2015免疫学实验方法
免疫学实验方法
免疫学实验方法免疫学实验方法是免疫学研究的重要部分，它通过一系列的技术手段来识别、分析免疫系统中的各种生物分子、细胞和组织，以及它们之间的相互作用。
这些方法在免疫学领域广泛应用于疾病诊断、药物研发、疫苗研究等方面，对促进免疫学的发展和应用发挥了重要作用。
下面将介绍一些常用的免疫学实验方法。
一、ELISA法ELISA（酶联免疫吸附试验）是一种用于检测抗体或抗原的免疫学实验方法。
该方法通过将待测抗体或抗原与固相物质结合，再加入酶标记的二抗来进行标记，最后通过酶底物的底物变色反应或荧光底物的发光反应来检测待测抗体或抗原的存在量。
二、流式细胞仪流式细胞仪是一种用于分析和计数悬浮细胞的仪器，它利用激光照射细胞，通过细胞膜上的特异性抗体标记来检测细胞的表面标记物和内部细胞器的性质和分布，对免疫细胞的表型和功能进行高效的分析。
三、免疫印迹法免疫印迹法是一种用于检测蛋白质的免疫学实验方法，通过电泳将待测蛋白分离，再将其转移到膜上，最后使用特异性抗体和标记的二抗来检测待测蛋白的存在量和大小。
四、免疫组化法免疫组化法是一种用于检测组织中特定蛋白的免疫学实验方法，通过将组织切片后进行脱水、脱脂和脱水处理，再使用特异性的抗体来标记待测蛋白，并观察标记物的颜色变化或发光情况来确定蛋白的位置和表达量。
五、免疫沉淀法免疫沉淀法是一种用于检测蛋白相互作用的免疫学实验方法，通过将待测抗体与蛋白结合，再使用蛋白A/G琼脂糖或磁珠等材料将蛋白抗原免疫沉淀下来，最后使用核酸酶或质谱技术来分析蛋白的互作关系。
以上介绍的是一些常用的免疫学实验方法，它们在免疫学研究中起着举足轻重的作用，不仅在科研领域有重要应用，同时在临床诊断和治疗中也有着广泛的运用。
希望以上内容能够对您有所帮助。
免疫学实验操作流程
免疫学实验操作流程第一次实验 双向免疫扩散试验1、小鼠摘眼球取血，双侧均摘取，(搞眼球者和用Eppendorf 管接血者配合好，尽量不要让血液流到管外)。
收集血液于Eppendorf 管中(1管/鼠)。
(小鼠取血前12小时停止给固体食物，多给水)2、待血液凝固后，用牙签剥离血块，将Eppendorf 管于37℃放置半小时后，转入4℃ 冰箱中，直至血清彻底析出(约2小时)。
3、在第一个半小时内(37℃ 孵育)，解剖小鼠，观察小鼠免疫器官的状、大小、位置等。
4、在4℃ 的2个小时内，要做两件事情。
一是为第二天的ELISA 实验做准备，具体是包被的那一步骤；二是双向免疫扩散的实验操作。
(1) ELISA 的包被包被是将抗原吸附于酶标板的过程。
抗原的包被浓度为10ug/ml 。
48孔酶标板各孔依次加包被液100ul/孔，注意设置空白对照。
包被好的酶标板置于4℃ 过夜。
包被说明：设三复孔。
A1-A3不包被抗原，C1-C3不包被抗原，它们用于阴性对照。
2 43 5 6 7 8 10 9 1211(2) 琼脂双向免疫扩散实验操作步骤①制板配制1.5%琼脂粉溶液(用生理盐水)，微波炉加热至琼脂成溶胶状态(短间隔多次)，室温自然冷却至50℃左右(手摸上去能忍受)将琼脂粉溶液倾倒至载玻片上，待琼脂成凝胶状态后进行下一步。
(琼脂凝胶尽可能厚一些)②打孔用打孔器在琼脂上打孔。
③为稀释抗体和抗原(倍比稀释)做准备。
抗体浓度在做预实验时从原浓度开始稀释至8倍结束共3个梯度。
稀释方法：取三个EP管，分别标记为1/2、1/4、1/8。
每管先加50ul的生理盐水。
取血清50ul，加入标记1/2的EP管内，充分混匀后，用加样器吸出50ul，加入到标记有1/4的EP管内，再充分混匀后，再取出50ul，加入至标记1/8的EP管内，充分混匀。
再将各管内的血清加入到对应的孔内，每个对应孔加25ul(见图)。
④加样结束后将载玻片置于一个湿盒内，置于37℃孵箱中过夜。
免疫学实验技巧分享
免疫学实验技巧分享免疫学实验是生命科学研究中的重要组成部分，对于揭示免疫机制、诊断疾病以及研发免疫治疗方法都具有至关重要的意义。
在进行免疫学实验的过程中，掌握一些实用的技巧可以大大提高实验的成功率和准确性。
接下来，我将为大家分享一些在免疫学实验中积累的宝贵经验。
一、实验前的准备（一）实验设计在开始实验之前，一定要进行详细的实验设计。
明确实验的目的、预期结果以及所需的实验步骤。
同时，要考虑到可能出现的误差和干扰因素，并制定相应的应对措施。
合理的实验设计是实验成功的基础。
（二）试剂和材料的选择选择高质量、可靠的试剂和材料至关重要。
对于抗体、细胞因子等关键试剂，要选择知名品牌，并仔细查看其说明书，了解其适用范围、保存条件和使用方法。
此外，实验中使用的耗材，如移液器枪头、离心管等，也要确保无菌、无杂质。
（三）仪器设备的校准和维护定期对实验中使用的仪器设备进行校准和维护，如移液器、离心机、酶标仪等。
确保仪器的准确性和稳定性，能够有效减少实验误差。
二、细胞培养技巧（一）细胞的复苏细胞复苏是细胞培养的第一步，操作不当容易导致细胞死亡。
从液氮中取出细胞冻存管后，要迅速放入 37℃水浴中，轻轻摇动使其快速融化。
融化过程中要避免水没过管盖，以免造成污染。
待细胞完全融化后，将其转移至离心管中，加入适量的培养基，离心去除冻存液，然后将细胞重悬并接种到培养瓶中。
