DNA的生物合成

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• 解螺旋酶(helicase) ——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链 解开成为两条单链 • 引物酶(primase) ——复制起始时催化生成RNA引物的酶 • 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) ——在复制中维持模板处于单链状态并保护单 链的完整
需要解决两个问题： 1. DNA解开成单链，提供模板。
2. 合成引物，提供3-OH末端。
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原核生物E.coli为例
复制由起始点 oriC(origin)开始双向复制
E.coli的复制起始点oriC（245bp的DNA组分） 序列分析有如下特点 3组串连重复序列(13bp），每个顺序都由GATC开始 2组反向重复序列(9bp) 4个dnaA蛋白结合部位
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（一）解螺旋酶、引物酶和单链DNA结合蛋白
原核生物复制起始的相关蛋白质
蛋白质（基因） DnaA (dnaA) DnaB (dnaB) DnaC (dnaC) DnaG (dnaG) SSB 拓扑异构酶 (gyrA, B) 引物酶 单链DNA 结合蛋白 解螺旋酶 通用名 功能 辨认起始点 解开DNA双链 运送和协同DnaB 催化RNA引物生成 稳定已解开的单链 理顺DNA链
• 增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)在复制起始和延长中起关键作用。
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（二）复制的延长
3 5
5 3
亲代DNA
3 5
领头链 随从链
3
引物 核小体
5
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（三）复制的终止
• 染色体DNA呈线状，复制在末端停止。
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5’ 3’
ori
ori
ori
ori
3’ 5’
5’ 3’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
复制子
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（2）起始点和方向 ①原核生物和真核生物复制都是在DNA分子特定的 位置起始的，如大肠杆菌起始点有固定的重复的保守顺
序，可被酶识别。
②方向：大多是双向、对称复制, 也有单向或不对称 的。 ③速度： 原核生物复制叉移动快(约105bp/min); 真核生物复制叉移动慢 (约5×102～5×103bp/min)
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二、真核生物的DNA生物合成
G2
DNA合成期
M 哺乳动物的 细胞周期
S G1
• 细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关 键点。 G1→S 及 G2→M 的调节，与蛋白激酶活 性有关。 • 蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而 实施调控作用。
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（一）复制的起始
• 真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子 复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活 而不是同步起动。 • 复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ （解螺旋酶活性）参与。还需拓扑酶和复制因子 (replication factor, RF)。
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二、双向复制
原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向 两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制 叉，称为双向复制。
复制中的放射自显影图象
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Cairns复制模型—θ型复制
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ori
ter
A
B
C
A. 环状双链DNA及复制起始点 B. 复制中的两个复制叉
C. 复制接近终止点(termination, ter)
子代DNA
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第一节
复制的基本规律
Basic Rules of DNA Replication
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一、半保留复制的实验依据和意义
•半保留复制的概念
DNA 生物合成时，母链 DNA 解开为两 股单链，各自作为模板(template)按碱基配对 规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的 DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另 一股单链则完全从新合成 。两个子细胞的 DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制 方式称为半保留复制。
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细菌复制终止区含有多个约22bp的终止子 (terminator)位点，E. coli 有7个终止子位点。
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新合成的两条 染色体DNA分子相互 连在一起，被拓扑 异构酶IV分离
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DNA复制的分子机制的基本特点




复制的结果是半保留复制，复制的过程是 半不连续复制。 复制以复制单位进行，起始于特定的位点 （复制起点）。 复制可以是单向，也可以是双向，后者更 为常见。 复制时，DNA的两条链都从5′端向3′端延 伸。
• 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制
的半不连续性。
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•参与DNA复制的物质
底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP 聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写 为 DNA-pol
模板(template) : 解开成单链的DNA母链
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（二）真核生物的DNA聚合酶
DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 起始引发，有引物酶活性。 参与低保真度的复制 。 在线粒体DNA复制中起催化作用。 延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。 在复制过程中起校读、修复和填补缺 口的作用。
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复制起始点、复制子与复制叉（动 画演示）
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三、复制的半不连续性
3
5 3
领头链 (leading strand)
解链方向
随从链 (lagging strand)
5
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• 顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，
这股链称为领头链(前导链）。
• 另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能 顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称 为随从链（后随链、滞后链）。复制中的不连续 片段称为岡崎片段(okazaki fragment)。
5´
T C G AA G T C C T A G C G A C
• 3'→5'外切酶活性 能辨认错配的碱基对，并将其水解。 • 5'→3' 外切酶活性 能切除突变的 DNA片段。
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功能：
① 5′→3′聚合酶活性； 酶与模板结合后构象改变，识别碱基，正 确配对后才发挥聚合作用 ② 3′→ 5′外切酶活性； 主要是对新生DNA链进行校对，防止“错 配” ③ 5′→3′外切酶活性。 主要是对DNA损伤的修复，以及在DNA复 制时RNA引物的切除及其空隙的填补
第 九 章
DNA的生物合成 (复制)
DNA Biosynthesis，Replication
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中心法则（ central dogma）
遗传信息传递方向的规律
基因表达：
是指将遗传信息由DNA转录为RNA、再翻译成蛋白质的过程
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复制(replication)
是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板 合成子链DNA的过程。 复制 亲代DNA
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5’
O
3’
3’
O P OO-
HO
ATP
5’
DNA连接酶
ADP 5’ 3’ 3’
O O P OO-
5’
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•功能
• DNA 连接酶在复制中起最后接合缺口的
作用。
• 在 DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺 口作用。 • 也是基因工程的重要工具酶之一。
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一、原核生物的DNA生物合成
（一）复制的起始
全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNAdependent DNA polymerase) 简称：DNA-pol
活性：1. 5'→3' 的聚合酶活性
2. 核酸外切酶活性
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• 核酸外切酶活性
5´
AG C T T C A G G A T A

