一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒红色TRITC标记荧光检

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翻译好的罗氏公司Tunel试剂盒操作说明书

罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书(In situ cell death detection kit-POD法)一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。

其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA 的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。

还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含：1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 溶于0.1% 柠檬酸钠，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7.5， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。

Tunel染色步骤

Tunel染色步骤染色是生物学实验中常用的一种技术手段，它可以标记和可视化细胞或组织中的特定分子或结构。

TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）染色技术是一种常用于检测细胞凋亡的方法。

以下是TUNEL染色的步骤：准备工作：1.去离子水：除去离子，避免离子干扰反应。

2. 去氧核酸酶（DNase）的酶标：新鲜制备，如购买的DNase酶标已开封或保存时间较长，需要用氧化热焓（将无水乙酸用过氧化氢气化后灭菌）处理一晚才可以使用。

步骤一：样本固定1.取细胞或组织样本，放入离子缺失的缓冲液中，使其完全被液体覆盖。

2. 加入4%的 paraformaldehyde（或其他细胞或组织固定液），室温下固定10-15分钟。

3.将样本漂洗3次，每次10分钟，使用冷PBS漂洗。

4.用细胞色素染色法染色检测固定细胞总蛋白质。

步骤二：处理样本1. 将细胞或组织样本渗透处理：将固定的细胞或组织置于PBS中含有0.5% Triton X-100（或0.1-0.2%的Bis-vinylsulfonyl] ethane等亲水试剂）的溶液中，室温下渗透30分钟。

2.将样本漂洗3次，每次10分钟，使用冷PBS漂洗。

3. 用DNase酶标法探测样本中DNA裂解。

步骤三：TUNEL反应1.取TUNEL反应液，根据实验需要，在冷冻时保持在冰上。

2.用比色皿将样本恢复到PBS中，将足量的TUNEL反应液加入标本中，使标本完全浸润，尽量避免气泡。

3.在37℃下孵育1-2小时。

步骤四：反应终止1.将标本移至冷藏，室温下用PBS漂洗3次，每次10分钟。

2.用缓冲液漂洗标本3次，每次10分钟。

步骤五：可视化与分析1.在镜下放置标本。

2.加入螢光抑制剂或DAPI等染料，使用荧光显微镜检测标本。

总结：TUNEL染色技术是一项用于检测细胞凋亡的重要方法。

它通过检测DNA的断裂末端来间接检测细胞凋亡。

整个TUNEL染色过程包括样本固定、样本处理、TUNEL反应、反应终止和可视化与分析等步骤。

一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书

一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书货号：T2190规格：20次保存：-20ºC保存，荧光标记液需避光保存。

产品简介：细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。

细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。

基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上绿色荧光探针荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。

一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。

对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到呈现绿色荧光的凋亡细胞。

TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。

这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。

极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。

在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。

在需要严格判断细胞凋亡的情况下，最好同时检测多个凋亡指标。

产品内容：1.TdT酶100μl2.荧光标记液900μl3.TdT酶稀释液(选用)500μl操作步骤：1.对于贴壁细胞或细胞涂片：a.PBS或HBSS洗涤一次。

b.如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。

c.用免疫染色固定液或4%多聚甲醛固定细胞30分钟。

tunel法检测细胞凋亡实验步骤

tunel法检测细胞凋亡实验步骤细胞凋亡是一种重要的生物学过程，它在多种生理和病理情况下发挥着关键作用。

为了研究细胞凋亡的机制和调控，科学家们发展了多种方法来检测细胞凋亡。

其中一种常用的方法是使用tunel法。

本文将介绍tunel法检测细胞凋亡的实验步骤。

实验步骤如下：1. 细胞培养和处理我们需要选择一种适合的细胞系进行实验。

常用的细胞系有HEK293、HeLa和Jurkat等。

将细胞培养在含有适当培养基和补充物的培养皿中，并在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养至细胞密度适当。