（二）细胞的传代当细胞生长至 80%－90%汇合度时，需要进行传代。
传代前要先对细胞进行消化处理，常用的消化酶有胰蛋白酶和 EDTA 等。
消化时间要根据细胞的类型和状态进行调整，一般控制在 1-5 分钟。
消化结束后，加入适量的培养基终止消化，轻轻吹打细胞使其分散，然后按照适当的比例进行传代。
（三）细胞的冻存为了长期保存细胞，需要进行冻存。
冻存细胞时，要先将细胞消化、离心，然后用含有 10%DMSO 的冻存液重悬细胞，将细胞分装至冻存管中，缓慢降温至－80℃，最后转移至液氮中保存。
免疫学检测技术
anti-CD4
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磁珠分离法
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磁珠分离
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荧光激活细胞分选仪分离法 流式细胞术
• 鉴定荧光抗体单色、 双色或多色标记的细 胞。 • 分析细胞周期 • 分析细胞凋亡情况
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流式细胞术
荧光抗体标 记混合细胞
抗体含 量测定 溶血空 斑试验
51Cr释放法
乳酸脱氢 酶释放法
细胞染 色法
凋亡细胞 检测法
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淋巴细胞的分离
• 外周血 • 淋巴细胞分离液 • 外周血单个核细胞 PBMC
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外周血单个核细胞的分离
稀释 血液
离心
血浆
单 个核细胞 (PBMC，包 括淋巴细胞、 DC和NK)
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淋巴细胞转化试验（形态学示意图）
原理：人T细胞表面有PHA或ConA受体，T细 胞在体外受PHA或ConA的刺激后能转化为体积 较大、代谢旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞， 以此测定T细胞的功能。
淋巴细胞分 离液(葡聚糖 -泛影葡胺 r=1.078)
红细胞和 粒细胞
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65Байду номын сангаас
淋巴细胞类型鉴定
• • • • • 免疫吸附分离法 免疫荧光法 磁珠分离法 流式细胞术 抗原肽-MHC分子四聚体技术
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免疫吸附分离法
加入淋巴 细胞悬液
anti-CD4
anti-CD4
弃上清
免疫比浊
在一定量抗体中分别加入递增率抗原， 经一定时间后形成免疫复合物，以浊度 计测量反应液体的浊度，根据标准曲线 推算样品中抗原含量。
(基础医学)免疫学实验技术
实验方法
免疫3~4次以后从耳静脉取血检测效价 • 酶联法：1:104以上，能达到1:106。 • 免疫双扩散： 1:16以上，能达到1:64
效价达到要求的可放血制备血清 • 可一次放血(颈动脉) • 也可多次取血(耳静脉)
多抗的特点
多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质是一个群体综合 的性质。
基础免疫 • 0.5ml抗原(含0.25~0.5mg蛋白或108颗粒抗原) • 0.5ml佛式完全佐剂(CFA) • 制备抗原-佐剂乳化液 • 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射
加强免疫 • 间隔2-4周,可进行多次 • 0.5ml抗原(蛋白量减半) • 0.5ml佛式不完全佐剂(IFA) • 制备抗原-佐剂乳化液 • 背部、颈部皮下多点注射或腿部肌肉注射
放血制备血清： 可一次放血(颈动脉) 也可多次取血(耳静脉)
佐剂的作用机理： 延长抗原的作用时间 增强吞噬作用 刺激抗原提呈
取血测效价： 加强免疫两次或 三次以后的第7天取
血。
促进细胞因子分泌 诱导淋巴细胞分裂、增殖 影响T细胞“极化”
实验方法
新西兰大耳白，2000g(雌雄均可),健康,无病原
特点
• 成本较低，步骤较复杂。 • 抗体回收率很低。 • 抗体纯度高，电泳后杂带很少，适合于各种标记。 • 需要高速离心机，耐高速离心的玻璃离心管。
离子交换法
原理
• 利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离. • DEAE是一种阴离子交换剂，自身带正电荷
(Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基) • 将样品的pH值调至等电点以上,使样品带负电荷. • 采用盐溶液洗脱,通过高浓度的带同种电荷的离子(Cl-)置换被分离的组分.
