常用菌悬液的制备、保存及使用方法

几种菌种的保存及复苏方法

几种菌种的保存及复苏方法(含扩增方法)定期移植法,亦称传代培养保藏法,包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。

是指将菌种接种于适宜的培养基中,最适条件下培养,待生长充分后,于4~6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

操作步骤如下:1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿,如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等,经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。

1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水,按培养基配方称取各项材料,依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解,最后加足水量,搅拌均匀。

1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温,根据要求加稀酸(0.1mol/L盐酸)或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。

加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌,防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。

1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂,如琼脂、明胶等。

将凝固剂加入液体培养基中,加热并不断搅拌至融解,再补足所蒸发水分。

1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉,将配好的培养基趁热过滤并分装。

斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4~5mL),穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。

分装过程中勿使培养基沾污管口,以免弄湿棉塞造成污染。

1.6 包扎标记将试管加棉塞,外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。

1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌,通常蒸汽灭菌为121℃,15~20min。

1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面,斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。

1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验,通常30℃培养1~3天。

无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。

2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。

适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌(如毛霉、根霉等)。

2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。

适用于细菌和酵母菌等。

真菌菌悬液的制备

真菌菌悬液的制备1）白色念珠菌悬液的制备1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管吸加适量沙堡液体培养基于管中，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。

取含 5.0 ml～10.0ml 沙堡液体培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37℃培养18h～24h。

用接种环取第 1 代培养的菌悬液，划线接种于沙堡琼脂培养基平板上，于37℃培养18h～24h。

挑取上述第 2 代培养物中典型菌落，接种于沙堡琼脂斜面，于37℃培养18h～24h，即为第 3 代培养物。

2）取第3代～14代的沙堡琼脂培养基斜面新鲜培养物（18h～24h），用 5.0 ml 吸管吸取 3.0 ml～5.0ml 稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。

随后，用 5.0ml 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，或在手掌上振敲80次，以使白色念珠菌菌悬浮均匀。

3）菌悬液的含菌量和菌片制备按2.1.1.2 要求进行。

4）菌悬液保存在4℃冰箱内备用。

当天使用不得过夜。

5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等法进行鉴定。

菌落形态可直接用显微镜观察。

菌体形态可在涂片后直接用高倍显微镜观察，也可用墨水阴地法染色（将菌与黑墨水在玻片上混匀，推成薄膜）后观察。

（2）黑曲霉ATCC 16404 悬液或菌片的制备。

1) 在无菌操作下打开冻干菌种管，以毛细管吸取少量麦芽浸膏营养肉汤培养基加到菌种管中，轻轻吹吸，使菌种沉淀物融化分散。

取少许沉淀物悬液加到含 5.0ml 麦芽浸膏营养肉汤培养基试管中，置30℃±1℃培养42h～48h。

用接种环划线接种第 1 代培养物于MEA 培养基平板，置30℃±1℃培养箱中培养42h～48h。

取平板培养物中的典型菌落，接种于麦芽浸膏营养肉汤培养基，置30℃±1℃培养箱中培养42h～48h，即为第3代培养物。

2) 用10.0ml 吸管吸取5.0 ml～10.0ml 第 3 代培养物，接种罗氏瓶，并摇动使菌液布满MEA 培养基表面，然后将多余肉汤培养物液体吸出，置30℃±1℃培养42h～48h。

菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程

菌种保存、传代、使用、销毁管理规程,操作规程传代用菌种采用甘油冷冻管保存法。

将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合甘油并分装至冷冻管中，冷冻管标注菌种名称、代数、保存日期等信息，然后放置于-80℃冰箱中保存。

每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。

5.3.2.2液体石蜡保存法对于一些难以保存的菌种，采用液体石蜡保存法。

将菌种接种在适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，将菌液混合液体石蜡并分装至玻璃瓶中，瓶口用铝箔密封，标注菌种名称、代数、保存日期等信息，保存温度为-70℃。