在进行实验之前，需要根据实验设计的需要处理细胞。

例如，可以给予细胞不同的处理，如药物刺激、放射线照射或感染病毒等。

2. 固定细胞将处理后的细胞用适当的缓冲液进行固定。

常用的缓冲液有4%的乙醛或4%的甲醛等。

将缓冲液加入培养皿中，使细胞完全覆盖，并在室温下固定15分钟。

3. 洗涤细胞将固定的细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，每次5分钟。

洗涤的目的是去除固定液中的残留物质，以减少后续步骤中的非特异性背景。

4. 使细胞透膜使用蛋白酶K或蛋白酶XXIV等酶将细胞膜上的蛋白质降解，使细胞透膜。

将适量的酶加入细胞中，根据实验的需要，可以调整酶的浓度和作用时间。

一般来说，酶的浓度为20μg/ml，作用时间为30分钟。

5. tunel反应使用tunel试剂盒进行细胞凋亡检测。

tunel试剂盒中含有标记有荧光物质的dUTP，可以与DNA断裂的末端结合。

按照试剂盒说明书的要求，将tunel试剂加入细胞中，与细胞中的DNA断裂末端发生连接反应。

反应时间一般为1-2小时。

6. 洗涤和染色将反应结束后的细胞用PBS洗涤3次，每次5分钟。

然后，可以选择使用荧光染料（如DAPI）染色，以标记细胞核。

将染色液加入细胞中，孵育15分钟后再次用PBS洗涤。

7. 显微镜观察和图像获取将处理后的细胞放置在显微镜载玻片上，并使用合适的显微镜观察细胞。

可以调整显微镜的放大倍数和焦距，以获得清晰的图像。

TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤

TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤--------------------------------------------------------------------------------凋亡细胞的原位末断转移酶标记法（TUNEL法）细胞凋亡的多步骤机制作用的最终环节是；细胞内源性核酸内切酶的激活而导致核染色质DNA双链的断裂。

大量DNA片段暴露出的3 羟基在末断转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT)或DNA多聚酶的作用下，与生物素或地高辛标记的核苷酸结合，最终借助与卵白素或抗地高辛抗体结合的荧光素或HRP，使凋亡细胞被特异性地标记和显示出来。

TUNEL细胞凋亡试剂盒由美国罗氏公司提供试剂1：酶浓缩溶液（Enzyme Solution）试剂2：标记溶液（Lable Solution）试剂3：转化剂-POD（Converter-POD）酶标记抗荧光素抗体（即用型）试验所需其它试剂：非石蜡切片:·冲洗缓冲液:磷酸盐缓冲液（PBS）·阻断溶液:0.3%H2O2甲醇溶液·固定溶液:4%多聚甲醛（溶剂pH7.4新鲜配制的PBS溶液）·渗透液:0.1%Triton甔-100（溶于新鲜配制的0.1%枸橼酸钠溶液）Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)名：曲拉通X-100，乳化剂OP分子式：C34H62O11石蜡切片:·二甲苯和乙醇（100%、95%、90%、80%、70%用蒸馏水稀释）·冲洗缓冲液:磷酸盐缓冲液（PBS）·蛋白酶K 工作液10~20mg/ml溶于10mM Tris/HCl（pH7.4~7.8）根据需要选择:·渗透液:0.1%TritonX-100（溶于新鲜配制的0.1%枸橼酸钠溶液）·胃酶溶液（0.25%-0.5%溶于HCl ，pH2）或胰酶·0.1M枸橼酸缓冲液，pH6，微波修复材料：微波炉，微波输出功率850W-2000W2 .选用中性甲醇固定的活检及实验动物标本，常规脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。

TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法

检测晚期凋亡.基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让和标记地进入细胞内，在地辅助下与核断裂地’结合，再用标记地链霉亲和素与上结合（每个链霉亲和素至少可以再结合个分子），最后用、过氧化氢与上地辣根过氧化物酶发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中阳性细胞地比例来判断细胞凋亡发生情况.罗氏试剂盒一、试剂、酶浓缩溶液×μ——末端脱氧核糖核酸转移酶（×）试剂、标记溶液×μ——含有核苷酸混合液地反应液（×）试剂、转化剂——酶标记抗荧光素抗体（即用型，融后℃保存）二、所需地溶液和仪器（）、配制、、饭盒、吹风机、甲醇溶液、、盖玻片、中性树胶、苏木素、二甲苯和无水乙醇（用量多）、双蒸水（用以配梯度酒精）, 充分脱蜡和水化.脱蜡可以先度，石蜡切片于染色缸中，二甲苯浸洗次共、、、、乙醇浸洗×；②过氧化氢甲醇中浸洗，抑制内源性过氧化氢酶.③用蛋白酶（μ溶于中，）室温孵育分钟.④洗约*次，擦干样品周围地水.此阶段配制反应混合物——从试剂中取出μ标记溶液作为两个阴性对照；将试剂中取μ试剂中μ标记液中，配成μ 反应混合物混匀（即配即用，℃避光！）⑤标记反应：滴加μ地反应混合液，在湿盒中℃孵育分钟（为防蒸发和保证反应混合物均匀分布，可以在孵育过程中加盖盖玻片）.洗*次，至此样品可在荧光镜下（绿色）分析结果.⑥信号转化和分析：擦干样品周围地水分，加入转化剂，湿盒中℃孵育分钟（可以在孵育过程中加盖盖玻片）.洗*次⑦加入μ 底物溶液，室温（℃）孵育，洗*次.（苏木素染秒，以免视野全染，需要摸索条件）⑧中性树胶或者甘油封片（在封片前可以复染），光镜下分析结果.•稳定性：反应混合物需在使用前立即制备，不能储存，配好地此液体必须将放入冰浴中.个人收集整理勿做商业用途、转化剂（即用型）：一旦融化此液体，需在℃保存（最多保存个月），并且不能反复冻存. 蛋白酶一般工作液浓度为,但浓缩液可配制，可用配制，也可用蛋白酶缓冲液（）；注意：)蛋白酶可以帮助渗透组织，但延长孵育时间可能导致切片脱落（）,所以要最优化孵育时间长短.时间一般为，左右地片子可以用，但左右地可用，最终通过摸索最佳时间.过长易脱片、过短起不到通透效果.)对于比较困难地组织，可以选用地枸橼酸盐缓冲液进行修复（石蜡切片无必要用），需修复)对照：阴性对照：经过固定和通透地细胞样品加入μ试剂以代替反应混合物，从标记步骤以下同上.阳性对照：经过固定和通透地细胞样品用细球菌地核酸酶或使之产生链缺口，从标记步骤以下同上.)操作流程：常规脱蜡、脱水处理——冲洗样品——滴加反应混合物，℃孵育分钟——冲洗样品——选择：荧光镜下观察分析——滴加转化剂，℃孵育分钟——洗样品——滴加底物溶液，室温孵育分钟——光镜下分析结果)假阳性多地原因有很多：封闭不全、显色时间过长等原因假阳性严重，可能原因应该是孵育时间过长，建议首先排除之，同时加强浸洗)显色时间:（）显色时间不是固定地，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗；（）显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深地棕褐色，这很可能说明你地抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你地抗体孵育时间；（）此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面地封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间；（）显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你地抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗度过夜）；另一方面就是封闭时间过长.)脱片产生地原因和如何防止脱片:（）多聚赖氨酸玻片质量地问题.我原先是买地，迈新按说也是不错地，可是都脱成什么样子了.后面补做第二批时用地病理科老师自己做地片子，要好一点.（）组织切地不好，切片机地问题例如比较老地旧地机器切地厚或者不均匀，或者切片者手法不好等.（）组织地问题，越是有坏死之类越容易脱.（）没烤好，时间短温度不够之类.（）操作地时候甩地太猛了，有脱片嫌疑地片子最好不甩或轻轻甩，用卫生纸从边缘上慢慢吸水.（）此外，一旦见到有组织漂起来操作就更加要谨慎，用地时候尽量用泡地，不要冲.个人收集整理勿做商业用途。

罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书

罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书一、原理：TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。

其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。

还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。

二、器材与试剂器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；试剂：试剂盒含TdT 10×、荧光素标记的dUTP 1×、标记荧光素抗体的HR P；自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH 7.4-8）或细胞通透液（0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate，临用前配制）、苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH 7. 5，10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。

TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤精

TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤精TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling）细胞凋亡试剂盒是一种常用的检测细胞凋亡的方法。

本文将介绍TUNEL细胞凋亡试剂盒的内容及操作步骤。

1.引物溶液：含有dUTP（脱氧尿苷三磷酸）的荧光标记的核苷酸。

2.终止缓冲液：用于停止反应和洗涤。

3. TUNEL酶溶液：含有DNA连接酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），用于在DNA断裂的末端添加dUTP标记。

4.正对照组：包括经过DNA内切酶处理的组织切片或细胞，用于确定试剂盒的反应情况。

步骤一：取材将需要检测的组织切片或细胞标本取出，放入离心管或培养皿中。

步骤二：固定用4%的冷乙醇或4%的帕拉醛对组织切片或细胞标本进行固定，固定时间为10-30分钟。

步骤三：洗涤用PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤固定的样本3次，每次洗涤5分钟。

步骤四：蛋白酶消化对组织切片或细胞标本进行蛋白酶消化，以去除背景蛋白质干扰。

消化时间和消化酶的浓度需要根据实验条件进行优化。

步骤五：洗涤用PBS洗涤样本3次，每次洗涤5分钟。

步骤六：加入TUNEL酶溶液将TUNEL酶溶液滴加到样本上，保持湿润。

反应时间为1-2小时，可以根据实验需要进行优化。

步骤七：终止反应加入终止液停止反应，并用PBS洗涤样本3次，每次洗涤5分钟。

步骤八：显微镜观察将样本用荧光或显色试剂染色，然后用荧光显微镜或普通显微镜观察，并拍摄照片。

步骤九：分析数据使用图像分析软件对显微镜拍摄的照片进行图像分析，在感兴趣区域计算标记的细胞数量，并计算相对细胞凋亡率。

值得注意的是，在进行TUNEL细胞凋亡试剂盒检测时，需要根据实验需要进行优化，如反应时间、荧光染色时间、荧光强度测量等。

此外，为了准确地判断细胞中的凋亡现象，可以与其他细胞凋亡指标一起使用，如Annexin V染色、Caspase活性检测等。

TUNEL细胞凋亡检测(荧光标记)操作流程

一、TUNEL实验试剂(1)DeadEnd™Fluorometric TUNEL System试剂盒购自Promega公司(产品编号G3250)(2)二甲苯购自国药集团化学试剂有限公司（产品编号80139118，CAS号108-38-3，500ml）(3)无水乙醇购自中国上海生工生物有限公司（产品编号ET0737-500ml）(4) 过氧化氢购自上海生工生物有限公司(产品编号H1976-500ml)(5) Proteinase K购自上海生工生物工程技术服务公司(产品编号BSP169-2ml)(6)多聚甲醛购自上海生工生物有限公司（产品编号PB0684-500g）(7) Propidium iodide购自Sigma（产品编号P4170-10MG）(8) SlowFade® Gold antifade reagent购自Life Technologies（产品编号36936）二、具体实验步骤A. 石蜡包埋组织预处理：1.二甲苯5min (500ml二甲苯)2.二甲苯5min（500ml二甲苯）3.无水乙醇5min（500ml无水乙醇）4.无水乙醇5min（500ml无水乙醇）5.80%乙醇5min（500x0.8=400ml无水乙醇）6.70%乙醇5min（500x0.7=350ml无水乙醇）7.PBS 5min（500ml）8.PBS 5min（500ml）9.PBS 5min（500ml）10.4%多聚甲醛in PBS，15min11.PBS 5min（500ml）12.PBS 5min（500ml）13.Proteinase K in PBS (100ul每个样品，共6ml), 8-10min14.PBS 5min（500ml）15.PBS 5min（500ml）16.4%多聚甲醛in PBS，5min17.PBS 5min18.PBS 5min共105分钟，实际约2个小时B. 凋亡检测1.每个样品，100ul平衡缓冲液覆盖细胞，室温5-10分钟2.在平衡细胞的同时，在冰上解冻核苷混合物，并且依照表1，准备足够量的用于所有实验的和可选阳性对照反应（见4.E节）的rTdT孵育缓冲液。