免疫学实验教学（复旦大学）实验报告
实验二： 对流免疫电泳实验报告实验者：毛寰宇 时间：2015年3月25日 合作者：周鹏、张国栋一、实验原理对流免疫电泳是双向琼脂扩散与电泳分析的结合产物。
CIEP 是一种加速的免疫双扩散技术。
在琼脂糖凝胶平板的两个孔中分别加入抗原和抗体，抗体侧连接电源正极。
通电后，带负电荷的抗原向抗体孔方向移动，而抗体则由于电渗作用被带向抗原孔侧。
两者相遇时形成沉淀物。
可用于检测抗原，但敏感性较低。
在pH8.6的缓冲液中，大部分蛋白质抗原成分（等电点约3~5）常带较强的负电荷，在电场中向正极移动；而作为抗体的IgG ，等电点偏高(约为5~6)，在pH8.6时带负电荷较少，再加上分子量较大，移动速度慢，所以它本身向正极移动缓慢甚至不移动，这样它就会在凝胶的电渗作用下，随水流向负极，电渗引向负极移动的液流速度超过了IgG 向正极的移动，因此抗体移向负极，在抗原抗体最适比处形成沉淀线。
二、实验材料1、抗原 & 抗体2、微量可调加样器、加样头、玻片3、打孔器、针头、打孔样纸（均放平皿内）4、电泳液、电泳槽、电泳仪、标签纸5、1.2%琼脂糖(加热溶化）、5ml 刻度吸管、吸耳球三、实验步骤1、制版与打孔：取洁净玻片，将1.2%融化的琼脂3~4ml 均匀浇注于玻片上，厚度约1.5~2.0mm 。
待琼脂凝固后，放置于打孔样纸上，按样纸上图形打孔。
2、用水倍比稀释抗体：原液、1: 2、1: 4、1: 8。
3、加样：在加样孔中加入5 μl 待测抗原样品（人IgG ）和抗体（羊抗人IgG 血清）。
靠近负极的孔中加入抗原，正极端的孔中加入抗体，玻片标记抗原抗体方向。
4、电泳：将已加样的琼脂板平放于电泳槽内，以纱布为桥，电压为100v ，时间约30min 。
四、实验结果图1：实验电泳结果A.原液、1:2、1:4稀释抗体条件下均可见沉淀线；1:8稀释度不能见沉淀线。
B.抗体稀释到1:2后，可见沉淀线向抗体侧移动。
1:2和1:4条件下沉淀线位置差异较小。
免疫学实验技术分享
免疫学实验技术分享免疫学是一门研究生物体免疫系统结构和功能的学科，它对于理解疾病的发生机制、诊断疾病以及开发治疗方法都具有极其重要的意义。
而免疫学实验技术则是我们探索免疫系统奥秘的有力工具。
在这篇文章中，我将和大家分享一些常见且重要的免疫学实验技术。
一、免疫细胞的分离与鉴定免疫细胞包括淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等，它们在免疫应答中发挥着不同的作用。
要研究这些细胞的功能，首先需要将它们从复杂的细胞混合物中分离出来。
1、密度梯度离心法这是一种常用的分离免疫细胞的方法。
其原理是根据细胞的密度不同，在一定的离心力作用下，使其在密度梯度介质中分层，从而实现分离。
例如，我们可以使用淋巴细胞分离液来分离外周血中的单个核细胞。
2、流式细胞术这是一种能够对单个细胞进行快速定量分析和分选的技术。
通过给细胞标记上特定的荧光抗体，然后让细胞逐个通过激光束，仪器可以检测到荧光信号，从而确定细胞的表面标志物表达情况，进而对细胞进行鉴定和分选。
二、免疫细胞功能检测1、 T 细胞增殖实验T 细胞在受到抗原刺激后会发生增殖。
常用的检测方法有放射性核素掺入法，比如 3HTdR 掺入法。
将待检测的 T 细胞与刺激物共同培养一段时间后，加入 3HTdR，通过检测细胞内掺入的放射性强度，就可以反映 T 细胞的增殖情况。
2、细胞毒实验这是检测细胞毒性 T 细胞（CTL）或自然杀伤细胞（NK 细胞）杀伤活性的方法。
常见的有 51Cr 释放法，将靶细胞用 51Cr 标记，与效应细胞共同培养后，检测上清液中的放射性强度，从而反映效应细胞的杀伤能力。
三、抗体检测技术1、酶联免疫吸附试验（ELISA）这是一种广泛应用的抗体检测方法。
将抗原或抗体固定在固相载体上，然后加入待检测的样品，通过酶标记的二抗和底物显色来检测样品中抗体或抗原的含量。
ELISA 有多种类型，如间接法、双抗体夹心法等。
2、免疫荧光技术利用荧光素标记的抗体与抗原结合，在荧光显微镜下观察荧光的分布和强度，从而确定抗原或抗体的存在和定位。
免疫学实验的流程
2、取待检样本（矿泉水三种），原液 各一毫升，加样至培养皿中间。 3.60℃ 水浴中取出培养基，倾注到培养 皿中（约1/4~1/3高度），将培养基与样 本轻轻混匀，自然冷却 注意：要 将瓶口用 火烤一下， 以防止空 气中的细 菌进入