每年进行一次复苏和传代，保存时间不超过5年。

5.4菌种的传代传代用菌种每年进行一次复苏和传代。

复苏后，将菌种接种至适宜的琼脂培养基上，待菌生长充分后，按照规定的传代代数制备传代用菌种，并及时更新菌种库存记录。

5.5菌种的使用使用菌种前，应先确认菌种的品质和纯度，并按照规定的传代代数制备工作用菌种。

使用后，应及时更新菌种库存记录，并进行相应的消毒处理。

5.6菌种的销毁菌种在使用过程中，如出现变异或污染等情况，应及时进行应灭活处理，并填写《菌种销毁记录表》，经主管部门审核同意后，进行销毁处理。

菌种库存中长期未使用的菌种，应定期进行清理和销毁处理。

菌复苏、复壮；Sabouraud葡萄糖琼脂培养基：用于白色念珠菌复苏、复壮；青霉素-链霉素琼脂培养基：用于铜绿假单胞菌复苏、复壮。

5.4.1.1.3复苏步骤：1.取出保存好的菌种管，用接种针在酒精灯上消毒；2.将接种针在75%酒精中消毒，再用酒精棉球擦拭消毒；3.用接种针在相应的培养基上进行接种；4.置于适宜温度下孵育，待菌落出现后进行传代或进行实验。

5.4.1.2标准菌株的确认通过形态学、生理生化特性、分子生物学等方法进行鉴定，确认菌株的纯度和种属。

5.4.1.3标准菌株的传代将菌株从原始保存方式中转移到新的保存方式中，确保菌株的保存和传承。

传代次数不宜过多，一般不超过10代。

加工技术-实验室菌种的保藏方法

加工技术-实验室菌种的保藏方法一、甘油悬液保藏法此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。

保藏温度若采用-20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可达10年。

将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在10％～15％，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。

基因工程菌常采用本法保藏。

二、冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。

它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。

并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。

常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。

由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。

除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。

但该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。

保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。

三、液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。

它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。

其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。

美国ATCC菌种保藏中心采用该法时，把菌悬液或带菌丝的琼脂块经控制致冷速度，以每分钟下降1℃/min的速度从0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。

常用菌悬液的制备、保存及使用方法

常用菌悬液的制备、保存及使用方法摘要: 常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征（1）枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆...常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征（1）枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆形，染色均匀，芽孢椭圆形或圆柱形，位于菌体中央，革兰氏染色阳性，能运动。

培养特性：营养琼脂平板：菌落表面粗糙，圆形，灰黄色，边缘锯齿状，分离时应挑选粗糙形菌落。

普通肉汤培养基：呈少量浑浊并产生沉淀，在液体表面形成皱状厚膜粘附于试管壁上。

最适宜培养温度30~37℃，生长温度范围：15~35℃，兼性厌氧或需氧。

抵抗力：菌体湿热55℃ 1小时被杀死，芽孢100℃ 3小时或120℃ 40分钟被杀死。

（2）铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10 104]形态与染色：革兰氏阴性杆菌。

菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。

培养特性：本菌为专性需氧菌，生长温度范围25~42℃，最适生长温度为25~30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。

在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，如绿脓素（pyocynin）与带荧光的水溶性荧光素（pyoverdin）等。

在血平板上会有透明溶血环。

（3）白色念珠菌[CMCC(F) 98 001]形态与染色：本菌细胞呈圆形或卵圆形，很象酵母菌，直径3～6μm，比葡萄球菌大5～6倍，革兰阳性，但着色不均匀。

培养特性：本菌在血琼脂或沙保氏琼脂上，37℃或室温孵育2～3日后，生成灰白乳酪样菌落，涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。

（4）金黄葡萄球菌[CMCC(B) 26 003]形态与染色：圆球形排列成典型的葡萄串状，营养琼脂平板培养多呈短链状或双球状，无鞭毛，不能动，不产生芽孢，革兰氏染色阳性。

菌种传代、使用、保存操作规程

菌种传代、使用、保存操作规程1.目的本文件规定了微生物检验用菌、无菌检验用菌及抗生素检验用菌的接种、保存，传代方法及要求，适用于中心化验室进行检验用菌的接种和传代操作。

