命保障方面发挥着极为重要的作用，而“ta 克隆原理及方法”则在生物医学领域中有着广泛的应用。
例如，在研究基因发育和生长方面，常常需要对基因进行克隆和研究；在疾病诊断和治疗方面，也可以使用克隆技术改变人体基因细胞而实现治疗目的；在生物技术研发方面，也可以利用克隆技术进行基因重组和疾病疫苗研发等等。
总之，“ta克隆原理及方法”在现化科技发展过程中，已经成为了生物学领域的重要技术，其重要性和应用前景是相当深远和广泛的。
未来，随着科学技术的不断进步，将会有更多的生命科学成果和应用产生，这也将为人类健康和生活产生更大的贡献。
大肠杆菌基因克隆的基本步骤
大肠杆菌基因克隆的基本步骤嘿，咱今儿个就来聊聊大肠杆菌基因克隆那些事儿！你可别小瞧这大肠杆菌，它在生物领域那可是有着相当重要的地位呢！要进行大肠杆菌基因克隆，第一步，得先找到咱要克隆的那个基因吧。
这就好比你要去一个陌生的地方，得先知道目的地在哪儿呀！得通过各种技术手段，像侦探破案似的，把那个特定的基因给揪出来。
然后呢，就该准备载体啦。
载体就像是一辆小货车，要把基因这个“宝贝”给装进去，拉到它该去的地方。
这小货车可得选好喽，得合适才行，不然基因在里面不舒服可不行。
接下来，把基因和载体连接到一块儿。
这就好像给基因找了个“家”，让它安稳地待在里面。
这连接的过程可得仔细着点儿，不能有一丁点儿差错。
之后，把连接好的载体导入大肠杆菌里。
这就好比把货物运进了仓库。
这导入的方法也有好几种呢，就看哪种适合咱啦。
导入之后，就得让大肠杆菌好好生长啦。
给它提供适宜的环境，就像咱人得住在舒服的房子里一样。
让大肠杆菌在里面开开心心地生活，把咱的基因好好复制。
这时候你可能会问啦，那怎么知道基因克隆成功没呀？嘿嘿，这就得检测啦。
就像考试要看看成绩一样，得知道自己做得对不对。
咱再想想，这基因克隆就像是搭积木，一块一块地搭起来，最后搭成一个漂亮的城堡。
每一步都得小心翼翼，不能马虎。
你说要是中间出了差错会咋样？那可就麻烦啦，就像搭积木搭错了一块，整个城堡可能就歪了或者倒了。
所以每一个步骤都得认真对待呀！你想想，通过这些步骤，咱就能把一个小小的基因复制好多好多份，这多神奇呀！这就是科学的魅力，能让不可能变成可能。
总之呢，大肠杆菌基因克隆虽然听起来挺复杂，但只要咱一步一步慢慢来，肯定能成功。
咱可不能怕困难，要像勇士一样勇往直前！咱要相信，通过咱的努力，一定能在这个领域做出一番大成就！。
基因克隆 操作步骤原理及注意事项
一：提质粒1：提取ml的菌液放到EP管中，12000r/s 30s离心，去除菌液，加入100微升的TE 振荡混匀后加入200微升裂解液二，轻轻混匀，是使细胞破碎，同时使蛋白变性和保持其高碱性，再加入150裂解液三轻轻混匀是鞋包裂解开（最佳的效果是上层是蛋白，下层是透明的液体），离心10min，将液体转移到另一个EP管中，加入等体积的异丙醇，静置10min或更长（一般以析出的DNA为主蛋白次之），离心10min 12000rpm/s ，除去上清液，加入400微升的70%的乙醇洗（去除里面的有机溶剂，同时使DNA 沉淀），去除乙醇，室温下开口放置5-10min或放到烘箱中使乙醇挥发干，再加入20微升的水，跑胶看浓度溶液I：Tris-Cl控制PH；葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉，抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
溶液II：NaOH裂解细胞的作用；SDS主要是变性蛋白，也有溶解细胞的作用。
溶液III：3 M 醋酸钾钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。
SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，同时大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了；2 M 醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。
25/50酚+24/50氯仿+1/50异戊醇的作用：酚抽提蛋白的作用；氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。
乙醇---100%沉淀质粒的作用；70%洗质粒去离子的作用；RNase水：消化所提质粒中的RNA。
2：消化补到50微升体系，再加入5微升的RNase 放入37℃ 2-3个小时3：抽提加入150微升的TE补到200微升体系加入100微升的氯仿 100微升的苯酚充分混匀 12000rpm/s 10min 离心将上层液体转到新EP管中再像其中加入200微升的氯仿充分混匀，12000rpm/s 离心，取上层液体到新EP管中，加入1/4体积的5mol/L的NaCl 两倍体积的无水乙醇，放入-20℃ 3小时沉降后离心 12000rpm/s 10min ，70%的乙醇洗干，再晾干或烘干加20微升的水跑胶检测补充：酚氯仿法提取DNA的原理用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。
1.基因克隆的步骤
基因克隆的步骤一、RNA的提取1. 提取RNA前将洗净干燥的瓷研钵放入-70℃预冷10 min；2. 从液氮罐中取出样品组织放入预冷的研钵中，加液氮淹没后立即研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥干；3. 趁冷，将样品粉末50-80 mg加入1.5 mL离心管后再加入1 mL Trizol，样品体积应不超过所使用Trizol体积的10%，然后按照Trizol试剂盒说明操作；4. 室温静止5-15 min。