4、做好标记，从超净做台取出，放 入培养箱，37℃ 培养24小时。
5、观察菌落结果计数
实验得出3号样品细菌最多，4 号最少细菌。
提醒我们不能吃开封过久的 食物，不然会对身体不好哦。
谢谢
免疫学实验的流程
固定培养基配制步骤
1、称量 7.6g—200ml
2、溶灭菌
空气水中微生物检测
准备：高压蒸汽灭菌器 无菌培养皿 普 通琼脂培养基 一毫升无菌枪头 一毫升 移液器 恒温培养箱
步骤
1、配制普通琼脂培养基，高压灭菌 后用，使用前溶解，然后放入60℃ 水 浴保温。
免疫学实验操作技巧
免疫学实验操作技巧免疫学实验是研究免疫系统及其相关疾病的重要手段，准确而熟练的实验操作技巧对于获得可靠的实验结果至关重要。
在这篇文章中，我们将详细介绍一些常见的免疫学实验操作技巧，帮助您在实验中更加得心应手。
一、实验前的准备在进行免疫学实验之前，充分的准备工作是成功的关键。
首先，要熟悉实验的目的和原理，仔细阅读实验操作手册，了解所需的试剂、仪器和设备。
同时，确保实验环境的清洁和无菌，对实验台面、移液器等进行消毒处理。
准备好高质量的试剂也是必不可少的。
购买试剂时，要选择可靠的供应商，并注意试剂的保质期和储存条件。
对于需要自行配制的试剂，要严格按照配方和操作步骤进行，确保浓度和纯度的准确性。
仪器设备的校准和调试同样重要。
例如，移液器需要定期校准，以保证移液的准确性；离心机的转速和时间要根据实验要求进行正确设置。
二、样本的采集和处理样本的质量直接影响实验结果的准确性。
在采集血液样本时，要注意无菌操作，避免血液受到污染。
对于血清样本，采集后要让血液自然凝固，然后通过离心分离血清。
离心的速度和时间要适当，一般为3000rpm，10-15 分钟。
组织样本的采集要迅速，并在低温条件下保存，以防止蛋白质的降解。
在处理组织样本时，要将其充分匀浆或研磨，以释放出细胞内的成分。
细胞样本的处理需要特别小心。
在培养细胞时，要控制好培养条件，如温度、湿度、CO₂浓度等。
在收集细胞时，要使用适当的消化酶，避免对细胞造成损伤。
三、抗体的选择和使用抗体是免疫学实验中最常用的试剂之一。
选择合适的抗体对于实验的成功至关重要。
要根据实验的目的和样本的类型选择特异性高、亲和力强的抗体。
同时，要注意抗体的来源（如鼠抗、兔抗等）和亚型（如 IgG、IgM 等）。
在使用抗体时，要按照说明书进行稀释。
稀释抗体的缓冲液要选择合适，一般常用的有 PBS、TBS 等。
稀释后的抗体要在规定的时间内使用，避免长时间放置导致活性下降。
为了提高实验的准确性，常常需要进行抗体的预吸附。
常见免疫学试验技术
免疫学实验实验一与免疫相关的细胞形态的观察目的要求：观察与免疫相关的几种细胞的形态，了解它们在机体免疫反应中的作用。
实验器材：显微镜血液涂片（瑞氏染色）结缔组织切片方法：油镜观察一．血涂片的观察（A）红细胞：淡红色，无核的圆形细胞，因红血球为双凹形，故边缘部分染色较深，中心较浅，直径7—8微米。
（B）颗粒白血球嗜中性颗粒白血球：体积略大于红细胞，细胞核被染成紫色分叶状，可分1—5叶，核叶之间联以染色质细丝，染色质染成粉色，其中充满细小的大小均匀的颗粒被染成紫红色。
直径10—12微米。
嗜酸性颗粒白血球：略大于嗜中白血球，细胞核染成紫色，通常为2叶，胞质充满嗜酸性大圆颗粒，被染成鲜红色。
直径10—15微米。
嗜碱性颗粒白血球：体积略小于嗜酸性白血球，细胞质中有大小不等被染成紫色颗粒，颗粒数目较嗜酸性白血球的颗粒少，核为1—2叶染成淡兰色。
直径10—11微米。
（C）无颗粒白血球淋巴细胞：涂片中可观察到中、小型两种。
小淋巴细胞与红血球大小相似，圆形。
其中含致密的核，染成深紫色。
周围仅有一薄层嗜硷性染成淡蓝的细胞质。
中淋巴细胞较大，有较宽层的细胞，核圆形。
6-8微米。
单核细胞：体积最大，细胞圆形。
胞质染成灰蓝色。
核呈肾形或马蹄形，染色略浅于淋巴细胞的核。
直径14-20微米。
二．肥大细胞的观察（示教）胞体较大，呈卵圆形，胞质内充满粗大均等的嗜硷性颗粒。
其中含肝素、组织胺等物质。
常成群地分布于血管的周围。
三．浆细胞的观察（示教）细胞呈圆形或卵圆形，胞质丰富，呈嗜硷性。
核圆形，着色深，多偏于细胞的一侧，染色质核膜呈车轮分布。
正常组织浆细胞少，慢性炎症时增多。
浆细胞合成和分泌抗体，对免疫有重要意义。