2. 适用范围适用于中心化验室菌种管理人员进行检验用菌的接种、保存和传代操作。

3.职责菌种管理人员应按本程序的规定操作。

4.参考文件及相关程序B08(02)005 微生物实验室标准管理程序B08(02)019 微生物检验用菌标准管理程序B08(02)020 检验用培养基标准管理程序5. 程序5.1.对照菌株名称·金黄色葡萄球菌〔CMCC(B) 26 003〕·铜绿假单胞菌〔CMCC(B) 10 104〕·生孢梭菌〔CMCC(B) 64 941〕·枯草芽孢杆菌〔CMCC(B) 63 501〕·大肠埃希菌〔CMCC(B) 44 102〕·白色念珠菌〔CMCC(F) 98 001〕·黑曲霉〔CMCC(F) 98 003〕·短小芽孢杆菌〔CMCC(B) 63 202〕·藤黄微球菌〔CMCC(B) 28 001〕·乙型副伤寒沙门菌〔CMCC(B) 50 094〕5.2.菌种来源中国药品生物制品检定所提供的冷冻干燥菌种（即安瓿）。

5.3. 微生物检验用菌菌悬液的制备5.3.1.菌种的复苏与传代5.3.1.1. 取备妥的冷冻菌种安瓿，灭菌的毛细滴管、双碟、镊子、注射器、灭菌水及复苏菌种所需的培养基等物品，移入超净工作台。

5.3.1.2. 用75%酒精棉球擦净冷冻菌种安瓿外壁，放在灭菌双碟内，待干。

5.3.1.3. 点燃酒精灯，将安瓿的封口一端在火焰上烧灼，用灭菌毛细管吸取灭菌水或胰酪大豆胨液体培养基少许在灼热处，使其骤冷,用干燥无菌纱布包裹安瓿，安瓿掰开。

5.3.1.4. 在不离开火焰圈内，迅速用注射器抽取约0.5ml胰酪大豆胨琼液体培养基，注入安瓿内，轻轻震摇使冷冻菌块溶解、混匀，随即用注射器吸取安瓿内容物分别接种至1支胰酪大豆胨液体培养基，1支普通胰酪大豆胨胰酪大豆胨琼脂斜面培养基内。

菌液制备标准操作规程

一、目的：建立方法适用性检查用菌、阳性对照菌及验证用菌的制备及使用标准操作规程，为操作人员提供正确的操作规程。

二、范围：使用于供试品无菌检查及方法适用性试验，微生物限度检查及方法适用性试验，培养基适用性检查等所用菌液的制备。

三、职责：微生物实验室人员。

四、内容：1、简述:1.1、试验环境：应在环境洁净度C级下的局部洁净度A级的单向流空气区域内或生物安全柜中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。

1.2、操作室的清洁与消毒应依照《洁净室(区)清洁、消毒标准操作规程》进行。

2、设备及仪器:2.1、阳性对照室2.2、生化培养箱2.3、压力蒸汽灭菌器2.4、微波炉2.5、玻璃器皿:锥形瓶、培养皿（90mm）、试管及塞、刻度吸管（0.1ml、1ml、5ml、10ml）锥形瓶等用前应洗涤干净。

刻度吸管口上端距0.5㎝处塞约2㎝的适宜疏松棉花，灭菌备用。

2.6、用具:接种环（铂金或镍铬合金，环径4～5㎜、长度6～10㎝）3、试液：3.1、消毒液: 0.1%苯扎溴铵溶液、0.1%醋酸氯已定溶液、CLBⅡ型消毒溶液（规格：0.65g/片）、75%乙醇溶液、杀孢子剂。

消毒液配制按《洁净室(区)清洁、消毒标准操作规程》进行。

3.2、试验用液: 0.9％无菌氯化钠溶液、PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液、含0.05%（ml∕ml）聚山梨脂80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.05%（ml/ml）的聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液。

试验用液配制按《培养基及试验用液配制标准操作规程》进行。

4、培养基: 胰酪大豆胨液体培养基、沙氏葡萄糖液体培养基、硫乙醇酸盐流体培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基、胰酪大豆胨琼脂培养基。

