基因克隆及转基因方法

基因克隆及转基因
一、基因克隆及转基因过程
1、设计引物
软件是，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。

一般原则：1、长度：18-25；
2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%；
3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大
于5；
4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A；
5、正反向引物连续配对数小于4；
6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何；
（如果克隆的话不能满足条件也没办法。

）
不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。

步骤：
一、打开PrimerSelect和EditSeq。

二、在EditSeq中输入你的序列。

引物有一对F和R
1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。

2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。

3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。

、
4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那
就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。

可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R 在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。

5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。

6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。

7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。

在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。

一般在引物上游还要加上两个保护碱基。

2、提取醋栗DNA
3、PCR扩增与目的基因回收
PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。

回收完可以再跑电泳检测一遍。

PCR：
20ul体系：灭菌水，若模板为质粒灭菌水；
；
10乘Taq ；
引物F、R各；
模板1ul；若为质粒就够；
最后加入Taq酶，Taq酶现用现拿。

过程：我们用的是预变性94℃3min；
然后进入循环（要进行克隆的话循环数最好不要超过30个），循环过程：变性94℃30s，退火退火温度下30s，延伸72℃时间根据目的基因长度和酶而定，一般Taq酶30s可以延伸1kb；
循环完成后，此时尚有正处于合成过程中的dna链,为了保证充分的得率,所以再增加7分钟的72℃延伸；
最后4℃保存待用。

4、双酶切
回收没问题就将回收的目的基因和表达载体质粒进行双酶切。

目的基因回收完可以直接用试剂盒提纯，因为就切下来很少的几个碱基，试剂盒柱上挂不住。

表达载体质粒酶切完要琼脂糖凝胶回收，回收大的片段。

回收完检测一遍。

4、连接
5、大肠杆菌转化
大肠杆菌感受态用的是DH5α。

步骤：
（1）打开42℃水浴锅。

（2）把感受态放在冰上化，不能放太久，，将质粒（连接产物）加感受态细胞50ul，指尖混匀。

（3）在冰上放30~40min。

（4）90s严格计时，放入水浴锅热激（42℃），之后立即放冰上1~2min，之后加入500ul 纯净LB液体培养基（37℃最好），混匀。

（5）放入37℃摇菌箱，45min~1h（180~200rpm）（这一步的目的是菌恢复活性）。

（6）离心（12000rpm，1min），然后只留100ul，用枪头吸打混匀，涂板（LB＋卡那抗生素的固体培养基）。

（7）放入37℃培养箱，倒置。

涂板、打开离心管和感受态离心管的过程都在超净工作台里进行。

7、挑菌及摇菌
长出单菌落后，超净工作台里挑菌，将菌挑在20ul的灭菌水中作为模板进行菌落PCR。

将检测没问题的菌进行摇菌。

摇菌步骤：把菌液分别倒入摇菌管中（10ml的摇菌管），再加入4mlLB液体培养基，加入4ul卡那（始浓度50mg/ml，终浓度50mg/L），放入摇床中（37℃）过夜摇菌。

8、保菌及提质粒
将摇的菌在超净工作台里分为三部分：
（1）保菌：500ul菌+500ul 50％甘油，混匀，放入-80℃超低温冰箱保存，备用；
（2）测序：1ml菌用于测序；
（3）提质粒：剩下的菌用试剂盒提质粒。

有时也送一部分提的质粒去测序。

9、农杆菌转化
没问题的质粒转入农杆菌感受态细胞（EHA105），步骤：
（1）打开37℃水浴锅；
（2）取2ul质粒+50ul或100ul感受态细胞，冰上放置30min；
（3）液氮中冷冻1min；
（4）37℃水浴溶化细胞；
（5）加500ul~1ml纯净LB液体培养基，混匀；28℃摇床培养2h（180~200rpm）；
（6）离心（12000rpm，1min），然后只留100ul，用枪头吸打混匀，涂板（LB＋卡那抗生素+Rif抗生素的固体培养基）。

（7）放入28℃培养箱，倒置，培养2~3天。

涂板、打开离心管和感受态离心管的过程都在超净工作台里进行。

10、挑菌及摇菌
挑菌及菌落PCR同7。

摇菌时加4ml LB液体培养基，4ul Kan，8ul Rif。

摇菌大约40多小时。

（此步为小摇）11、保菌
将摇的菌取500ul+500ul 50％的甘油保菌。

再用大三角瓶进行大摇，摇菌取1ml菌液+100ml LB液体培养基+100ul Kan+200ul Rif，过夜摇菌。

12、配侵染液
侵染步骤参考论文优化而来。

（1）配侵染液200ml：5％蔗糖，%L-77（有剧毒），有点难溶；
（2）大摇后的菌液测OD，要在~之间，高于这个值时死菌过多，侵染成功率低；
（3）将菌液倒入大点的离心管离心；
（4）倒掉上清，用枪把残余的上清吸净，加入少许（4、5ml）侵染液，用枪把菌打散打匀，倒入瓶中。

13、侵染
铁托盖上报纸，润湿，需用到黑塑料袋，戴上手套。

选择花骨朵多的拟南芥，不是花开的多的，要没开的多的拟南芥，用于侵染的拟南芥一般是四株长在一个小花盆中。

将所有花全泡到侵染液中，所有花均需沾湿，漏在外面的花用戴手套的手弄湿，泡2min 即可（注意不要沾到土，否则植物会死）。

然后将植株迅速平躺放到铁托中，用黑报纸盖住。

最后暗处理24h，第二天拿出来后正常培养。

注意：用于侵染的液体有菌和毒，避免碰到身上。

用于摇菌的瓶子，侵染的瓶子都要高温灭菌；用于装侵染液的瓶子最好用84消毒，要不用洗洁剂也行。

到这时就完成整个转基因过程了。

14、收种子
侵染后的植株看做T0代，侵染后1个月收种子，侵染后40天收第二批种子，但第一批最主要。

是将种子收到离心管中，晒干7~10d才能种。

15、筛选T1代
将种子铺到加入抗生素卡那和头孢的MS固体培养基中。

步骤：
（1）将种子放入中等EP管（10ml）中。

加满消毒液（%SDS，%NaClO3），手摇振荡15min。

（2）在超净工作台中倒掉消毒液，加满灭菌水，振荡洗涤，将种子完全打散。

（3）大离心机离心（3000g for 2min at 20℃），要用大摇菌离心管做载体，不然离心管盖会打开。

在超净工作台中倒掉无菌水，注意不要倒掉种子，这样共洗5次。

（4）加入琼脂糖悬浮种子，倒在或用枪打在板上，一个板3ml，涂匀，停几分钟，等水被板吸干后再封膜。

（5）暗处理春化3d。

每个板长的苗不一定多，有的可能就一两株活的，然后可以把活的苗在移到一个新的MS板上，长到可以时移到土中培养。