2015版微生物检验记录 (1)

合集下载

清洁验证微生物检查记录

清洁验证微生物限度检查记录
编号：SMP-09-00702-g
清洁对象名称
供样单位
取样点
检验日期
年月日
编号
报告日期
年月日
温度
℃
相对湿度
％
检验依据
《中国药典》2015年版四部《非无菌产品微生物限度检查》
标准规定
需氧菌≤100cfu/100cm²；霉菌酵母菌≤100cfu/100cm²
供试液的制备：用棉签擦拭取样点100cm²，将棉签放入无菌具塞玻璃试管中，加入10ml生理盐水中，振摇混匀，作为1:10的供试液。按《非无菌产品微生物限度检查》进行检验。
检查结果
需氧菌
培养箱型号：
培养箱编号：RHBC-ZK-
设定温度：
霉菌、酵母菌
培养箱型号：
培养箱编号：RHBC-ZK-
设定温度：
1
2
阴性
对照
1
2
阴性
Hale Waihona Puke 对照1天1天2天
2天
3天
3天
4天
4天
5天
5天
6天
7天
平均
平均
结果
结果
结论
检验人
复核人

药品的微生物限度检查

10ml
24～48h
紫红胆盐葡萄糖平板
10-1
无菌落
18～24h
有菌落
报告未检出
10g/10ml/ 100cm2供试品
3.耐胆盐革兰阴性菌定量检查操作示意图
以TSB为稀释液制供试液
一定量肠道增菌肉汤
20～25℃, 2h预增菌
1ml
24～48h
紫红胆盐葡萄糖平板
报告结果
10-1
18～24h
（六）梭菌的检查
梭菌增菌培养基
供试液的制备
书写检验记录
哥伦比亚琼脂培养基分离
1.梭菌检查程序
无菌落生长
过氧化氢酶试验
配培养基和稀释液
最终结果判断
有菌落
确证试验
10g/10ml/ 100cm2供试品
2.供试品梭菌检查操作示意图
各10ml
分别接种
一份80℃保温10min后迅速冷却
10-2
10-31ml10-110-210-3
各管加1ml
查可能菌数表
9ml 稀释液
有/无菌落
（二）大肠埃希菌检查
大肠埃希菌作为检验供试品是否受粪便污染的指示菌。
2015年版《中国药典》规定经口及呼吸道服给药的制剂，每1g、1ml或10cm2不得检出大肠埃希菌。
TSB 增菌培养
30℃～35℃
3～5d
1.平皿法
（1）基本程序：
数据处理
结果观察与计数
书写检验记录
平板接种
需氧菌的培养
供试液的制备
配培养基和稀释液
倒置培养 3～5d
30～35℃
TSA
不少于 0.1ml

微生物限度检查记录版

表：微生物限度检查记录（通用）三、大肠埃希菌检查胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：）微生物限度检查记录（30～35℃，3～5天）20℃～25℃，5～7天）沙氏葡萄糖琼脂培养基（配制批号：）三、控制菌检查（30-35℃）表：胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：）（30℃～35℃）胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：）五、耐胆盐革兰阴性菌检查胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号：），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号：）表：（含药材原粉的片剂）胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：）（30℃～35℃）胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV 沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：）五、耐胆盐革兰阴性菌检查胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、肠道菌增菌液体培养基（配制批号：），紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（配制批号：）表：微生物限度检查记录（蛇胆川贝液）三、大肠埃希菌检查胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、RV沙门增菌液体培养基（配制批号：），木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（配制批号：）、三糖铁琼脂（配制批号：）表：微生物限度检查记录（30～35℃，3～5天）20℃～25℃，5～7天）沙氏葡萄糖琼脂培养基（配制批号：）胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：）表：微生物限度检查记录（内包材）三、大肠埃希菌检查胰酪大豆胨液体培养基（配制批号：）、麦康凯液体培养基（配制批号：）麦康凯琼脂培养基（配制批号：）。