培养基配制按《培养基及试验用液配制标准操作规程》进行。

5、菌种：所用的菌种传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代,一般使用2～5代的菌种），具体如下：金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26 003〕大肠埃希菌〔CMCC（B）44 102〕铜绿假单胞菌〔CMCC（B）10 104〕乙型副伤寒沙门菌〔CMCC（B）50 094〕生孢梭菌〔CMCC（B）64 941〕枯草芽孢杆菌〔CMCC（B）63 501〕白色念珠菌〔CMCC（F）98 001〕黑曲霉〔CMCC（F）98 003〕6、菌液制备:接种金黄色葡萄球菌、铜绿假胞单菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌的新鲜斜面培养物至胰酪大豆胨液体培养基中；接种生孢梭菌新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜斜面培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养24～72小时，观察上述培养物如生长良好，无菌分装约3ml/管（生孢梭菌上层加约1ml液状石蜡隔绝空气，造成厌氧环境），并取1管（其余至4～6℃冰箱冷藏保存，铜绿假胞单菌室温保存，在有效期内使用）用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%的无菌氯化钠溶液，采用10倍级系列稀释法制成每1ml含菌数小于100 cfu（菌落形成单位）的菌悬液。

43菌种培养及菌种悬浮液制备操作规程

目的：建立菌种斜面培养及菌种悬浮液制备操作规程。

适用范围：适用于菌种斜面培养及菌种悬浮液的制备。

职责：生产用菌培养人员负责实施本规程。

内容：一、试管斜面的制备。

1、将15mm×180mm 玻璃试管洗净，配上棉塞，同250mL三角瓶、接种针、纱布，5mL、10mL吸管放入高压灭菌锅，经0.14-0.16mPa压力灭菌1小时，待冷却后，放干燥箱烘干待用。

2、以工艺要求，称取培养基，一人称取，一人监称。

3、碳酸钠应单独称量置入250mL三角瓶中，配成10%的溶液。

玉米浆用煮沸的蒸馏水溶解后，同其它培养基加水，配成欲定体积的溶液，用40%的氢氧化钠溶液调好PH值为6.5-7.0。

4、分装，用100mL量筒将配好的溶液装入250mL三角瓶内，每瓶装量50mL。

5、给每个三角瓶塞上棉塞，包上牛皮纸，用纸绳扎紧放入铁丝框中，在121℃，0.10-0.12mPa高压锅中灭菌30分钟。

6、冷却后，放入36-37℃恒温培养箱内培养2天，检查是否有杂菌生长，若无方可倒斜面使用。

7、将上述三角瓶里的培养基在沸水浴中熔化成液体，立即按程序带入无菌室倒斜面。

8、倒斜面：在无菌室内灭菌条件下进行，在净化工作台上，去掉包装和线绳，二人配合，用10mL吸管，给每个盛培养基的三角瓶里加总体积10%的碳酸钠溶液，塞上棉塞，摇匀。

