DNA的生物合成

复制 亲代DNA
子代DNA
目录

本章主要内容： DNA复制的基本特征 DNA复制的酶学和拓扑学变化 原核生物DNA复制过程 真核生物DNA生物合成过程 逆转录和其他复制方式
目录
第 一 节 DNA复制的基本特征
Basic Rules of DNA Replication

DNA复制的主要特征
ori ori ori ori
5’
3’
3’ 5’
目录
5’ 3’
ori
ori
ori
ori
3’ 5’
5’ 3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
复制
三、DNA复制反应呈半不连续特征
3
领头链 (leading strand)
5 3
解链方向
后随链 (lagging strand)
5
目录
顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的， 这股链称为领头链(leading strand) 。
引物(primer): 提供3-OH末端使dNTP可以依次
聚合；
其他的酶和蛋白质因子。
目录
(dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi
RNA引物
RNA引物
子代DNA
目录

聚合反应的特点: DNA 新链生成需RNA引物和模板； 新链的延长只可沿5 → 3方向进行。
末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相
邻的DNA链连接成一条完整的链。
目录

DNA连接酶的作用：
5’
O
3’
3’
O P OO-
HO
ATP
5’
DNA连接酶
ADP 5’ 3’
O O P OO-
3’
5’

功能： DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的 作用。 在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺 口作用。
目录
-复合物由6种亚基组成：、、、、、
2个-亚基分别和1个核心酶相互作用，其 柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的 2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成 前导链和后随链。 功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶 活性的作用
目录
DNA-pol Ⅰ （109kD）

功能： 对复制中的错误进行校读，对复制和修复 中出现的空隙进行填补。
• DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。
• DNA-pol Ⅱ对模板的特异性不高，即使在已发生
损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因
此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。
目录
（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种
DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。 参与低保真度的复制 。 在线粒体DNA复制中起催化作用。 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。 在复制过程中起校读、修复和填补缺 口的作用。
DNA-pol Ⅲ
目录
原核生物的DNA聚合酶
DNA-pol I DNA-pol II 分子量(kD) 组成 分子数/细胞 5→3核酸外切酶活性 基因突变后的致死性 109 单肽链 400 有 可能 120 ？ ？ 无 不可能 DNA-pol III 250 多亚基不对称 二聚体 20 无 可能
DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把 DNA解成单链，它才能起模板作用。
目录
（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态
原核生物复制起始的相关蛋白质
蛋白质（基因） DnaA (dnaA) DnaB (dnaB) DnaC (dnaC) DnaG (dnaG) SSB 拓扑异构酶 (gyrA, B) 引物酶 单链DNA 结合蛋白 解螺旋酶 通用名 功能 辨认起始点 解开DNA双链 运送和协同DnaB 催化RNA引物生成 稳定已解开的单链 理顺DNA链
传信息，体现了遗传的保守性。 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础， 但不是绝对的。
目录
A G G T A C T G C C A C T G G
T C C A T G A C G G T G A C C
C C A C T G G
G G T G A C C
AT GC GC TA AT CG TA GC CG CG AT CG TA GC GC
目录
真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较
E.Coli Ⅰ Ⅱ Ⅲ DnaG 真核细胞 功能 填补复制中的DNA空隙，DNA修复和 重组 复制中的校对，DNA修复 DNA修复 线粒体DNA合成 前导链合成 引物酶 后随链合成
目录
真核生物的DNA聚合酶
DNA-pol 分子量（kD） 5→3聚合活性 3→5核酸外切 酶活性 功能 α 16.5 中 起始引 发，引 物酶活 性 β 4.0 ？ 低保 真度 的复 制 γ 14.0 高 + δ 12.5 高 + ε 25.5 高 + 填补引物 空隙，切 除修复， 重组
拓扑异 构酶Ⅰ
拓扑异 构酶Ⅱ
切断DNA分子两股链，断端通过 切口旋转使超螺旋松弛。 利用ATP供能，连接断端， DNA 分子进入负超螺旋状态。
目录

拓扑酶的作用方式：
目录
四、DNA连接酶连接复制中产生的 单链缺口

DNA连接酶(DNA ligase)作用方式：
连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P
核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的 末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是 有方向性的。
目录
DNA pol Ⅰ的校读功能
A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活 性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。
目录
三、复制中的解链伴有DNA 分子 拓扑学变化
态并保护单链的完整。
目录
（二）DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态