一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒红色TRITC标记荧光检

一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（红色 TRITC 标记荧光检测法，通用型）说明书修订日期：2018.07.31 Catalog No.：KGA7061 / KGA7062 / KGA7063Storage：-20℃ for 12 months,避光For Research Use Only（科研专用）一、TUNEL 检测原理凯基一步法 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒(TRITC红色荧光标记，通用型)提供一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法，可检测细胞在凋亡过程中细胞核 DNA 的断裂情况，其原理是红色荧光素（Tetramethylrhodamine，TRITC）标记的 dUTP 在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂 DNA 的3′－OH 末端，可用荧光显微镜检测。

由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂，因而没有3′-OH 形成，很少能够被标记。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片或爬片）的凋亡原位检测。

对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜检测到凋亡细胞。

二、TUNEL 试剂盒组分运输及保存条件：2-8℃低温运输，收到后-20℃避光保存，保质期一年。

实验前准备：实验前按说明书准备好相应试剂与器具，多聚甲醛、二甲苯、乙醇、1×PBS pH 7.4、H2O2、Triton X-100、甲醇、多聚赖氨酸铺载玻片（细胞样本）、盖玻片、染色缸、温盒、量筒等。

三、操作步骤各个样本请用免疫组化笔做好标记，另外加 2 张样本切片分别用于阳性片和阴性片制备并做好标记。

在每步反应或浸洗的间隙时，配制下一步即用的工作液。

注意事项反应液最好根椐计算好的样本数量集中配制，再分别滴加于各样本上，避免因每个样本单独配制而产生的试剂损耗，TdT 酶反应液如需短暂保存时，请置于冰上。

一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒

一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒产品简介：碧云天生产的一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。

对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞仪检测到呈现绿色荧光的凋亡细胞。

细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。

细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。

基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT)的催化下加上绿色荧光探针荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(T dT-mediated d U TP N ick-E nd L abeling)法检测细胞凋亡的原理。

注：FITC是fluorescein isothiocyanate的缩写，实际上大多数情况下所谓的FITC即为fluorescein。

本试剂盒有如下优点。

(1) 高灵敏度：可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。

(2) 特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。

(3) 快速：仅需约1-2个小时即可完成。

(4) 方便：只需一步染色反应，洗涤后即可观察，不必使用二抗等进行多步操作。

(5) 应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。

TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。

这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。

普利莱 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（绿色 FITC 标记荧光检测法，通用型）说明书

62053186T UNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色FITC标记荧光检测法，通用型）C0001C0002描述：细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的阶段性过程。

染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段，然后大约30%的染色体DNA在Ca2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180-200bp核小体DNA多聚体。

因此在细胞凋亡晚期，DNA会被降解为180-200 bp的片段，断裂的基因组DNA上暴露出大量的3'-OH末端。

末端脱氧核糖核苷酸转移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT）是一种不依赖于模板的DNA聚合酶，可以催化脱氧核苷酸结合到断裂的DNA分子3'-OH末端。

因此TUNEL(TdT mediated dUTP Nick End Labeling)细胞凋亡检测试剂盒可以用来检测组织细胞在凋亡晚期过程中细胞核DNA的断裂情况。

其原理是在TdT酶的作用下，在基因组DNA断裂时暴露出的3´-OH末端掺入荧光素标记的dUTP（FITC-12-dUTP），从而可以用荧光显微镜或流式细胞仪检测（FITC激发450-500nm，发射515-565nm）。