四．巨噬细胞：又称组织细胞，细胞形态不规则。
常伸出短而钝突起，有很强的吞噬能力。
附：瑞特氏染色：1．染色液配置称取瑞特氏染料0.1克溶于60ml甲醇中，过滤。
贮褐色瓶中备用。
（配置时，要先将瑞特氏染料置研钵体内边研边滴加甲醇，使染料溶液得更好。
免疫学实验方案重要
抗体的制备一、实验目的掌握抗体制备的实验原理和方法。
二、实验原理三、实验试剂及器材四、操作步骤将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身。
剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管扩张、充血。
用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集30～40ml 。
然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。
放血过程中要严格按无菌要求进行。
收集的血液，4000rmp离心10min，弃上清，得到血浆，即抗体。
抗体的制备、鉴定、纯化及纯度鉴定一、实验目的⒈加深对抗体基本知识的了解。
⒉了解多克隆抗体的制备及纯化的基本方法。
⒊了解免疫电泳的基本过程和实验依据。
1、抗体的制备一、实验原理当将抗原注射入实验动物体内时，一系列抗体生成细胞会不同程度的与抗原结合，受抗原刺激后在血液中产生不同类型的抗体，这种由一种抗原刺激产生的抗体称为多克隆抗体。
多克隆抗体中不同的抗体分子可以以不同的亲和能力与抗原分子表面不同的部分—抗原决定簇相结合。
将抗原导入敏感动物体内后，可刺激网状内皮细胞系统，尤其是淋巴结和脾脏中的淋巴细胞大量增殖。
如图所示，实验动物对初次免疫和二次免疫的应答有明显的不同。
通常初次免疫应答往往比较弱，尤其是针对于易代谢，可溶性的抗原。
首次注射后大约7天，在血清中可以观察到抗体但抗体的浓度维持在一个较低的水平，在大约10天左右抗体的滴度会达到最大值。
但同种抗原注射而产生的二次免疫应答的结果明显不同，和初次免疫应答相比抗体的合成速度明显增加并且保留时间也长。
免疫应答的动力学结果取决于抗原和免疫动物的种类，但初次和二次免疫应答之间的关系是免疫应答的一个重要特点。
三次或以后的抗原注射所产生的应答和二次应答结果相似：抗体的滴度明显增加并且血清中抗体的种类和性质发生了改变，这种改变被称为免疫应答的成熟，具有重要的实际意义。
通常在抗原注射4-6周后会产生具有高亲和力的抗体。
实验13 经典免疫技术
又称双向琼脂扩散，是利用琼脂凝胶作介质 的一种沉淀反应。 琼脂是多孔的网状结构，可使大分子物质 通过，分子的扩散作用使分别两处的抗原抗体 相遇，比例合适时形成沉淀，可观察到沉淀线。 沉淀线的特征与位置取决于抗原分子的大 小、结构、扩散系数和浓度等。当抗原、抗体 存在多种体系时，会出现多条沉淀线。 因此可用来检查抗原和免疫血清的特异性、 纯度或浓度比较抗原之间的异同点，因而应用 范围较广。
每孔加入 抗原/抗体10μl
0
1/16 Ab Ab 1/8
1/1 Ab
Ag
1/4 Ab
Ab 1/2
注意事项 （1）打孔时，不要将琼脂划破； （2）加样时，不要溢出孔外； （3）加样用的吸管不要混用。
（四） 结果记录
三、胶体金标记技术
用胶体金颗粒标记已知抗体或抗原，检测标本中未 知抗原或抗体的技术。 （一）原理
+
（二）材 料
标准抗A、抗B诊断血清；受测者红细胞、 盐水、采血针、棉球、玻片等。 待测细菌纯培养物，标准诊断血清
（三）方 法（血型测定）
1．取一块清洁玻片，用记号笔划上记号，左上角写A 字，右上角写B字。 2．用小滴管吸A型标准血清（抗B）一滴加入左侧，用 另一小滴管吸B型标准血清（抗A）一滴加入右侧。 3．穿刺手指取血，玻片的每侧各放入一小滴血，用牙 签搅拌，使每侧抗血清和血液混和。每边用一支牙签， 切勿混用。 4．静置室温下数分钟后，在白色背景下肉眼观察，也 可显微镜观察。 注意事项： 1、采血时要尽量避免用力挤压手指或耳垂，以免发生 溶血影响结果。 2、如肉眼观察难以辨认，可使用显微镜观察凝血现象。
操作流程
（三）方 法（细菌菌型测定）