9、用5mL吸管将三角瓶里培养基溶液分别装入15mm×180mm的试管里，装量为试管的1/4，并且试管配上棉塞。

10、在桌平面上，放上0.6mm粗的玻璃棒，将试管放在上面，摆成斜面，待冷却后使用。

11、在净化工作台面上，用接种针将原种挑少许，接入被接种玻璃试管里，塞上棉塞，放28-30℃恒温培养箱培养2天-3天。

12、眼观试管斜面无杂菌，且菌落丰满，放4-6℃冰箱内保存或接入茄子瓶斜面内。

二、茄子瓶斜面的制备1、茄子瓶空斜面的制备同试管斜面的制备（注茄子瓶斜面先分装，后消毒）。

2、茄子瓶空斜面用新传代的试管菌种斜面当原种，在灭菌室净化工作台上接种于四瓶茄子瓶空斜面，塞上棉塞，放28-30℃恒温培养箱内培养2天。

常用菌悬液的制备保存及使用方法

常用菌悬液的制备、保存及使用方法
摘要: 常用菌悬液的制备、保存及使用方法
一、常用试验用菌种的生物学特征（1）枯草芽孢杆菌[CMCC(B) 63 501]形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆...
常用菌悬液的制备、保存及使用方法
(B) 63 501]
白色念珠菌
灭菌水或%灭菌生理盐水
4~8℃冰箱保存
半个月
三、菌悬液浓度的简单确定法：麦氏比浊法
麦氏比浊管是McFarland发明的一种用于微生物比浊的不同浊度的标准浊度管。具体的配制方法是根据硫酸和氯化钡的比例来定的，有表可查，这样不同比例生成的硫酸钡沉淀的浓度不同，且都有定值。
麦氏比浊管的配比如下：
使用技巧：
（1）直接用眼睛看（需要经验，误差较大）。
（2）找张白纸，打上平行直线，然后看（如图示，利用光在不同浓度液体折射不同）。
注意事项：
（1）测定好的细菌，最好做一下梯度稀释涂布计数。
（2）此浓度是对应的大肠杆菌的浓度，如果是其他细菌，会有一定的差别。
（3）此种方法测定的准确性不是很高，如果是对细菌数量要求较精确的，请用紫外分光光度计。
抵抗力：菌体湿热55℃ 1小时被杀死，芽孢100℃ 3小时或120℃ 40分钟被杀死。
（2）铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10 104]
形态与染色：革兰氏阴性杆菌。菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。
培养特性：本菌为专性需氧菌，生长温度范围25~42℃，最适生长温度为25~30℃，特别是该菌在4℃不生长而在42℃可以生长的特点可用以鉴别。在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，如绿脓素（pyocynin）与带荧光的水溶性荧光素（pyoverdin）等。在血平板上会有透明溶血环。

菌液的制备及保存

1目的菌种保藏使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。

规范菌种原始菌液的制备及长期保存。

2内容2.1定义原始菌液--由冻干菌或冷冻菌直接传代的孢子或生长菌的原始悬浮液。

工作菌液--由原始菌液直接稀释，或根据一般试验需要而等量稀释的特定浓度的孢子或细菌的悬浮液。

22总则微生物室收到实验菌种后应进行活化及纯化，并进行传代（芽孢杆菌除外）。

每一新菌种在适宜的琼脂平板上划线分离，检查是否纯种，观察菌落形态并用革兰氏染色或芽孢染色法进行镜检，如果是芽孢悬浮液，用常规方法测定其存活孢子数。

经检查如果满意，贴上合适的标签，并将贮备菌存放在实验室专用的冰箱里（2〜8C）或冷冻室内，以避免与实验室正在使用的其它菌种相混淆，作好菌种传代的记录以便能追踪传代史。

生孢梭菌的孢子悬浮菌应每年制备一次。

原始菌种的传代次数最多传至第五代。

O Q 代产览2.3 培养基2.4冻干菌制备原始菌液2.4.1由甘油冷冻菌制备原始菌液241.1 把冻干菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第一代。

2.4.1.2 从冷冻箱内取出冷冻菌，使其在室温下慢慢融化；2.4.1.3 把冷冻菌无菌转移至100ml该菌所适用的液体培养基中；2.4.1.4 根据菌种的类型，将接种后的培养基在适当温度下培养24h或更长一些时间；2.4.1.5 把甘油冷冻菌加入100ml液体培养基后所得的菌作为第二代。

2.4.2由集菌平板制备原始菌液2.4.2.1 在超净工作台内，把经过24h （或更长时间）培养的菌液摇匀，各取1ml,无菌转移至5只培养基平板上，轻轻转动平板，使菌液均匀分布于平板表面。

不同培养基适24231 生长菌-24h以内即可显见增长;用于不同菌种。

2.4.2.2 另用一只平板，划线分离菌液，培养之，以检查菌液是否纯种。

242.3 在适当的温度下培养以上平板，不同菌种所需培养周期不一。

24232 孢子-需要3〜7天或更长时间才能得到50%孢子，这样可确保提到浓的悬浮液。

一定浓度菌悬液的制备

微生物数量的测定细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。

测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法(direct microscopic count)、平板菌落计数法(plate count)、光电比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然数法(most probable number MPN)以及膜过滤法(membrane filtration)等。

测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。

总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。

本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。

一显微镜直接计数法（一）目的要求1．明确血细胞计数板计数的原理。

2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

（二）基本原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。

后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。

除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。

显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。

但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。

目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。

本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。

常用菌悬液的制备、保存及使用方法

常用菌悬液的制备、保存及使用方法摘要：常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征(1)枯草芽抱杆菌［CMCC(B) 63 501］形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆...常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征(1 )枯草芽抱杆菌［CMCC(B) 63 501］形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆形，染色均匀，芽抱椭圆形或圆柱形，位于菌体中央，革兰氏染色阳性，能运动。

培养特性：营养琼脂平板：菌落表面粗糙，圆形，灰黄色，边缘锯齿状，分离时应挑选粗糙形菌落。

普通肉汤培养基：呈少量浑浊并产生沉淀，在液体表面形成皱状厚膜粘附于试管壁上。

最适宜培养温度30~37 C,生长温度范围：15〜35 C,兼性厌氧或需氧。

抵抗力：菌体湿热55 C 1小时被杀死，芽抱100 C 3小时或120 C 40分钟被杀死。

(2 )铜绿假单胞菌［CMCC(B) 10 104］形态与染色：革兰氏阴性杆菌。

菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。

培养特性：本菌为专性需氧菌，生长温度范围25~42 C,最适生长温度为25~30 C,特别是该菌在4C不生长而在42 C可以生长的特点可用以鉴别。

在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，如绿脓素( pyocynin )与带荧光的水溶性荧光素( pyoverdin )等。

在血平板上会有透明溶血环。

(3) 白色念珠菌［CMCC(F) 98 001］形态与染色：本菌细胞呈圆形或卵圆形，很象酵母菌，直径 3 ~ 6(_im ,比葡萄球菌大5 ~ 6倍，革兰阳性，但着色不均匀。

培养特性：本菌在血琼脂或沙保氏琼脂上，37 C或室温孵育2〜3日后，生成灰白乳酪样菌落，涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。

(4) 金黄葡萄球菌［CMCC(B) 26 003］形态与染色：圆球形排列成典型的葡萄串状，营养琼脂平板培养多呈短链状或双球状，无鞭毛，不能动，不产生芽抱，革兰氏染色阳性。

2020版《中国药典》微生物限度计数—酵母菌及霉菌

2020版药典微生物限度计数—酵母菌及霉菌2020版本药典(1)菌液制备取白色念珠菌的新鲜培养物，用0.9%无菌氣化钠溶液制成103cfu/ml的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加5ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氣化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，使用移液枪吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氣化钠溶液制成103cfu/ml的黑曲霉孢子悬液。

菌液制备后保存在2℃冰箱，在24小时内使用。

(2) 计数培养基适用性检査接种不大于l00cfu的白色念珠菌和黑曲霉的菌液至胰酪大豆胨琼脂培养基平板，35℃条件下培养4天；接种不大于l00cfu的白色念珠菌和黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，25℃条件下培养4天。

每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。

同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

(3) 计数方法适用性试验1) 供试液制备取供试品10g，用胰酪大豆胨液体培养基制备成1:10供试液。

2) 接种和稀释按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。

所加菌液的体积不超过供试液体积的1%。

1、试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每lml供试液中含菌量不大于l00cfu。

2、供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。

3、菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。

3) 供试品中微生物的回收取20ml温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注人直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用无菌操作台风干的方法使培养基表面干燥。

每一平板表面接种上述照“供试液的制备”和“接种和稀释”制备的供试液0.1ml。

胰酪大豆胨琼脂培养基平板在35℃条件下培养3天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在25℃条件下培养4天。

同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。

几种菌种的保存及复苏方法

几种菌种的保存及复苏方法（含扩增方法）定期移植法，亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。

是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于4～6℃进行保存并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。

操作步骤如下：1 培养基制备1.1 器皿准备培养基制备过程中所用的一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，经洗涤、干燥、包装、灭菌后使用。

1.2 溶解培养基配料先在烧杯中放适量水，按培养基配方称取各项材料，依次将缓冲化合物、主要元素、微量元素、维生素等材料加入水中溶解，最后加足水量，搅拌均匀。

1.3 调pH值配料溶解后将培养基冷却至室温，根据要求加稀酸（0.1mol/L盐酸）或稀碱(10%氢氧化钠)调pH值。

加酸或碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。

1.4 加凝固剂配制固体培养基时需加凝固剂，如琼脂、明胶等。

将凝固剂加入液体培养基中，加热并不断搅拌至融解，再补足所蒸发水分。

1.5 过滤分装在二层纱布中间夹入脱脂棉，将配好的培养基趁热过滤并分装。

斜面培养基分装量约为试管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培养基分装量以试管高度的二分之一为宜。

分装过程中勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。

1.6 包扎标记将试管加棉塞，外面包扎一层牛皮纸或铝箔并注明培养基名称及配制日期。

1.7 灭菌根据要求将培养基灭菌，通常蒸汽灭菌为121℃，15～20min。

1.8 斜面摆放灭菌后及时摆放斜面，斜面长度不超过试管管长的二分之一为宜。

1.9 无菌检查将灭菌的培养基放入培养箱中作无菌检验，通常30℃培养1～3天。

无菌检查合格后将其保存于4℃下备用。

2 接种2.1 斜面接种2.1.1 点接把菌种点接在斜面中部偏下方处。

适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。

2.1.2 中央划线从斜面中央自下而上划一直线。

适用于细菌和酵母菌等。

实验室菌种的保藏方法

实验室菌种的保藏方法一、甘油悬液保藏法此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。

保藏温度若采用-20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用-70℃，保藏期可达10年。

将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使甘油的终浓度在10％～15％，再分装于小离心管中，置低温冰箱中保藏。

基因工程菌常采用本法保藏。

二、冷冻真空干燥保藏法冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。

它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。

并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。

常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。

由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。

除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。

但该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。

保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。

三、液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。

它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。

其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。

美国ATCC菌种保藏中心采用该法时，把菌悬液或带菌丝的琼脂块经控制致冷速度，以每分钟下降1℃/min的速度从0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。

一定浓度菌悬液的制备

微生物数量的测定细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。

测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法(direct microscopic count)、平板菌落计数法(plate count)、光电比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然数法(most probable number MPN)以及膜过滤法(membrane filtration)等。

测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。

总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。

本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。

一显微镜直接计数法（一）目的要求1．明确血细胞计数板计数的原理。

2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

（二）基本原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。

后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。

除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。

显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。

但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。

目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。

本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。

2020版《中国药典》微生物限度计数—酵母菌及霉菌

2020版药典微生物限度计数—酵母菌及霉菌2020版本药典(1)菌液制备取白色念珠菌的新鲜培养物，用0.9%无菌氣化钠溶液制成103cfu/ml的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加5ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氣化钠溶液，将孢子洗脱。

然后，使用移液枪吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氣化钠溶液制成103cfu/ml的黑曲霉孢子悬液。

菌液制备后保存在2℃冰箱，在24小时内使用。

(2) 计数培养基适用性检査接种不大于l00cfu的白色念珠菌和黑曲霉的菌液至胰酪大豆胨琼脂培养基平板，35℃条件下培养4天；接种不大于l00cfu的白色念珠菌和黑曲霉的菌液至沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，25℃条件下培养4天。

每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。

同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。

(3) 计数方法适用性试验1) 供试液制备取供试品10g，用胰酪大豆胨液体培养基制备成1:10供试液。

2) 接种和稀释按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。

所加菌液的体积不超过供试液体积的1%。

1、试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每lml供试液中含菌量不大于l00cfu。

2、供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。

3、菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加入试验菌液并进行微生物回收试验。

3) 供试品中微生物的回收取20ml温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注人直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用无菌操作台风干的方法使培养基表面干燥。

每一平板表面接种上述照“供试液的制备”和“接种和稀释”制备的供试液0.1ml。

胰酪大豆胨琼脂培养基平板在35℃条件下培养3天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在25℃条件下培养4天。

同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。

常用菌悬液的制备保存及使用方法

常用菌悬液的制备、保存及使用方法摘要：常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征(1)枯草芽抱杆菌［CMCC(B) 63 501］形态与染色：菌体细短棒状, 单个或成链状，两端半圆…常用菌悬液的制备、保存及使用方法一、常用试验用菌种的生物学特征(1)枯草芽抱杆菌［CMCC(B) 63 501］形态与染色：菌体细短棒状，单个或成链状，两端半圆形，染色均匀，芽抱椭圆形或圆柱形，位于菌体中央，革兰氏染色阳性，能运动。

培养特性：营养琼脂平板：菌落表面粗糙，圆形，灰黄色，边缘锯齿状，分离时应挑选粗糙形菌落。

普通肉汤培养基：呈少量浑浊并产生沉淀，在液体表面形成皱状厚膜粘附于试管壁上。

最适宜培养温度30〜37 C，生长温度范围：15〜35 C,兼性厌氧或需氧。

抵抗力：菌体湿热55 C 1小时被杀死，芽抱100 C 3小时或120 °C 40分钟被杀死。

(2)铜绿假单胞菌［CMCC(B) 10 104］形态与染色：革兰氏阴性杆菌。

菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。

培养特性：本菌为专性需氧菌，生长温度范围25〜42 C,最适生长温度为25~30 C,特别是该菌在4C不生长而在42C可以生长的特点可用以鉴别。

在普通培养基上可以生存并能产生水溶性的色素，如绿脓素(pyocynin )与带荧光的水溶性荧光素( pyoverdin )等。

在血平板上会有透明溶血环。

(3)白色念珠菌［CMCC(F) 98 001］形态与染色：本菌细胞呈圆形或卵圆形，很象酵母菌，直径3〜6卩m,比葡萄球菌大5〜6倍，革兰阳性，但着色不均匀。

培养特性：本菌在血琼脂或沙保氏琼脂上，37 C或室温孵育2〜3日后，生成灰白乳酪样菌落，涂片镜检，可看到表层为卵圆形芽生细胞，底层有较多假菌丝。

(4)金黄葡萄球菌［CMCC(B) 26 003］形态与染色：圆球形排列成典型的葡萄串状，营养琼脂平板培养多呈短链状或双球状，无鞭毛，不能动，不产生芽抱，革兰氏染色阳性。

一定浓度菌悬液的制备

微生物数量的测定细菌群体生长表现为细胞数目的增加或细胞物质的增加。

测定细胞数目的方法有显微镜直接计数法(direct microscopic count)、平板菌落计数法(plate count)、光电比油法(turbidity estimation by spectrophotometer)、最大或然数法(most probable number MPN)以及膜过滤法(membrane filtration)等。

测定细胞物质的方法有细胞干重的测定，细胞某种成分如氮的含量、RNA和DNA的含量测定，代谢产物的测定等。

总之，测定微生物生长量的方法很多，各有优缺点，工作中应根据具体情况要求加以选择。

本实验主要介绍生产、科研工作中比较常用的显微镜直接计数法、平板菌落计数法和光电比浊计数法。

一显微镜直接计数法（一）目的要求1．明确血细胞计数板计数的原理。

2．掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。

（二）基本原理显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。

目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。

后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm3，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。

除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。

显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。

但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。

目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。

本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。

菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程

菌种管理制度1、目的建立菌种保存、传代、使用、销毁标准操作规程，规范微生物学检定用菌种的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检验结果的准确可靠。

2、适用范围本规程适用于检定用菌种的管理，包括菌种的购买、保存、传代、使用及销毁等。

3、定义➢标准菌株是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供的冷冻干燥菌。

➢传代用菌种是指用标准菌株制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。

➢工作用菌种是指用标准菌株或传代用菌种接种至普通琼脂斜面培养后，作为日常工作使用的菌种。

➢菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。

4、职责4。

1部门主管负责菌种的申购、接收、保存分发。

4。

2微生物检验员负责菌种的确认、传代、使用及销毁。

5、规程5.1菌种的申购部门主管根据菌种的使用情况，提出年度购买计划（包括临时检验需要）,填写申购流程，经审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌株）或传代用菌种，购买时,需确定菌种的代数，以便控制传代代数.5。

2菌种的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息,填写在《标准菌株库存记录》上，内容包括：名称、数量、编号(无编号者按检定菌种的编号原则编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，并将其暂贮存于4~8℃冰箱中，在一周内必须完成转种。

5。

3菌种的保存5。

3。

1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。

将菌种接种在适宜的琼脂斜面培养基上，待菌生长充分以后，转移至4~8℃冰箱中保存。

此法仅用于工作用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况，发现异常情况,经应灭活处理后销毁。

保存时间根据菌种种类而不同，细菌:每个月转种一次；酵母菌及芽胞：3～6个月转种一次；丝状真菌每年转种一次.5.3.2传代用菌种的保存采用甘油冷冻管保藏法或液体石蜡保存法。