本试剂盒应用范围广，适用于石蜡组织切片，冰冻组织切片、细胞爬片、细胞涂片等的细胞凋亡检测。

储存与运输：冰袋（wet ice）运输；本试剂盒储存在-20℃，FITC-12-dUTP Labeling Mix需避光储存于-20℃，有效期12个月。

组成实验前准备：Component Number Component50T100T R1Recombinant TdT Enzyme50µL2×50µLR2FITC-12-dUTP Labeling Mix250µL2×250µLR3Equilibration Buffer5×1mL10×1mLR4Proteinase K（200µg/mL）1mL2×1mL产品说明书1份1.PBS磷酸盐缓冲液2.固定液：溶于PBS或其他缓冲体系的4%多聚甲醛，pH7.43.破膜液：溶于0.1%柠檬酸钠的0.1%Triton X-1004.配制含0.2%Triton X-100的PBS；配制含0.1%Triton X-100及5mg/mL BSA的PBS5.如需染核，需自备DAPI（2µg/mL）或PI（1µg/mL）6.如需阳性对照实验，需自备DNase I7.如果用流式细胞仪，自备PI染液和RNase A（DNase free）8.操作时请穿实验服，佩戴一次性手套。

TUNEL 法测凋亡操作步骤

TUNEL 法测凋亡操作步骤一、TUNEL检测原理TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是采用非同位素方法来检测细胞在凋亡过程中DNA 的断裂情况，可在原位快速准确地检测单个凋亡细胞。

本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。

其原理是细胞凋亡发生时，内源性核酸酶激活，使DNA的双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3’-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）作用下，组织细胞原位DNA切口可被标记上生物素-dUTP，即TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl TransferaseBiotin-dUTP Nick End Labeling），可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，显示为棕色（过氧化物酶活性），特异准确地定位正在凋亡的细胞，在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3'-OH 形成，很少能够被染色。

二、试剂盒组份组份10 assays25 assays 储存条件A：Equilibration Buffer 1.0 mL 2.5 mL -20 ℃B：Biotinylated Nucleotide Mix 10 μL 25 μL -20 ℃C：TdT Enzyme 10 μL 25 μL -20 ℃D：500×Proteinase K 10 μL 25 μL -20 ℃20×SSC 15 mL 38mL 4 ℃E：Streptavidin-HRP 10 μL 25 μL 4 ℃F：20×DAB Substrate Buffer 50 μL 125 μL 4 ℃G：20×DAB Chromogen 50 μL 125 μL 4 ℃H：20×Hydrogen Peroxide 50 μL 125 μL4 ℃三、操作流程1.操作流程概览2.细胞样本制备准备：● PBS：8.0g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，溶于800ml去离子水中，HCl调pH至7.4，加水定容至1L。

TUNEL联合免疫组化方法

TUNEL联合免疫组化的实验步骤一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光)1、常规程序制备石蜡组织块和5 wm厚石蜡组织切片。

2、然后按照TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒的标准步骤进行TUNEL染色。

对于石蜡切片：a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。

换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。

无水乙醇5分钟。

90%乙醇2分钟。

70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。

b. 滴加20µg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。

c. 用PBS或HBSS洗涤3次。

注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

d. 在用PBS配制的3%过氧化氢溶液(3% H2O2 in PBS)中室温孵育10分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。

随后用PBS或HBSS洗涤3次。

注：请勿在用PBS配制的3%过氧化氢溶液中孵育过长时间，否则会出现过氧化氢导致的DNA断裂，从而产生假阳性。

e. 配制生物素标记液：参考下表配制适量的生物素标记液，需充分混匀。

注意：配制好的生物素标记液必须一次使用完毕，不宜冻存。

f. 样品的生物素标记：1. 在样品上加50µl 生物素标记液，37℃孵育60分钟。

注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少生物素标记液的蒸发。

2. 用PBS或HBSS洗涤1次，滴加0.1-0.3ml标记反应终止液，室温孵育10分钟。

3. 用PBS或HBSS洗涤3次。

g. Streptavidin-HRP工作液和DAB显色液的配制： a. Streptavidin-HRP工作液的配制：参考下表配制适量的Streptavidin-HRP工作液，需充分混匀。

