基因克隆常用的方法

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根据已知探针克隆基因
这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放 射性或非放射性标记, 射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组 DNA杂交, DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定 的载体(质粒、噬菌体或病毒) 的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这 种方法不但可以将基因克隆出来, 种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基 因组中的拷贝数。但在探针杂交后,要注意高强度(high 因组中的拷贝数。但在探针杂交后,要注意高强度(high stringent)漂洗,以避免干扰信号,即保证克隆的特异性, stringent)漂洗,以避免干扰信号,即保证克隆的特异性,同时节 省时间。
目前, Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联 目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联 系的, Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。 系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。 要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相 要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相 关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是 免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来, 免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整 个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基 个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基 因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是, 因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物 种和分离株之间的差异,为了保证PCR扩增的准确性, 种和分离株之间的差异,为了保证PCR扩增的准确性,有必 要采用两步扩增法, 要采用两步扩增法,即nested PCR。 PCR。
图３真核生物12种mRNA的序列特点
根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 M’N’TTTTTTTT……,用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 12种cDNA(于12个试管内)，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 模板进行PCR扩增(见图1和图4)，那么与表型相关的mRNA就很容易被 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2 发现并克隆出来。但不论AP-PCR还是DD-PCR,都适用于2种种源近似生 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而, PCR的模板必须是 物或不同发育阶段的同一个体之间的比较。因而,其PCR的模板必须是 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 来自2个生物或同一生物的不同发育阶段的mRNA。DD-PCR的优点是快 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 速、方便,可以检测表达量极低的mRNA，但其技术条件要求较高，所 扩增的mRNA的质量不能有差异, mRNA不应降解。目前这一方法已广 扩增的mRNA的质量不能有差异,即mRNA不应降解。目前这一方法已广 泛应用于生物表型相关基因的克隆及比较研究。
基因克隆的几种常用方法
根据已知序列克隆基因 未知序列的基因打靶 根据已知探针克隆基因 用特异抗体克隆基因 特异基因的功能克隆
1、根据已知序列克隆基因
对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因 序列多从文献中查取, 序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。 目前,世界上主要的基因库有: 目前,世界上主要的基因库有: (1)EMBL 为设在欧洲分子生物学实验室的基因库, (1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库, EMBL, 其网上地址为:http://www.ebi.ac.uk/ebi-home.html; 其网上地址为:http://www.ebi.ac.uk/ebi-home.html; (2)Genbank 为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库, (2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库, Genbank, 其网上地址为:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/search/index.html; 其网上地址为:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/search/index.html; (3)Swissport TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库, (3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确 Swissport和 度比较高, 度比较高,而 TREMBL只含有从EMBL TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。 EMBL库中翻译过来的序列。
3.2 Differential display PCR(DD-PCR) PCR(DDDD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RTDD-PCR是在AP-PCR基础上发明的一种RTPCR方法,主要用于2 PCR方法,主要用于2种或多种类似生物个体在基因 表达上的差异分析。其基本原理是: 表达上的差异分析。其基本原理是:所有真核生物 的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列, 的成熟mRNA都含有不同长度的poly+(A)尾部序列, 根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同, 根据poly+(A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将 所有的mRNA分子分为12类 见图3)。 所有的mRNA分子分为12类(见图3)。