1.取一块清洁载玻片，用记号笔划上记号，在一侧滴加标 准的诊断血清一滴,另一侧滴加一滴生理盐水。 2.用接种环无菌操作取适量的待测细菌,分别与标准诊断 血清和生理盐水混均。 3.静置室温下数分钟后，在白色背景下肉眼观察，也可显 微镜观察。 注意事项： （1）生理盐水、诊断血清要适量； （2）待检菌为肠道致病菌，注意无菌操作，玻片用后放 入消毒缸内； （3）用接种环取待检菌时，不要挑取琼脂；待检菌与生 理盐水、诊断血清混匀时，不要涂得太宽，否则影响结 果观察。
医学免疫学实验指导
医学免疫学实验指导医学免疫学实验指导病原生物与免疫学教研室实验一免疫系统组织和细胞形态学一、实验目的观察小鼠胸腺、脾脏等免疫器官及免疫细胞二、实验内容机体免疫系统由免疫器官、免疫细胞、免疫分子组成。
该系统具有识别和排除抗原性异物、维持机体内环境稳定和生理平衡的功能，是执行体液免疫和细胞免疫的物质基础。
本次实验主要观察免疫器官大体解剖学、免疫细胞的形态学特征。
小鼠是啮齿目中体形较小的动物，淋巴系统很发达，包括胸腺、脾脏、淋巴管、外周淋巴结及肠道派氏集合淋巴结。
本实验在带教老师指导下，解剖小鼠，观察胸腺、脾脏等免疫器官，并制血涂片，观察小鼠免疫细胞。
（一）小鼠免疫器官解剖学观察【材料】１动物：昆明种小白鼠。
２试剂：3%来苏尔水，瑞特氏染液。
３器材：眼科镊，眼科剪，玻片。
【方法】１小鼠脱臼处死，投入盛有3%来苏尔水的缸内，浸泡5分钟。
取出小鼠，仰卧位置于试验台上，使动物腹部朝上。
２以镊子提起耻骨处皮肤，用剪刀沿正中线直剪开至下颌部，然后钝性分离皮肤，再把皮肤向四肢剪开。
３注意观察腹壁，用剪刀沿正中线自阴部至膈肌为止剪开，观察腹腔液量及性状，观察脾脏。
４切开膈肌，剪断胸骨，翻起胸骨，观察胸腺、心脏及肺脏，胸腺位于小鼠胸腔心脏前上方，内有许多大淋巴细胞（即前胸腺细胞）及特定的上皮网状细胞（分泌胸腺激素）。
５解剖结束，深埋动物。
（二）免疫细胞的形态观察【材料】１动物：昆明种小白鼠。
２试剂：3%来苏尔水，瑞特氏染液，pH8.6硫酸盐缓冲液，20%盐酸甲醇。
３器材：眼科镊，眼科剪，玻片。
【方法】１准备洁净玻片两张，一张用于推片，另一张用于固定标本。
２剪断小鼠尾巴取血或小鼠眼球取血，迅速在玻片上涂血膜制备血涂片，自然干燥。
３瑞氏染色（１）染色：甲醇固定标本２分钟（亦可省略），滴加瑞氏染液数滴覆盖血膜，染色１分钟，再加等量的pH8.6硫酸盐缓冲液或新制蒸馏水，用洗耳球吹打，使之与染液混匀，静置染色8～10分钟，弃去染料，水洗。
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•用途：目标蛋白的定性或定量分析
ELISA三个必要试剂：
（1）固相的抗原或抗体，
即"免疫吸附剂"（immunosorbent）;
（2）酶标记的抗原或抗体， 称为"结合物"（conjugate）； （3）酶反应的底物。
ELISA基本的实验过程： a.包被 b.抗原抗体反应 c.酶促反应,显色 d.终止显色，读取数据。 对照和标准曲线： 阳性对照 阴性对照 定量测定：标准品制作标准曲线 待测样品的合理稀释
细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。
详细见后述
3．细胞毒试验
细胞毒实验技术是检测 CTL 、 NK 等细胞杀伤靶
细胞活性的一种细胞学技术。主要用于肿瘤免疫、
移植排斥反应和病毒感染等方面的研究。
（1）放射性核素释放法：(51Cr、125I—UdR)
51Cr
release
CTL
51Cr
labeled
织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核 阳性。 • ELISA用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是 血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到
组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作
上 开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来 形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸 附”的含义。
待测抗原
包被抗原 包被抗体
Anti-HIV, Anti-HBs
HBsAg ,HCV core Ag, HBeAg,HBV preS1,PreS2