对于某些蛋白、多糖或脂含量很高的细胞或组织Trizol裂解后可能会有不溶物或油脂状漂浮物，需12000g、4℃离心10 min，然后吸取澄清的Trizol裂解产物至一新的离心管中；5. 每mL Trizol中加0.2 mL氯仿。
小心盖上离心管，剧烈地涡旋振荡15 sec，室温（24℃）静置3-5 min；（必需步骤）6. 12000 g、4℃离心15 min，此时混合物分成三部分：底层为苯酚-氯仿层，中间层，上层水相层，RNA完全存在水相中；7. 把小于80%的水相层（每mL Trizol约可吸0.5-0.55 mL）转移至一新的离心管中，并弃去下面的有机相（小心避免吸到中间层）。
往水相中加入异丙醇来沉淀RNA，每使用1 mL Trizol，便加500 uL的异丙醇，颠倒混匀，室温下孵育样品10 min；8. 4℃、12000 g离心样本10 min弃去上清，每mL Trizol加入1 mL 75%乙醇，涡旋混匀，室温沉淀10 min后，7500 g、4℃离心5 min，弃上清。
再用离心机甩一下（5000rpm，离心1 s）；9. 小心吸走乙醇，短暂地在室温下置2-5 min，让RNA团风干，不要用离心干燥装置或真空干燥装置，因为过度干燥会导致很难用水重新溶解RNA，然后在55-60℃温浴10 min，然后-70℃保存。
[RNA]（ng/uL）=A260×40×稀释倍数[DNA]（ng/uL）=A260×50×稀释倍数纯DNA：OD260/OD280≈1.8（＞1.9，表明有RNA污染；＜1.6，表明有蛋白质、酚等污染）纯RNA：1.7＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存）二、M-MLV RT反转录1. oligo dT 1 uL + dNTP（2.5 mM）4 uL + 1-5 ug total RNA + 水= 12 uLHeat mixture to 65℃ for 5 min and quick chill on ice；2. 上述12 uL液体+ 5×Buffer 4 uL + 0.1 M DTT 2 uL + RNase OUT 1 uLMix contents of the tube，incubate at 37℃for 2 min3. 上述19 uL液体加M-MLV RT 1 uLIncubate tube at 25℃for 10 min；Incubate 50 min at 37℃；70℃for 15 min。
基因工程的五个基本流程
基因工程的五个基本流程一、基因工程的概述基因工程是一种通过改变生物体遗传物质的结构和组成，从而达到改变其性状和功能的技术。
基因工程技术的应用范围广泛，包括农业、医药、工业等领域。
二、基因工程的五个基本流程1.选择目标基因选择目标基因是进行基因工程的第一步。
目标基因可以是已知的具有特定功能的基因，也可以是未知的探索性研究对象。
在选择目标基因时需要考虑多个方面，如所需功能、适用范围、安全性等。
2.克隆目标基因克隆目标基因是进行基因工程的关键步骤之一。
克隆目标基因需要进行以下几个步骤：（1）提取DNA：从生物体中提取DNA。
（2）切割DNA：使用限制性内切酶将DNA切割成特定长度。
（3）连接载体：将目标DNA片段与载体连接起来。
（4）转化宿主细胞：将连接好的载体转化到宿主细胞中。
3.构建重组表达载体构建重组表达载体是进行基因工程的另一个重要步骤。
重组表达载体是将目标基因嵌入到载体中，使其能够在宿主细胞中表达。
构建重组表达载体需要进行以下几个步骤：（1）选择合适的载体：选择合适的载体，如质粒、病毒等。
（2）插入目标基因：将克隆好的目标基因插入到载体中。
（3）调节表达：调节重组表达载体的启动子和终止子，以控制目标基因在宿主细胞中的表达。
4.转染宿主细胞转染宿主细胞是将构建好的重组表达载体转移到宿主细胞中，使其能够在宿主细胞中进行表达。
转染宿主细胞需要进行以下几个步骤：（1）选择合适的宿主细胞：选择合适的宿主细胞，如大肠杆菌、哺乳动物细胞等。
（2）转染重组表达载体：将构建好的重组表达载体转移到宿主细胞中。
（3）筛选阳性克隆：通过筛选阳性克隆来确定成功转移和表达目标基因的细胞。
5.分离和纯化目标蛋白分离和纯化目标蛋白是将表达出的目标基因转化为蛋白质，并对其进行分离和纯化的过程。
分离和纯化目标蛋白需要进行以下几个步骤：（1）破碎宿主细胞：将表达目标基因的宿主细胞破碎，释放出目标蛋白。
（2）分离目标蛋白：使用不同的技术对混合物进行分离，如层析、电泳等。
基因克隆的步骤
基因克隆的步骤嘿，咱今儿就来讲讲基因克隆那些事儿哈！你知道吗，基因克隆就像是一场神奇的魔法之旅。
首先呢，咱得找到那个我们想要克隆的基因，这就好比是在茫茫人海中找到那个特别的人。
怎么找呢？这可得有点技术和耐心啦！科学家们会用各种巧妙的方法，就像侦探在寻找线索一样，去把那个关键的基因给揪出来。
找到了基因，接下来就得给它找个“家”啦。
这“家”就是载体，就像是给这个基因找了个舒适的小房子，让它能安稳地待着。
然后呢，把基因和载体连接起来，让它们紧紧地结合在一起，就像好朋友手牵手一样。
再之后，就是把这个带着基因的载体送进细胞里啦。
这可不是随便找个细胞就行的哦，得找个合适的，就好像给这个基因找个最合适的“幼儿园”。
细胞就会把这个基因当成自己的一部分，开始按照基因的指令工作啦。
你想想，这多神奇啊！就这么一步步地，一个新的基因就被克隆出来啦。
这就好像我们自己动手搭积木，一块一块地搭起来，最后就变成了一个漂亮的城堡。
那为什么要做基因克隆呢？这用处可大了去啦！可以用来研究疾病的发生机制呀，说不定就能找到治疗那些疑难杂症的方法呢。
还可以用来生产药物，让那些救命的药变得更容易得到。
这就像给我们的健康上了一道保险一样，多让人安心啊！基因克隆可不是一件简单的事儿哦，得有专业的知识和技术，还得有耐心和细心。