PCR反应模式图： 反应模式图： 反应模式图
Nested PCR反应模式图 反应模式图
根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。 在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或 在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1 序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引 物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法 primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法 克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。
图1 应用AP-PCR法进行2种或多种表型特征类似的个体间指纹图谱分析或表型相关基因克隆 箭头所指扩增带为特异于个体(Ⅱ)的扩增产物
AP-PCR的操作一般采用两步法,即前10个循环多以较低的退火温度 AP-PCR的操作一般采用两步法,即前10个循环多以较低的退火温度 (annealing temperature)进行扩增,后20个循环则采用较高的退火温度扩增。APtemperature)进行扩增, 20个循环则采用较高的退火温度扩增。APPCR产物多较短,一般需高浓度的琼脂糖凝胶检测, PCR产物多较短,一般需高浓度的琼脂糖凝胶检测,也可用聚丙烯酰胺凝胶检测。 如扩增的模板为mRNA,通过比较扩增产物的强度,可以得知该基因在2 如扩增的模板为mRNA,通过比较扩增产物的强度,可以得知该基因在2种生物 或同一生物不同发育阶段的表达强度。另外, AP-PCR检测到与某一表型相关 或同一生物不同发育阶段的表达强度。另外,在AP-PCR检测到与某一表型相关 的基因或基因产物(mRNA)以后,下一步工作就是克隆出整个基因或mRNA。主 的基因或基因产物(mRNA)以后,下一步工作就是克隆出整个基因或mRNA。主 要操作程序为:(1)AP-PCR产物的提取、克隆及序列测定。首先将AP-PCR检测 要操作程序为:(1)AP-PCR产物的提取、克隆及序列测定。首先将AP-PCR检测 到的特定片段从凝胶中切下,提取DNA克隆到适宜的载体内( TA载体),再测定 到的特定片段从凝胶中切下,提取DNA克隆到适宜的载体内(如TA载体),再测定 其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计2个方向相反的引物(P-1,P-2,见图2)。引 其核苷酸组成。根据其核苷酸组成设计2个方向相反的引物(P-1,P-2,见图2)。引 物长度多在20 nt以上；退火温度在60℃以上；(2)将基因组DNA做适当酶切, 物长度多在20 nt以上；退火温度在60℃以上；(2)将基因组DNA做适当酶切,然 后在其两端连接上相同的接头(见图2,这种接头可从生物制品公司购买) 后在其两端连接上相同的接头(见图2,这种接头可从生物制品公司购买)。
另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究, 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的 PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶, pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点 proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点 突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。
图４DD-PCR示意图 箭头所示为特异扩增产物
3.3 Representative difference (RDAanalysis PCR (RDA-PCR)
这是一种差减杂交 (subtractive hybridization) 与PCR相结合的技术，其整个操作程序完全不同于AP-PCR PCR相结合的技术，其整个操作程序完全不同于AP和DD-PCR。前2种方法是将两模板DNA或cDNA分别进行PCR DD-PCR。前2种方法是将两模板DNA或cDNA分别进行PCR 扩增,最后通过扩增产物的差异,分离和克隆特异扩增带, 扩增,最后通过扩增产物的差异,分离和克隆特异扩增带, 其缺点是需要将特异扩增产物从胶中切下来,提取DNA,再 其缺点是需要将特异扩增产物从胶中切下来,提取DNA,再 扩增后才能克隆。RDA-PCR只扩增区别于某一表型的特异 扩增后才能克隆。RDA-PCR只扩增区别于某一表型的特异 基因，因而更便于扩增产物的克隆与分析(见图5)。 基因，因而更便于扩增产物的克隆与分析(见图5)。
3 未知序列的基因打靶
根据已知序列进行基因克隆, 根据已知序列进行基因克隆,多数是重复 别人的工作, 别人的工作,或者是在别人工作的基础上继 续自己的工作, 续自己的工作,因而不存在新基因的克隆过 程。对未知序百度文库的基因克隆才是真正的创 造性研究。
3．1 随机引物法克隆未知序列基因
随机引物PCR(arbitrarily 随机引物PCR(arbitrarily primed PCR,AP-PCR)首先被用于基因组DNA或 PCR,AP-PCR)首先被用于基因组DNA或 RNA的指纹图谱(finger print)分析, RNA的指纹图谱(finger print)分析,后来也有人将这种方法用于克隆与表型相 关的基因或mRNA。该方法的理论依据是:表型受基因支配, 关的基因或mRNA。该方法的理论依据是:表型受基因支配,在一个生物体发 生了表型变化后,其基因组DNA很可能发生变化或出现不同基因的激活或关 生了表型变化后,其基因组DNA很可能发生变化或出现不同基因的激活或关 闭等;另一方面,如在寄生虫的发育过程中, 闭等;另一方面,如在寄生虫的发育过程中,不同发育阶段的虫体所表达的基因 很可能不同,如将不同发育阶段的虫体mRNA提取出来,用单一引物(随机引物, 很可能不同,如将不同发育阶段的虫体mRNA提取出来,用单一引物(随机引物, 其长度不超过16 nt)对不同时期的虫体mRNA进行扩增比较, 其长度不超过16 nt)对不同时期的虫体mRNA进行扩增比较,即可找出导致表 型变异的遗传学依据。这种方法是一种比较PCR,它要求至少有2 型变异的遗传学依据。这种方法是一种比较PCR,它要求至少有2种来自不同 表型但又很类似的基因组DNA或mRNA。AP-PCR扩增后的产物必须99%是一 表型但又很类似的基因组DNA或mRNA。AP-PCR扩增后的产物必须99%是一 致的, 致的,只有个别特异的产物出现在特异的表型个体中。该方法对表型或种源关 系相差甚远的生物个体之间没有比较意义(见图1)。 系相差甚远的生物个体之间没有比较意义(见图1)。