☆双抗体夹心法测抗原步骤
包被特异性抗体
洗涤
加入待测样品
孵育 洗涤
加酶标特异性抗体
孵育 洗涤
底物显色
☆双抗体夹心法测抗原特点
• 抗原浓度过高出现钩状效应（Hook effect）: 所得结果将低于实际含量，严重时甚至可出现
可通过以下三种方法检测。
1）形态计数法
2）3H-TdR或125I-UdR掺入法
放射性元素 wash
Stimulate
Assay
3）MTT（噻唑蓝）比色法 MTT是一种可接受氢离子的淡黄色唑氮盐染料，被
活细胞线粒体呼吸链中的琥珀酸脱氢酶和细胞色素
还原，生成不溶于水的深紫色结晶产物甲簪。因此
甲簪的生成量仅与活细胞数目成正比。细胞增殖速
ELISPOT（酶联免疫斑点法）
方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特异性B细胞。如果 B细胞产生抗体，抗体与班上的抗原结合。加入二抗和显色 剂就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。
此法的主要优点是:
① 稳定、特异，且抗原用量少；
②与ELISA联合使用，可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌
，并可定量测定； ③可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
2．B细胞功能测定
B 细胞受多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，
活化、增殖，最后分化为浆细胞，产生抗体。抗体
可以在血浆和其他体液中检出，检测抗体是测定 B
细胞功能的最主要的方法。 （1）B淋巴细胞增殖试验：LPS或PWM刺激
（2）B细胞产生抗体能力的检测：
1）ELISA检测培养上清中抗体的量。
2）ELISPOT（酶联免疫斑点法）可检测抗体分泌
细胞密度：
每毫升培养基中活细胞的个数=每个方块内细胞的平 均数×细胞稀释比例×104
1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 = 10-4cm3 = 10-4 ml
(二)免疫细胞功能的测定
1．T细胞功能测定
（ 1 ） T 淋巴细胞增殖试验： T 细胞受到特异性抗原
或有丝分裂原（PHA、ConA）刺激后可发生增殖，
度越快，则甲簪生成的量越多，吸光度越高；细胞
毒性越大，则甲簪生成的量越少，吸光度越低。
MTT实验流程
1. 细胞的增殖和细胞毒实验，一般可在96孔细胞培养板中进行。 2. 每孔加入100微升细胞悬液。细胞的数量取决于实验目的和培养时间。增殖实验 每孔通常加入103个以上数量的细胞；细胞毒性实验每孔至少加入5x103个或以上数 量的细胞(具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等 因素确定)。 3. 接种的细胞按照实验需要，送入细胞培养箱进行培养。增殖实验通常要给予010微升特定的药物或生长因子进行刺激。细胞毒实验通常要给予0-10微升抑制因子
结果判断 • 设立实验对照:阳性对照和阴性对照
• 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和R1–/–/TNFRR2–/–
Figure 3. mTNF induces infiltration of innate immune cells and angiostasis in tumors from TNFR1–/– but not TNFR1–/–/R2–/– mice. and CD31+ (E and F) cells as indicated. G and H, for confocal microscopy analysis, tissue sections were stained with Cy3-labeled anti-CD31 for blood vessel endothelial cells (green) and the VasoTACS in situ kit to detect apoptosis (red). Arrows, apoptotic endothelial cells in the tumor.