就像厨师做菜一样，每一步都要恰到好处，不然味道可就不对啦。
所以说啊，基因克隆真的是一门高深又有趣的学问。
它让我们对生命的奥秘有了更深入的了解，也为我们的生活带来了很多的可能。
你说，这是不是很神奇呢？咱可不能小看了这基因克隆的步骤，每一步都有着它的重要意义呢！。
基因克隆详细步骤说明书
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化[实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知）细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。
转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。
42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。
将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。
然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。
[仪器、材料与试剂](一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器(二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿(三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨 (tryptone) 10g酵母提取物 (yeast extract) 5g NaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。
3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。
[实验步骤]1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。
2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。
以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。
3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。
在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。
注意：1mL的取液器设定在500mL。
克隆基因的步骤及其注意事项
克隆基因的步骤姓名：王静马红梅施翔骞武洋梁丹罗星（指导老师）克隆基因的步骤摘要：基因是遗传物质的最基本单位，也是所有生命活动的基础，不论是揭示某个基因的功能还是要改变某个基因的功能，都必须将所要研究的基因克隆出来。
本文将试验中的体会以及查阅文献后获得的知识做一汇总，简述克隆基因中的步骤以及在操作中应该注意到的一些问题。
关键词：基因克隆；质粒；重组基因克隆可概括为∶分、切、连、转、选。
"分"是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；"切"是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；"连"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；"转"是指通过特殊的方法将重组的DNA 分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；"选"则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。
DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。
如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA 或cDNA 中通过PCR技术可以获得目的基因。
该试验为设计引物来获得目的基因。
接下来选择载体，本次试验采用的是质粒载体，利用质粒进行载体构建。
载体构建的原理为：依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
体外重组则可完成上述过程。
体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。
大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有粘性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的粘性末端，粘性末端彼此退火，通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为粘末端连接。
基因克隆方法步骤
克隆步骤一、目的片段的回收纯化1．柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500ul 平衡液BL,12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使用当天处理过的柱子）。
2．将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。
3．向胶块中加入加入溶液PC(0.1g加入100ul，注意没过胶块)，50℃水浴放置10min左右，期间不断温和地上下翻转离心管，已确保胶块充分溶解。
4．将上一步所得溶液加入一个吸附柱（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
5．向吸附柱CB2中加入600ul漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6．重复步骤5.7．将吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。
8．将吸附柱CB2放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加40ul的无菌水。
室温放置2min，12000rpm离心2min，收集DNA溶液。
(可以将离心后的溶液重新加到柱子中再回收一次) 9．取2ulDNA加入loading buffer点样，电泳检测是否回收出来样品。
二、目的片段与载体的连接1. 将回收的目的片段与T 载体连接，反应体系如下：目的片段 4 .5µLpMD19-T simple Vector 0.5µLSolutionⅠ 5 µLTotal 10 µL按上述体系依次加入各组分后，旋涡混匀，稍加离心后置于16℃连接过夜。
2.转化1)从-80 ℃冰箱中取50 µL 感受态细胞在冰上解冻。
2)在超净工作台上，加入10 µL 连接产物，轻轻混匀，冰上放置30 min 。
基因克隆、假病毒操作步骤
实验名称：基因克隆实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等；操作步骤：1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化，在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接T4lages 1.010×T4buffer 2.0EZ-T 1.0目的基因8.0DdH2O 8.0＿＿＿＿＿＿＿＿＿20ul3、取100µl摇匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；4、加入500µl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性；5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬菌体，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时；6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振荡培养3h；7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充分混匀，-80℃保存；实验名称：假病毒的制备实验器材：荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工小剂量抽提试剂盒、生工胶回收试剂盒、恒温加热器、NEB连接体系、灭菌纯水、冰、LB培养基、氨苄、卡那、卡那抗性平板、甘油等；操作步骤：1、选取测序结果正确的菌种以1：100 的比例接种到含氨苄（1：1000）的5ml LB 培养基中过夜培养中，37℃，200r/min；2、收集菌体抽提质粒，用生工小剂量抽提质粒试剂盒跟据说明书进行抽提，在抽提过程中要注意防污染（在最后一步的洗脱可以用预热的洗脱液洗脱，在加洗脱液的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；3、用抽提好的质粒做双酶切用NEB公司的体系，同时做一管PET28-MS2的双酶切20ul BamH 1 2.5ul BamH 1 1.0ulHindIII 2.5ul HindIII 1.0ulBSA 5.0ul BSA 2.0ulBuffer2 5.0ul Buffer2 2.0ul产物20ul PET28-MS2 8.0H2O 15ul H2O 15ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿50.0 ul20.0ul37度3小时，4、配置1%的大空胶，将双酶切产物跑胶，割胶（在割胶的时候要注意产物不要在紫外灯光下暴露太久），用生工胶回收试剂盒进行回收根据说明书进行纯化；PET28-MS2直接用生工PCR产物回收试剂盒进行纯化；5、将回收好的酶切产物进行连接用NEB的连接体系，16℃，过夜连接T4lages 1.0ul10×T4buffer 2.0ulPET28-MS2 4.0ul目的片段8.0ulDdH2O 6.0ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿20ul6、取100µl摇匀后的BL21感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；7、加入500µl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并使转化体产生抗药性；8、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬菌体，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（卡那抗性），37℃倒置培养12~16小时；9、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（卡那）的LB液体培养基中，37℃振荡培养，培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；10、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充分混匀，-80℃保存；11、选取测序结果正确的菌种以1：100 的比例接种到含卡那霉素的5ml LB 培养基中过夜培养，37℃，200r/min；12、将1ml 过夜培养的菌液接种到100ml 含卡那青霉素的LB 培养基中，37℃，200 r/min 振荡培养4 -6h 至OD 600值大约在0.6-0.8；13、加入终浓度为1mmol/L (IPTG)，在37℃条件下，200 r /min诱导表达16h；14、10,000 rpm，4℃，离心10min，收集菌体，加入1×超声buffer 5 ml重悬菌体；<摇床一小时>15、超声处理：置于冰上超声，功率300W，超声时间2<5>s，间隔时间3<5>s，全程3min，超声12<10>个循环；16、将破碎完全的表达产物12,000 rpm，4℃，离心30min，沉淀细胞碎片，收集上清到另一干净的离心管中，得到含病毒样颗粒的表达产物，分装保存-80℃保存；17、将得到的病毒样颗粒的双酶消化验证实验分别取4 份用NEB公司的DNaseI、生工的RNaseA 进行消化37℃消化1h-2h18、1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶消化结果；19、去第1次消化产物进行第2次消化37℃1h-2h（用NEB公司的DNaseI）DNaseI 40ul10×DNaseIBuffer 100ul消化产物10ulTE 850ul＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿1ml20、DNaseⅠ消化后，加入终浓度为5mM的EDTA终止反应，然后65度10分钟使DNaseⅠ失活；21、提取RNA标本后上荧光定量，检验病毒颗粒的浓度和质粒的消化情况。
基因克隆引物设计步骤
基因克隆引物设计步骤基因克隆是指将感兴趣的基因从一个生物体中转移到另一个生物体中的过程。
在基因克隆中，引物是必不可少的工具，它们作为DNA扩增的起始序列，帮助将目标基因扩增出来。
引物的设计是基因克隆的关键步骤之一，下面是基因克隆引物设计的详细步骤。
1.确定目标基因序列：首先要确定你想要克隆的基因序列。
可以根据已有的序列资料获得，也可以通过测序等技术获得此序列。
2.选择扩增方法：根据实验需求选择适合的扩增方法。
常见的扩增方法有PCR、RT-PCR、RACE等。
3.获取引物序列：根据目标基因序列，设计引物序列。
引物通常由两个部分组成：前向引物和反向引物。
前向引物与目标序列的上游区域互补，反向引物与目标序列的下游区域互补。
引物长度通常为18-22个碱基对。
4.引物设计原则：-引物长度：引物长度应在18-22个碱基对之间，过短则会导致特异性降低，过长则会导致引物的结构稳定性下降。
-GC含量：引物的GC含量应在40%-60%之间，过高或过低的GC含量会导致引物的熔解温度变化，降低引物与目标序列的互补性。
-特异性：引物应具有高度的特异性，避免与其他基因或非目标序列发生互补。
5.避免引物二聚体和髙聚物的形成：-引物二聚体：引物二聚体是指两个引物之间通过碱基配对形成的复合物。
二聚体的形成会导致PCR扩增效率降低甚至完全失败。
要避免引物二聚体的形成，可以使用引物设计软件进行计算和优化。
-引物髙聚物：引物髙聚物是指引物之间互相结合形成的长链。
髙聚物的形成会抑制PCR扩增的产物的生成，同样可使用引物设计软件进行计算和优化。
6.核酸序列分析软件的使用：核酸序列分析软件可以帮助你检查设计引物的性能，如特异性、互补性等。
常用的软件有Primer3、Oligo Analyzer等。
7.引物合成：找到合适的引物序列后，可以将其提交给寡核苷酸合成机构进行合成。
合成的引物会被送到实验室进行后续的基因克隆实验。
总结起来，基因克隆引物设计的关键是确定目标基因序列、选择合适的扩增方法、根据引物设计原则设计引物、避免引物二聚体和髙聚物的形成，并使用核酸序列分析软件进行验证。
克隆基因的步骤及其注意事项
克隆基因的步骤姓名：王静马红梅施翔骞武洋梁丹罗星（指导老师）克隆基因的步骤摘要：基因是遗传物质的最基本单位，也是所有生命活动的基础，不论是揭示某个基因的功能还是要改变某个基因的功能，都必须将所要研究的基因克隆出来。
本文将试验中的体会以及查阅文献后获得的知识做一汇总，简述克隆基因中的步骤以及在操作中应该注意到的一些问题。
关键词：基因克隆；质粒；重组基因克隆可概括为∶分、切、连、转、选。
"分"是指分离制备合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA；"切"是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切出目的基因；"连"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；"转"是指通过特殊的方法将重组的DNA 分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；"选"则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。
DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。
如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA 或cDNA 中通过PCR技术可以获得目的基因。
该试验为设计引物来获得目的基因。
接下来选择载体，本次试验采用的是质粒载体，利用质粒进行载体构建。
载体构建的原理为：依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
体外重组则可完成上述过程。
体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。
大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有粘性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的粘性末端，粘性末端彼此退火，通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为粘末端连接。
基因克隆实验实验报告
一、实验目的本实验旨在学习基因克隆的基本原理和操作步骤，掌握DNA提取、限制性核酸内切酶酶切、连接、转化、筛选等基因克隆技术，并对实验结果进行分析。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
本实验采用以下原理：1. DNA提取：利用细胞裂解、蛋白酶K处理、酚/氯仿抽提等方法提取目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切：利用限制性核酸内切酶识别特定的核苷酸序列，并在这些序列上切割DNA分子，产生具有黏性末端或平末端的DNA片段。
3. 连接：利用DNA连接酶将目的基因片段与载体连接，形成重组DNA分子。
4. 转化：将重组DNA分子导入宿主细胞，使其在细胞内复制、表达。
5. 筛选：通过分子生物学方法筛选出含有目的基因的细胞株。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌DH5α、质粒pUC19、目的基因片段、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、PCR引物、酚/氯仿、无水乙醇、氯仿等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、紫外分光光度计、DNA纯化仪、PCR仪、电热恒温培养箱等。
四、实验步骤1. DNA提取：取一定量的大肠杆菌DH5α菌液，加入细胞裂解液，充分振荡，加入蛋白酶K，37℃水浴30min，加入酚/氯仿抽提，离心，取上清液，加入无水乙醇沉淀，离心，洗涤，溶解，得到目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切：将目的基因片段和载体pUC19分别进行限制性核酸内切酶酶切，酶切产物经电泳鉴定后，切胶回收酶切产物。
3. 连接：将切胶回收的目的基因片段和载体pUC19在连接酶的作用下连接，连接产物经电泳鉴定后，取适量连接产物转化大肠杆菌DH5α。
4. 转化：将连接产物加入大肠杆菌DH5α菌液中，在冰浴中振荡，加入CaCl2，热冲击，涂布于含有抗生素的琼脂平板上，37℃培养过夜。
5. 筛选：挑选单菌落，进行PCR扩增，鉴定阳性克隆。
基因克隆实验步骤
基因克隆实验步骤
嘿，朋友们！今天咱就来唠唠基因克隆实验那些事儿。
你说基因克隆实验像啥？就好比搭积木！咱得把基因这块特殊的“积木”给准确无误地拼起来。
首先呢，咱得有个“模板”，也就是咱要克隆的那个基因。
这就像你要搭个城堡，得先知道城堡啥样儿不是？然后呢，准备各种工具和材料，这就跟你搭积木得有各种形状的积木块一个道理。
接下来就是关键步骤啦！得把基因从原来的地方“揪”出来。
这可不是个容易事儿，得小心翼翼的，就像从一堆杂物里精准地挑出你想要的那个宝贝。
挑出来后，咱得给它找个“新家”呀，这新家就是载体。
把基因安安稳稳地放进去，让它在里面舒舒服服的。
这过程可得仔细着点儿，别弄出啥岔子。
然后呢，把带着基因的载体送进细胞里。
嘿，这细胞就像是个大工厂，基因在里面就开始工作啦，开始复制自己，一变二，二变四，越来越多。
哎呀，你想想，这多神奇啊！就这么一步步地，咱就把基因给克隆出来啦。
你说这像不像变魔术？咱就是那个神奇的魔术师，把不可能变成可能。
做这个实验可不能马虎，每个步骤都得认真对待。
就好比走路，一步一步都得踩稳了，不然就得摔跟头。
而且啊，这实验有时候就像一场冒险，会遇到各种各样的问题和挑战。
但咱可不能怕，得鼓起勇气去面对，去解决。
等你成功克隆出基因的时候，那种成就感，哇，简直没法形容！就好像你爬上了一座很高很高的山，看到了最美的风景。
总之呢，基因克隆实验是个有趣又充满挑战的事儿。
只要咱用心去做，肯定能收获满满的惊喜！咱都能成为基因克隆的小能手，让那些基因在咱的手下乖乖听话！怎么样，是不是很有意思呀？赶紧去试试吧！。
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实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化[实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知）细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。
转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。
42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。
将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。
然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。
[仪器、材料与试剂](一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器(二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿(三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB 培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(tryptone) 10g酵母提取物(yeast extract) 5g NaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。
3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。
[实验步骤]1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。
2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。
以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。
3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。
在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。
注意：1mL的取液器设定在500mL。
悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。
4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。
细胞可以立即使用或储存。
5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。
注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。
转化：1．新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。
2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。
3．冰上放置30分钟。
4．42℃水浴热激60秒。
5．冰上放置2分钟。
6．加400mL LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。
7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。
8．将细菌涂布在Amp/LB琼脂平板上。
9．平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。
[实验结果]经37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。
计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每mg 质粒DNA 转化的菌落数表示。
实验二质粒DNA的提取[实验原理]碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0‐12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。
当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质‐SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。
[仪器、材料与试剂](一)仪器1．恒温培养箱2．恒温摇床3．小型高速离心机4．高压灭菌锅(二)材料1．带有pQE‐31质粒和pUC18‐CAT质粒的两株大肠杆菌2．1.5mL 离心管3．枪头、枪(三)试剂质粒小量制备试剂盒(3S Spin plasmid MIniprep Kit V3.1,申能博彩公司)试剂盒的参考配方:Solution I 50mmo1／L 葡萄糖，5mmo1／L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0)，1.0 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)，Solution II 0.4mo1／L Na0H，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合Solution II I5mo1／L 醋酸钾，60 mL冰乙酸11.5mL 水，28.5mL TE缓冲液，10mmo1／L Tris·HCl1mmo1／L EDTA(pH8.0)，胰RNA酶(RNA酶A)，将RNA酶溶于10mmo1／L Tris·HCl(pH7.5)、15mmo1／L NaCl中，配成10 mg／mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于‐20℃。
[实验步骤](一)提取质粒将3mL含Apm的LB液体培养基加入到两支试管中，分别接入含pQE‐31质粒和pUC18‐CAT的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
以下的操作按试剂盒的说明书进行。
(附试剂盒说明书)(二)质粒的琼脂糖凝胶电泳将5mL洗脱液与3mL的DNA样品缓冲液混合，加于1.2% Agarose 做凝胶电泳分析。
附：试剂盒说明书3S Spin Plasmid Miniprep Kit V 3．1上海申能博彩生物科技有限公司bbst＠shl63．net www．试剂盒组成：组成K1910（50次）K1920（100次）K1930（250次）Solution I(a) 5m1 10m1 25m1Solution II(b) 10m1 20m1 50mlSolution lll 20m1 50m1 2x50m1Wash Solution (c) 22m1 2x22m1 5x22m1TE(d) 5m1 10m1 40m13S Column 50支100支250支Co11ection tube 50支100支250根说明书1份1份l份注：a)Solution I内含RNaseA，每次实验结束后，4℃保存。
b)温度低时，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后使用。
c)首次使用前，必须在Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇，充分混勾后使用。
每次使用后将瓶盖旋紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量。
d)TE pH8．0或者水均可以用十洗脱，但是用水洗脱DNA，效率通常要低—些。
抽提测序用质粒需要用水洗脱。
主要特点：● 采用改良的碱裂解方法，质量稳定，重复性好。
● 经济快速，每个抽提可以在20分钟内完成。
● 无需酚抽提，无需乙醇沉淀，无需CsCl离心。
● 质粒纯度高，洗脱体积小，适合于DNA全白动荧光测序。
实验操作步骤(从细菌中抽提质粒)1．将过夜培养的2m1细菌，测序用质粒抽提请用5m1细胞，高速离心1分钟，彻底去除上清。
2．加入100ml solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。
注意：对于低拷贝数的质粒，请用5m1细胞；质粒如果用于全自动荧光测序分析，请用5ml细胞，无需提高SolutionI，II和III的用量。
3．加入200ml Solution II，立即上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。
4．加入400ml Solution III，立即上卜颠倒5—10次，使之充分中和，室温放置2分钟。
注意：步骤2和3在冰上操作效果更佳。
5．高速离心，15，000转／分钟，10分钟。
无需低温离心。
注意：提高离心速度，使沉淀更加紧密，步骤6操作取上清更为方便。
6．取出2m1样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全部转移到(吸或倒入)3S柱里。
盖上离心管盖子(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，室温放置2分钟(室温放置时间不重要，可长可短)；用台式离心机室温高速(12，000转／分钟)离心1分钟。
注意：转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现Genomic DNA和蛋白质污染。
离心管盖子盖上时，柱子内压的增加，可能会使部分溶液从柱子底部流出，为正常现象。
7．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取700ml Wash Solution到3S柱，离心1分钟。
8．重复步骤7一次。
9．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同—支收集管中，高速离心2分钟。
10．将3S柱放入干净的1．5m1的离心管中，在3S柱子膜中央加50ml TE或水，不要盖上离心管盖, 室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心1分钟。
注意：将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。
测序用质粒用30ml预热的水洗脱，浓度一般满足测序要求。
11．洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或‐20℃保存备用。
lml过夜培养细胞，质粒如果用50ml水洗脱，通常情况下可以取10ml 洗实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳[实验原理]DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样，迁移速度与DNA 分子量的对数值成反比关系。
凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。
一般提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，简称cccDNA)，开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA，即质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。
由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
[仪器、材料与试剂](一)仪器1．恒温培养箱2．琼脂糖凝胶电泳系统3．小型高速离心机4．高压灭菌锅5．紫外核酸检测仪(二)材料1．pQE‐31和pUC18‐CAT质粒(三)试剂1．50xTAE(50倍体积的TAE贮存液)配1000mL 50xTAE：Tris 242 g冰醋酸57 mL0.5mol／L EDTA 200 mLpH 8.02．凝胶加样缓冲液(6x)溴酚蓝0.25％蔗糖40％3．琼脂糖4．溴化乙锭溶液(EB) 0.5µg／mL5．250bp DNA 分子量标准[实验步骤](一)制备琼脂糖凝胶根据被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。