3´
| | | | | | | | | | |
3´
?
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引发体和引物
Dna B、 Dna C Dna A 5 3 DNA拓扑异构酶 SSB 5 3
含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA 复制起始区域的复合结构称为引发体。
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3
5 3
引物
5
引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。
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DNA复制的调控是在起始阶段进行的， 一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子 完成复制。 复制起点是以一条链为模板起始DNA 合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不 在同一点上（不对称复制，如D环复制）。
在一个完整的细胞周期中，每一个复 制起点只使用一次，完成一次复制过程。 多数生物的复制起点，都是富含A.T。
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（二）复制的延长
复制的延长指在 DNA-pol 催化下， dNTP 以 dNMP的方式逐个加入引物或延长中的子链上， 其化学本质是磷酸二酯键的不断生成。
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3' 5'
DNA-pol
OH 3'
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• 拓扑异构酶作用特点
既能水解 、又能连接磷酸二酯键
•分 类
拓扑异构酶Ⅰ 拓扑异构酶Ⅱ
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五、DNA连接酶
• DNA连接酶(DNA ligase)作用方式
连接 DNA 链 3-OH 末端和相邻 DNA 链 5-P
末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相
邻的 DNA 链连接成一条完整的链。以 N ＡＤ ＋ （大肠杆菌）或ＡＴＰ（真核细胞）为能源。
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1、拓扑异构酶解开超螺旋。 2、Dna A蛋白识别并在ATP存在 下结合于四个9bp的重复序列。 3、在类组蛋白（HU、ATP参与下, Dan A蛋白变性13个bp的重复序 列,形成开链复合物。 4 、Dna B借助于水解ATP产生的 能量在Dna C的帮助下沿5’ →3’ 方向移动，解开DNA双链，形成 前引发复合物。 5、单链结合蛋白结合于单链。 6、引物合成酶（Dna G蛋白）开 始合成RNA引物。
可见，DNA polⅠ是1个多功能酶
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N端
DNA-pol Ⅰ 木瓜蛋白酶
C端
小片段
323个氨基酸 5'→3'核酸外切酶活性
大片段/Klenow 片段
604个氨基酸 DNA聚合酶活性 3'→5'核酸外切酶活性 • Klenow片段是实验室合成DNA，进行 分子生物学研究中常用的工具酶。
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DNA源自文库pol Ⅲ
母链DNA
复制过程中形成 的复制叉
子代DNA
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• 密度梯度实验
梯度离心结果
含重氮N15-DNA的细菌
培养于普 通培养液
第一代
继续培养于 普通培养液
第二代 ——实验结果支持半保留复制的设想。
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• 半保留复制的意义
按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA
的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗
传信息，体现了遗传的保守性。 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础， 但不是绝对的。
5' 3'
dCTP
dGTP
dTTP
dATP
dCTP
dATP
dGTP
dTTP
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领头链的合成
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随从链的合成
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（三）复制的终止
• 原核生物基因是环状DNA，双向复制的复制 片段在复制的终止点(ter)处汇合。
ori
0
ori
50
82
32
ter
SV40
ter
E.coli
引物(primer): 提供3’-OH末端使dNTP可以依次聚合 其他的酶和蛋白质因子
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一、复制的化学反应
(dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi
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• 聚合反应的特点
除了底物和酶外，DNA 新链生成需引
物和模板；
新链的延长只可沿5’→ 3’方向进行 。
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二、DNA聚合酶
(250kD)
功能 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。
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α亚基具有5′→3′方向合成DNA的催化活性 ε亚基具有3′→5′外切酶活性，起校对功能， 可提高聚合酶Ⅲ复制DNA的保真性 亚基可能起组建的作用 β亚基犹如夹子，功能是识别引物、夹住DNA 分子向前滑动 亚基起着促使核心酶二聚化的作用 其余的亚基构成 -复合物，主要功能是帮助 亚基夹住DNA（也称夹子装置器），并有 增强核心酶活性的作用
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前导链是连续合成，而后续链是不连续合成。 DNA的合成始于RNA引物的合成，因此前导 链只有一次RNA合成，滞后链的冈崎片断每 个都有RNA引物的合成。RNA引物随后由 DNA片段替换，相邻的DNA片段连接形成一 条完整的DNA链。 DNA聚合酶的校对功能和细胞的错误修复功 能维持DNA分子的准确性和忠实性。
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A G G T A C T G C C A C T G G
T C C A T G A C G G T G A C C
C C A C T G G
G G T G A C C
AT GC GC TA AT CG TA GC CG CG AT CG TA GC GC
+
AT GC GC TA AT CG TA GC CG CG AT CG TA GC GC