复制过程正超螺旋的形成：
10
局部解链后 8
目录
解链过程中正超螺旋的形成
目录

拓扑异构酶作用特点： 既能水解 、又能连接磷酸二酯键。

拓扑异构酶分类：
拓扑异构酶Ⅰ
拓扑异构酶Ⅱ
目录

作用机制： 切断DNA双链中一股链，使DNA 解链旋转不致打结；适当时候封 闭切口，DNA变为松弛状态。 反应不需ATP。
目录

子链继承母链遗传信息的几种可能方式:
全保留式
半保留式
混合式
Байду номын сангаас目录

密度梯度实验:
含15N-DNA的细菌
培养于普 通培养液
梯度离心结果
第一代
继续培养于 普通培养液
第二代 ——实验结果支持半保留复制的设想。

半保留复制的意义:
按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA
的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗
目录
第 三 节 原核生物DNA复制过程
The Process of DNA Replication in Prokaryotes
+
AT GC GC TA AT CG TA GC CG CG AT CG TA GC GC
母链DNA
复制过程中形成 的复制叉
子代DNA
目录
二、DNA复制从起点向两个方向延伸
原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起 点（origin）。复制从起点开始，向两个方向
进行解链，进行的是单点起始双向复制。
复制中的放射自显影图象
目录
ori
ter
A
B
C
A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉
C. 复制接近终止点(termination, ter)
真核生物每个染色体有多个起始点，是多复 制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间 的距离定为一个复制子(replicon) 。复制子是 独立完成复制的功能单位。
3´
| | | | | | | | | | |
3´
?
5´
T C G AA G T C C T A G C G A C
3 5外切酶活性: 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 5 3外切酶活性: 能切除突变的 DNA片段。
（一）原核生物有3种DNA聚合酶
DNA-pol Ⅰ
DNA-pol Ⅱ
The Enzymology and Topology of DNA Replication
目录

参与DNA复制的物质: 底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，
简写为 DNA-pol；
模板(template): 解开成单链的DNA母链；
聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；
复制出错时有即时校对功能。
目录
（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择
利用“错配”实验发现，DNA pol Ⅲ对核苷酸的 参入（incorporation）具有选择功能。
DNA pol Ⅲ对嘌呤的不同构型表现不同亲和力， 因此实现其选择功能。
目录
（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨 认切除错配碱基并加以校正
目录
E. Coli 基因图
目录
解螺旋酶(helicase) ——利用ATP供能，作用于 氢键，使DNA双链解开成为两条单链。 引物酶(primase) ——复制起始时催化生成RNA 引物的酶。 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding
protein, SSB) ——在复制中维持模板处于单链状
半保留复制(semi-conservative replication) 双向复制(bidirectional replication) 半不连续复制(semi-discontinuous replication)
目录
一、 DNA以半保留方式进行复制

半保留复制的概念: DNA生物合成时，母链DNA解开为两 股单链，各自作为模板(template)按碱基配 对规律，合成与模板互补的子链。子代细 胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过 来，另一股单链则完全从新合成。两个子 细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。 这种复制方式称为半保留复制。
生物化学与分子生物学
目录
第十四章
DNA的生物合成
DNA Biosynthesis ( Replication )
目录
复制(replication) 是以DNA为模板的DNA 合成，是基因组的复制过程。在这个过程中， 亲代DNA作为合成模板，按照碱基配对原则 合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸 聚合反应。
目录
DNA聚合酶Ⅲ全酶结构
全酶结构包括：
•２个核心酶 •1个-复合物（、、 、、、 6种亚 基） •1对-亚基（可滑动 的DNA夹子）
目录
核心酶由、和亚基组成： 亚基（130 000）主要功能是合成DNA 亚基具有35外切酶活性（复制保真性 所必需）亚基可增强其活性 亚基可能起组装作用 两侧的β亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模 板滑动的作用
目录
一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合
全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent
DNA polymerase)
简称：DNA-pol 活性： 1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性
目录

核酸外切酶活性:
5´
AG C T T C A G G A T A

线粒体 延长子 DNA复 链的主 制 要酶， 解螺旋 酶活性
目录
二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功 能实现复制的保真性
复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能 准确传代的基本原理。 此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。
目录

DNA复制的保真性至少要依赖三种机制： 遵守严格的碱基配对规律；
另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不
能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的
链称为后随链(lagging strand) 。复制中的不连
续片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复 制的半不连续性。
目录
第 二 节 DNA复制的酶学和拓扑学变化
也是基因工程的重要工具酶之一。
目录
DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化 3,5-磷酸二酯键生成的比较
提供核糖3-OH DNA聚合酶 引物或延长中的 新链 提供5-P 游离dNTP 去PPi 结果 (dNTP)n+1
连接酶
拓扑酶
复制中不连续的两条单链
切断、整理后的两链
不连续→连续链
改变拓扑状态
目录
N端
DNA-pol Ⅰ 木瓜蛋白酶
C端
小片段
323个氨基酸 5 核酸外切酶活性
大片段/Klenow 片段
604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 • Klenow片段是实验室合成DNA，进行 分子生物学研究中常用的工具酶。
目录
DNA-pol Ⅱ（120kD）