注意：配制好的Streptavidin-HRP 工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。

h. DAB显色液的配制：按照每个样品使用0.2-0.5ml显色液的比例配制适量DAB显色液。

TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤

TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤一、试剂盒内容2.终止缓冲液：用于停止DNA链的合成反应，防止假阳性结果的产生。

3.蛋白酶K：用于溶解细胞质膜和核膜，使DNA暴露出来。

4.异硫氰酸荧光素（FITC）标记转移酶：用于检测dUTP与DNA标记的连接。

5.正控组织切片或细胞悬液：用于检验试剂盒的敏感性和特异性。

二、操作步骤1.细胞处理将要测试的细胞分成实验组和对照组，分别处理。

实验组是要测试凋亡的细胞，对照组是不会凋亡的细胞。

2.固定细胞用4%的乙醛或无氧乙醛等适当浓度的固定液固定细胞。

涂片上的细胞需要进行细胞穿孔，可以使用0.1%的Triton X-100进行细胞穿孔。

3.蛋白酶K消化将蛋白酶K溶解在PBS缓冲液中，加入溶液中胶原酶和蛋白酶蚀解，接着加入盛有细胞的离心管中。

将离心管放入37℃恒温水浴中，反应20-30分钟。

4.清洗细胞用PBS缓冲液洗涤细胞3次。

每次用PBS缓冲液冲洗细胞5分钟。

5.脱水将细胞离心，抽去PBS缓冲液，然后使用3%的过氧化氢来进行脱水。

6.TUNEL染色将细胞加入等量的TUNEL试剂液，轻轻混合后，将离心管放入37℃恒温水浴中，反应30-60分钟。

7.洗涤细胞用PBS缓冲液洗涤细胞3次。

每次用PBS缓冲液冲洗细胞5分钟。

8.反应终止使用终止缓冲液反应终止DNA链合成反应，将离心管放入室温中静置10分钟。

9.洗涤细胞用PBS缓冲液洗涤细胞3次。

每次用PBS缓冲液冲洗细胞5分钟。

10.展片与观察将细胞滴在载玻片上，并加入封片缓冲液。

在载玻片上覆盖盖玻片，用显微镜观察。

通过上述步骤，可以使用TUNEL细胞凋亡试剂盒对细胞进行凋亡分析。

该试剂盒可根据DNA末端的3'-OH羟基与终止缓冲液中标记的dUTP之间的连接，用显微镜观察细胞内是否存在凋亡现象。

荧光标记的dUTP可通过荧光显微镜直接观察，而酶标记的dUTP则需要加入相应的底物，通过酶的催化反应后可通过光学密度法或荧光显微镜来定量测定。

TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法tunel完成

催化3’-OH末端 dUTP反应的关键酶
3.荧素-dUTP ：
TdT的底物和本实验的标记物
4.蛋白酶K：
消化组织，增加细胞通透性
TUNEL的原理
凋亡细胞的特征是:内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质DNA被切割，出现单链或双链缺口，并产生与DNA断点数目相同的 3’-OH末端。末端脱氧核糖核酸转移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT)能将脱氧核糖核苷酸连接到DNA 的3’-末端。 TUNEL的原理是：用荧光素（fluorescein）标记的脱氧核糖核苷酸，在TdT 的作用下连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，用荧光显微镜即可观察结果。在此基础上连接辣根过氧化酶标记的荧光素抗体，可进一步放大检测信号，并且普通显微镜观察实验结果。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。
TdT介导的dUTP缺口末端标记技术 (TUNEL)
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。
爱是什么？一个精灵坐在碧绿的枝叶间沉思。风儿若有若无。一只鸟儿飞过来，停在枝上，望着远处将要成熟的稻田。精灵取出一束黄澄澄的稻谷问道：“你爱这稻谷吗？” “爱。” “为什么？” “它驱赶我的饥饿。” 鸟儿啄完稻谷，轻轻梳理着光润的羽毛。 “现在你爱这稻谷吗？”精灵又取出一束黄澄澄的稻谷。鸟儿抬头望着远处的一湾泉水回答：“现在我爱那一湾泉水，我有点渴了。” 精灵摘下一片树叶，里面盛了一汪泉水。鸟儿喝完泉水，准备振翅飞去。 “请再回答我一个问题，”精灵伸出指尖，鸟儿停在上面。 “你要去做什么更重要的事吗？我这里又稻谷也有泉水。” “我要去那片开着风信子的山谷，去看那朵风信子。” “为什么？它能驱赶你的饥饿？” “不能。” “它能滋润你的干渴？” “不能。”爱是什么？一个精灵坐在碧绿的枝叶间沉思。风儿若有若无。一只鸟儿飞过来，停在枝上，望着远处将要成熟的稻田。精灵取出一束黄澄澄的稻谷问道：“你爱这稻谷吗？” “爱。” “为什么？” “它驱赶我的饥饿。” 鸟儿啄完稻谷，轻轻梳理着光润的羽毛。 “现在你爱这稻谷吗？”精灵又取出一束黄澄澄的稻谷。鸟儿抬头望着远处的一湾泉水回答：“现在我爱那一湾泉水，我有点渴了。” 精灵摘下一片树叶，里面盛了一汪泉水。鸟儿喝完泉水，准备振翅飞去。 “请再回答我一个问题，”精灵伸出指尖，鸟儿停在上面。 “你要去做什么更重要的事吗？我这里又稻谷也有泉水。” “我要去那片开着风信子的山谷，去看那朵风信子。” “为什么？它能驱赶你的饥饿？” “不能。” “它能滋润你的干渴？” “不能。”

自己翻译的罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书

⾃⼰翻译的罗⽒tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书罗⽒tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书注意：Label溶液含有甲次砷酸盐和⼆氯化钻，严禁吸⼊和⾷⼊反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中，按有毒废物处理。

需要⾃⼰配置的其他物品：除上表所列试剂外，还需准备以下溶液。

下表列出每步所需物品概览:产品概述:特异性：TUNE反应优先标记凋亡产⽣的DNA链断裂，从⽽辨别凋亡与坏死、以及由抑制细胞⽣长的药物或放射线产⽣的primary DNA 链断裂实验⼲扰：假阴性：在某些型式的凋亡细胞中DNA链断裂可能缺失或不完全。

空间位阻，如细胞外元件可能阻⽌TdT到达DNA断裂处。

两种情况均能产⽣假阴性。

假阳性：在坏死晚期，可能产⽣⼤量的DNA⽚段DNA 链断裂也可能在具有⾼增殖和代谢活动的细胞中出现。

两种情况均能产⽣假阳性。

为确认细胞死亡的凋亡型式，应认真进⾏每种细胞的形态学检查凋亡过程中产⽣的形态学改变尤其特征形式，因此，对于可以结果进⾏解释时，细胞形态评估是⼀项重要的参数样本：细胞离⼼涂⽚和细胞涂⽚在chamber slides 上培养的黏附细胞冰冻或福尔马林固定、⽯蜡包埋样本分析时间：2-3⼩时，除外培养、固定和渗透检测次数：⼀个试剂盒50T试剂盒存储/稳定性：未开封试剂盒储存于-15?-25 C可稳定⾄标签上标明的效期步骤和所需材料：1流程图：2样品准备2.1黏附细胞、细胞涂⽚和细胞离⼼涂⽚需准备的其他试剂：Washing buffer :磷酸盐缓冲液（PBS Blocking buffer封闭溶液：甲醇稀释的3%H2O2Fixation solution 固定溶液：PBS配制的4%多聚甲醛，ph 7.4，新鲜配制Permeabilisation solution 渗透液：0.1%Triton 1 X-100溶于0.1%柠檬酸钠溶液中，新鲜配制。