《2015版《中国药典》微生物检测与洁净室环境检测技术》-1

育
飞
天
教
育
微生物细胞结构示意图
• 细菌细胞结构图 •
教真菌细胞结构图天飞
育
飞
天
教
育
微生物的五大共性
飞
天
教
育
1、体积小，面积大； 2、吸收多，转化快；
3、生产旺，繁殖快；
4、适应强，易变异； 5、分布广，种类多。
飞
天
教
育
细菌形态特征
• 革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的细胞壁结构比较
天
教
育
试管
移液管
先用少许棉花塞于吸口端，然后用纸包好或装入金属吸管筒内，于121℃高压蒸汽灭菌20min后烘干。
飞
天
教
育
培养基的基础知识
溶
液体培养基用滤纸过滤，固体培养基用纱布块中夹薄层脱脂棉过滤
化
校正酸碱度
（1）先将卵磷脂加入少量蒸馏水低温加热溶解溶、再加吐温80混匀，，加入琼脂，静置15分钟。
细胞壁结构 G＋ G－
飞
天
教
育
脂多糖（LPS）,包括脂
厚度强度糖类含量脂类含量磷壁酸脂多糖
20－80nm 坚韧约45％约2％无
10－15nm 疏松约15％约20％有有
蛋白A，核心多糖和特异
性多糖三个部分。LPS对动物具有毒性作用，它牢固地结合在细胞表面，
只在菌体融解时才释放，
非细胞类：病毒、亚病毒(类病毒、朊病毒)
飞
天
教
育
细菌（bacteria）
• 细菌是单细胞的原核微生物
• 细菌是所有生物中数量最多的一类，据估计，其总数约有 5×10的三十次方个。 • 细菌主要由细胞壁、细胞膜、细胞质、核质体等部分构成 • 根据形状分为三类，即：球菌、杆菌和螺形菌（包括弧菌、螺菌、螺杆菌）

《中国药典》2015年版微生物计数法实例

SDA
试验二：需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数（薄膜过滤法）
试验组
（样+菌）
• 取10g供试品加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100mL，制成1:10的供试液，供试液分装成7支试管，每支9.9mL，每管加0.1mL的菌液，使试管中含菌量不大于 100cfu/mL，吸取1mL进行薄膜过滤，用500mLpH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗， 100mL/次，滤膜贴在相应的培养基上。每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。
水不溶性非油脂类供试品
• pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或TSB溶解或稀释成1:10供试液。分散力较差的供试品可在稀释液中加入表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。必要时进一步稀释。
油脂类供试品
• 取供试品加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。必要时进一步稀释。
1107 非无菌药品微生物限度标准（3/3）
1107 非无菌药品微生物限度标准----实例
微生物限度标准：需氧菌总数不得过103cfu/g，霉菌和酵母菌总数不得过102cfu/g，金黄色葡萄球菌不得检出，铜绿假单胞菌不得检出，大肠埃希菌不得检出，沙门菌不得检出，耐胆盐革兰阴性菌应小于102cfu/g。
/
/
T/S
0.92
0.91
0.92
1.07
1.08
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5-2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。
实例：霉菌和酵母菌总数计数培养基适用性检查结果（SDA）
菌种
被检培养基菌落数（T）

2015版纯化水微生物限度检查记录

R2A琼脂培养基配制养时间
累计培养时间
年月日时
年月日时
h
培养
时间
/
取样点编号
阴性对照
24h
1
□长菌
□未长菌
2
48h
1
□长菌
□未长菌
2
72h
1
□长菌
□未长菌
2
菌数报告
CFU/ml
/
标准规定
需氧菌总数每1ml不得过100CFU。
项目结论
□符合规定
□不符合规定
□符合规定
□不符合规定
纯化水微生物限度检查记录
检验日期
年月日
报告日期
年月日
检验依据
《中国药典》2015年版二部、四部通则微生物检查法
需氧菌总数检查：取纯化水50ml，用薄膜过滤器（0.45±0.02um，50MM直径）过滤，减压抽干。取出滤膜，将滤膜放入制备好的R2A培养基平板上，在30～35℃培养3天，计数。
需氧菌阴性对照：取50ml已灭菌的纯化水按供试品同法处理，作为阴性对照。
□符合规定
□不符合规定
□符合规定
□不符合规定
□符合规定
□不符合规定
□符合规定
□不符合规定
/
检验人：复核人：

药典三部(2015版)-通则-1101微生物检查法

1101 无菌检查法无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。

若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。

单向流空气区、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。

隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求.日常检验还需对试验环境进行监控。

培养基硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌培养；胰酪大豆胨液体培养基用于真菌和需氧菌的培养。

培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基或成品培养基。

配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。

制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境,若保存于非封闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。

1. 硫乙醇酸盐流体培养基胰酪胨15.0g 氯化钠2.5g酵母浸出粉5。

0g 新配制的0。

1% 刃天青溶液1。

0ml无水葡萄糖5。

0g 琼脂0.75gL-胱氨酸0.5g 水1000ml硫乙醇酸钠0.5g（或硫乙醇酸) （0。

3ml）除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性,煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH，使灭菌后在25℃的pH值为7。

1±0.2。

分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层(粉红色）不超过培养基深度的1/2。

灭菌。

在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5,否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却,只限加热一次，并防止污染。

清洁验证微生物记录

1.方法概述
用4个无菌棉签分别在下料口处按每个棉签100cm2/棉签擦拭取样，先取无菌棉签1支，用无菌的0.9%的氯化钠溶液5ml浸湿，去演时将棉签头按在取样表面上，以30度角与取样表面接触，平稳而缓慢得擦拭取样表面，在向前移动的同时将其一边移到另一边，每支棉签擦拭过程覆盖100cm2整个表面，翻转棉签，用另一面再进行擦拭，方向与前一次垂直，然后将棉签端用无菌剪刀置于100ml的0.9%无菌氯化钠溶液中，左右振摇5min，做好标识。

作为供试品溶液。

2.合格标准
2.1本品阴性对照组均不得有菌生长。

2.2本品细菌、霉菌和酵母菌总数（cfu/ml），每不得过cfu。

3.试液、仪器准备
仪器名称：电热恒温培养箱仪器型号：DH-500A 仪器编号：QC-SB-013 仪器名称：生化培养箱仪器型号：SHP-150 仪器编号：QC-SB-0134 PH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液配制批号：营养琼脂培养基配制批号：
玫瑰红钠琼脂培养基配置批号：
4. 细菌、霉菌和酵母菌数检查：
4.1供试品制备：取供试品，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至ml。

混匀后，制备稀释级别为稀释液，备用。

4.5检验结果：本品菌落总数数为。

检验人：复核人：年月日。

2015年版药典微生物修订内容

科
增订了原敷料、中药提取物及饮片的微生物限
度标准。
兴
修订内容
依
1 、菌数计数结果以10n表示；
科
2、以需氧菌总数取代细菌数。以耐胆盐革兰
阴性菌取代大肠菌群。
依科制药
分类及其标准
1、制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌
新依
的制剂和原辅料应符合无菌检查法规定 2、用于手术、烧伤或严重创伤的局部给药制剂应符合无菌检查法规定
新
依
科
2015版药典微生物修订内容
兴
依科
一综合车间（二车间）
2015.10
依科制药
微生物计数法主要内容
新 2010版
依
科
细菌数—
兴营养琼脂培养基
依
科
霉菌和酵母菌数 — 玫瑰红钠琼脂培养基
2015版
1、细菌数修订为需氧菌总数。 2、霉菌和酵母菌数修订为霉菌和酵母菌总数。 3、需氧菌总数：是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数(包括真菌菌落数）。 4、霉菌和酵母菌总数：是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数(包括细菌菌落数) 。若为因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含有抗生素的（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄琼脂培养基或其它选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。
依
霉菌及酵母菌总数沙氏葡萄糖琼脂（ SDA）
科
依科制药
新修订后
依
耐胆盐的革兰氏阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌、
科
铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌、白色
念珠菌
兴
修订前

微生物限度检验记录表 2015版药典

各稀释度菌落数
阴性对照
菌落数(cfu)
平皿
1∶1
1∶10
1∶102
1
2
平均
样品编号
平皿编号
各稀释度菌落数
阴性对照
菌落数(cfu)
平皿
1∶1
1∶10
1∶102
1
2
平均
标准规定
纯化水需氧菌总数不超过100cfu/mL
注射用水需氧菌总数不过超过10cfu/100ml
结论
微生物限度□符合□不符合标准要求。
审核：复核：检验-01-0
使用编号
微生物限度检验记录
样品名称：□纯化水□注射用水取样日期：
取样数量:样品编号：
培养开始时间：月日结束培养时间：月日
R2A琼脂培养基批号：培养温度：℃
样品编号
平皿编号
各稀释度菌落数
阴性对照
菌落数(cfu)
平皿
1∶1
1∶10
1∶102
1
2
平均
样品编号
平皿编号

微生物限度记录2015

微生物限度检查记录(二)编号：SMP-09-00702-e-1检品名称：检品规格：检品批号：取样日期：检验日期：报告日期：检验依据：《中国药典》2015年版四部《非无菌产品微生物限度检查》仪器：隔水式恒温培养箱型号：编号：RHBC-ZK- 霉菌培养箱型号：编号：RHBC-ZK-恒温培养箱型号：编号：RHBC-ZK-1、需氧菌、霉菌和酵母菌供试品制备：取供试品 g，加稀释液 ml，用适宜的方法混匀，作为1：10供试品溶液。

取1：10供试品溶液1ml，加稀释液至10ml，得到1：100供试品溶液。

取1：100供试品溶液1ml，加稀释液至10ml.得到1：1000供试品溶液。

按薄膜过滤法进行检查。

（稀释液,冲洗液：0.9％无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液）观察结果：需氧菌数30～35℃培养3～5天霉菌、酵母菌数20～25℃培养5～7天胰酪大豆胨琼脂培养基，批号：沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号：取上述1：10的供试液10ml，接种至胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。

取上述培养物1ml接种于100ml麦康凯液体培养基中，42～44℃培养24～48小时。

取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。

观察结果：取供试品，用胰酪大豆胨液体培养基作为稀释剂制成1:10供试液，混匀，在20～25℃培养约2小时。

取上述预培养物10ml接种至100ml肠道菌液体培养基中，30～35℃培养24～48小时后，划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～24小时。

取相当于0.1g、0.01g和0.001g（或0.1ml、0.01ml和0.001ml）的供试品的预培养物接种至 ml的肠道菌液体培养基中，30～35℃培养24～48小时。

取上述培养物分别划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～24小时。

观察结果：取供试品10g或10ml，直接接种到200ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。

微生物限度检测方法验证操作规程(2015年版)

微生物限度检测方法验证操作规程1 目的确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。

2 依据《中国药典》2015版。

3 范围所有需进行微生物限度检测的产品。

4 责任4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。

4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。

5 程序5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。

5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。

6 内容6.1 概述通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。

根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。

若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。

6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证6.2.1 验证用菌株铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]黑曲霉[CMCC（F）98 003]白色念珠菌[CMCC（F）98 001]6.2.2 验证用菌液制备6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。

取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。

6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养2～3天。

2015版中国药典微生物限度

1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑶油脂类供试品
• 取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯 80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般不超过 40℃（特殊情况下，最多不超过 45℃），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热的稀释液使成 1∶10供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面活性剂的稀释液进一步 10倍系列稀释。
– 培养和计数培养条件和计数方法同平皿计数法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
• 菌数报告规则
– 以相当于 1g、1ml 或10cm2 供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1 报告菌数（每张滤膜过滤1g、1ml 或10cm2 供试品）,或﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20～25℃培养5 ~7天，观察菌落生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15，则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。

注射用水微生物计数原始记录

非无菌产品微生物限度检查——微生物计数法原始记录
产品名称
注射用水
型号/规格
批量
取样量
取样日期
来源
检验日期
产品批号
产品编号
有效期至
请验单号
温湿度
报告日期
报告编号
检验依据
《中国药典》2015年版
试验方法：薄膜过滤法
试验组：取注射用水100ml至无菌滤杯中，过滤，过滤完毕，取出滤膜，菌面朝上，贴于R2A琼脂培养基上，平行制备2张滤膜。30〜35℃培ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ不少于5天，计数。
阴性对照：以100ml 0.9%无菌氯化钠代替供试液，按试验组方法和条件进行操作，制备1张滤膜。30〜35℃培养不少于5天，计数。
使用稀释液
0.9%无菌氯化钠，配制批号：
微生物计数
判断标准
100ml注射用水中需氧菌总数不大于10cfu，阴性对照无菌生长，为合格
培养基名称
R2A琼脂培养基
培养基配制编号
仪器名称
仪器编号
培养温度
培养时间
观察时间
注射用水
阴性对照
皿1
皿2
皿3
第1天
第2天
第3天
第4天
第5天
第6天
第7天
平均值
计数结果
结论：注射用水，批号，
微生物限度检查——微生物计数结果：
操作人：日期：复核人：日期：

2015年版微生物限度检验操作规程

青岛**有限公司文件目的建立微生物限度检查操作规程，规范操作，保证结果的准确性。

范围成品、辅料、内包装袋及纯化水的检验。

责任品管部微生物限度检验人员内容概述：本检验操作规程依据中国药典2015年版四部《通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。

微生物计数法一、计数方法1、微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。

2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。

3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。

供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。

4、菌种及菌液的制备4.1试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0袋），并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。

计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验见表1。

4.2菌液制备按表1规定培养各试验菌株。

取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。

采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。

菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。

黑曲霉孢子悬液可保存在2-8℃，在验证过的贮存期内使用。

表1 试验菌液的制备和使用4.3阴性对照为确认试验条件是否符合要求，应进行对照试验，阴性对照试验应无菌生长。

4.4培养基适用性检查按照表1规定，接种不大于100cfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置规定的条件下培养。

2015版微生物检测步骤(1)

药品需氧菌总数、霉菌酵母菌总数、大肠埃希菌、耐胆盐革兰阴性菌、沙门菌测定以一批需要检测微生物五项为例进行讲解：第一天一、所需物品的准备：1、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA） 6×20ml；2、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA） 6×20ml；3、培养皿 2×6个4、胰酪大豆胨液体培养基（TSB） 5×100ml；1×90ml；2×9ml；2+2+10ml5、肠道增菌液体培养基 6×10ml：10-13支，10-21支，10-31支，空白1支6、1ml枪头若干，5ml枪头2个二、操作步骤（一）取10g样品到90ml TSB中制成1：10的供试液（10-1）1、分别取1ml至4个平皿，3支肠道增菌液体培养基中（其中一支管中待加入1ml铜绿假单胞菌菌液，一支待加入1ml大肠埃希菌菌液）；2、分别取10ml至2瓶100ml TSB中（其中1瓶待加入1ml大肠埃希菌菌液）；3、取1ml至9ml TSB中，得1：100供试液（10-2）A、分别取1ml至4个平皿，1支肠道增菌液体培养基中；B、取1ml至9ml TSB中，得1：1000供试液（10-3）a、取1ml至1支肠道增菌液体培养基中；（二）空白TSB液：1、分别取1ml至4个平皿中，1支肠道增菌液体培养基中；2、取10ml至1瓶100ml TSB液中；（三）另分别取10g样品，分别至100ml TSB液中（其中1瓶待加入1ml沙门菌菌液）三、后续步骤（一）12个平皿平均分成两份，分别包括【空白2个，1：10供试液2个（10-1），1：100供试液2个（10-2）】一份倾注TSA，摇匀，30-35℃培养5天后计数；一份倾注SDA，摇匀，20-25℃培养7天后计数；（二）进入阳性对照室，加入相应的菌液（提前一天制备）1ml；均置30-35℃培养第二天 24小时后一、所需物品的准备：1、麦康凯液体培养基 3×100ml；(取1ml→100ml）2、RV沙门增菌液体培养基 3×10ml；（取0.1ml→10ml）3、1ml枪头若干；二、操作步骤（一）大肠埃希菌：分别取大肠埃希菌的三个供试液（+供试品，+供试品和菌液，空白）1ml 至100ml麦康凯液体培养基中；（二）沙门菌：分别取沙门菌的三个供试液（+供试品，+供试品和菌液，空白）0.1ml至10mlRV沙门增菌液体培养基中；三、后续步骤（一）大肠埃希菌：置42-44℃中培养基48小时；（二）沙门菌：置30-35℃培养24小时；第三天 48小时后一、所需物品的准备：1、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基 6×20ml（不需灭菌）2、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基 3×20ml（不需灭菌）二、操作步骤：（一）耐胆盐革兰阴性菌分别取少量肠道增菌液体培养基培养物划线于紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基平皿上（二）沙门菌分别取少量RV沙门增菌液体培养基培养物划线于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平皿上三、后续步骤（一）耐胆盐革兰阴性菌置30-35℃培养24小时；（二）沙门菌置30-35℃培养48小时第四天一、所需物品准备：1、麦康凯琼脂培养基 3×20ml二、操作步骤（一）大肠埃希菌分别取少量麦康凯液体培养基培养物划线于麦康凯琼脂培养基平皿上三、后续步骤（一）大肠埃希菌置30-35℃培养72小时（二）耐胆盐革兰阴性菌判定结果第五天沙门菌判定结果或者穿刺接种第六天需氧菌总数计数第七天大肠埃希菌判断结果第八天霉菌酵母菌总数计数。

微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)

霉菌与酵母菌总数、控制菌得检查。

二、引用标准：《中国药典》２015年版（通则1１05-1106）三、目录1。

微生物限度标准2.设备、仪器及用具3。

消毒液、稀释剂、试液及培养基4。

检查总则(通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法,通则1106非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法）5。

微生物计数法检查6.控制菌检查法7．实验技术8、附件１.微生物限度标准非无菌药用原料及辅料得微生物限度标准(2)．目测霉变者以不合格论。

（３）。

“无”为标准依据或无相应规定。

准依据或无相应规定.2.设施、仪器及用具2、１、设施：2、１、1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查得要求。

检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染得措施不得影响供试品中微生物得检出。

单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。

２、1、2．其她设备:高压蒸汽灭菌器;细菌培养箱(3０~3５℃);霉菌培养箱(２5～2８℃)；电炉(或其她适宜得加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱(250~３00℃)；电冰箱。

生化试剂储存箱。

2、2仪器及器皿2、2、1。

菌落计数器；显微镜（15０0X）;电子天平或药物天平（感量0、1ｇ）;ｐH 系列比色计。

2、2、2．玻璃器皿：锥形瓶(2５０~３００ml,内装玻璃珠若干)、研钵（玻璃或陶瓷制,∮10～12ｃm)、培养皿（∮9 ｃm）、量筒(１00ml）、试管（1８×180ｍm）及塞、吸管（1ml分度0、01，10ml分度0、１)、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。

2、2、3新购得玻璃器皿得清洁:先用流水冲洗，浸泡于1％~２%盐酸（工业用）液中约2～6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗.用于化学分析得玻璃仪器,需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2～3次，晾干备用。

2、3用过得玻璃器皿：2、3、1未被病原微生物污染得器皿：可随时洗涤.用清水冲洗(或浸泡)，除容量仪器外，可用毛刷与肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净,晾干备用.容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗,最后以纯化水涮洗2～3次.试管及培养皿:先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内,经1２1℃灭菌30 分钟.趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗,最后以流水涮净。

2015年版中国药典微生物限度检查法

1.1 总则：
• 环境： – 微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。(在不低于GMP 现行版要求的D 级洁净环境、局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进行)【10版：在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内】。 – 检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。 – 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
菌数报告规则
– 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm² 供试品中所含的微生物数。 – 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1 时，以﹤1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备 – ⑴ 水溶性供试品
• 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要，调节供试液 pH 值至 6 ～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
1.3.1菌液制备及使用
试验菌株试验菌液的制备
金黄色葡萄球菌〔CMCC(B) 26 003)〕
铜绿假单胞菌〔CMCC（B)10 104〕枯草芽孢杆菌〔CMCC(B) 63 501〕白色念珠菌〔CMCC(F) 98 001〕
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基【10版：营养肉汤或营养琼脂培养基】 30～35℃，18～24小时