• 免疫组化和ELISA所用到的原理大致相同，只 是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上 有所不同。ELISA多用于定量分析，其灵敏度 非常高。 • Western Boltting 先要进行SDS-PAGE，然后 将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载 体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测 样品，可以用于定性和半定量。
ELISA与Western Blotting比较
• WB可以看到特异性的条带，但是定量比较麻烦； • ELISA可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那 得到的数值就不可信； • WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白,这点ELISA做不到； • WB所检测的一般是抗原，而ELISA抗原抗体都可以检测； • WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体 、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白 起作用的；而ELISA无能为力； • WB一次处理量就是一块胶版，10-20个样品最多了。ELISA一 块96孔板一次可以处理96个样本，可以设置多个复孔、对照 、梯度样等来提高检测的可信度。
或细胞毒药物；
4．培养结束后，每孔加入20微升MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育3－6小时； 5．孵育结束后，每孔加入100微升甲簪溶解液，在37℃细胞培养箱内再继续孵育， 直至在镜下观察甲簪全部溶解。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。 如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时 间会略长。 6. 在570nm测定吸光度。如无570nm滤光片， 560-600nm范围的滤光片均可使用。
•成败的关键因素： 组织的固定、包埋
抗体（特异性、浓度、孵育温度和时间）
非特异性抗原的封闭
内源性酶或自发荧光的消减
显色
思考：为什么有的抗体能用于冰冻切片却不能用于石蜡切片？
五、免疫印迹技术 –Western Blotting （分子生物学实验方法）
一. 蛋白质样品的提取分离
二. 蛋白质样品的定量
免疫学试验方法
Commonly used immunological methods
Liu Kangkang
kangll227@
免疫
识别和清除抗原性异物
可能有利，也可能有害
免疫应答
免疫系统具有区别“自己”和“非己”的能力
免疫耐受
免疫学检测与免疫学技术
一、抗原抗体的检测技术 二、免疫细胞的检测 三、细胞因子的检测-ELISA 四、免疫组织化学 五、免疫印迹技术 –Western Blotting 六、 流式细胞术 七、PCR技术 八、基因沉默技术
Target cell CTL
Target cell
Assay Cr51 release
Target cell
（2）乳酸脱氢酶释放法：细胞受损，LDH释放，
LDH在催化乳酸生成丙酮酸的同时将NAD+还原成
NADH 。后者再通过递氢体 - 吩嗪二甲酯硫酸盐
(PMS) 还原碘硝基氯化氮唑蓝 (INT) 或硝基氯化四 氮唑蓝(NBT)形成有色的甲簪类化合物，在490nm 或570nm波长处读取的OD值，经计算即可得NK细 胞活性. （3）MTT比色分析法
用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：
双抗体夹心法测抗原（常用） • 夹心法 双抗原夹心法测抗体 • 间接法测抗体（常用）
竞争法测抗原
• 竞争法 竞争法测抗体 • 捕获包被法测抗体 • 亲和素-生物素 ELISA法
双抗体（原）夹心法测抗体
双抗原夹心法
双抗体夹心法
*
待测抗体
*
酶标抗原
酶标抗体
4．吞噬功能测定 （1）硝基蓝四氮唑试验：硝基蓝四氮唑（NBT）是 一种水溶性的淡黄色染料。由于在杀菌过程中产生 反应性氧中间物（ROI），其中超氧阴离子（O2-） 能使被吞噬进细胞内的 NBT 还原成不溶性蓝黑色甲 臜颗粒，沉积于胞浆中，光镜下计数 NBT 阳性细胞 ，可反应中性粒细胞的吞噬功能。
（2）巨噬细胞吞噬试验：将待测巨噬细胞与某种可
被吞噬又易于计数的颗粒性物质（如鸡红细胞）混
合温育后，颗粒物质被巨噬细胞吞噬，根据吞噬百
分率即可反映巨噬细胞的吞噬能力。
三、细胞因子的检测
酶联免疫吸附试验-ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay