2015免疫学实验方法

• 免疫组化和ELISA所用到的原理大致相同，只 是因为所检测的样品不同，从而在操作方法上 有所不同。ELISA多用于定量分析，其灵敏度 非常高。 • Western Boltting 先要进行SDS-PAGE，然后 将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载 体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测 样品，可以用于定性和半定量。
或细胞毒药物；
4．培养结束后，每孔加入20微升MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育3－6小时； 5．孵育结束后，每孔加入100微升甲簪溶解液，在37℃细胞培养箱内再继续孵育， 直至在镜下观察甲簪全部溶解。通常37℃孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。 如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时 间会略长。 6. 在570nm测定吸光度。如无570nm滤光片， 560-600nm范围的滤光片均可使用。
假阴性结果。
• 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大
分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单
价抗原，因其不能形成两位点夹心 。
间接法测抗体
☆ 间接法是检测抗体最常用的方法。 ☆ 原理：利用酶标记的抗体检测已与固相结合的
受检抗体，故称为间接法。
☆ 操作步骤：
（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，
织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核 阳性。 • ELISA用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是 血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到
组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作
上 开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来 形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸 附”的含义。
（2）迟发型超敏反应（DTH）的检测：此方法为体
内检测细胞免疫功能的简便易行的皮试方法。其原
理是外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同
的抗原作皮试可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并
释放多种细胞因子，产生以单核细胞浸润为主的炎
症，局部发生充血、渗出，于24~48小时发生，72小
时达到高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反 应强烈的可发生水肿，甚至坏死。
细胞密度：
每毫升培养基中活细胞的个数=每个方块内细胞的平 均数×细胞稀释比例×104
1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 = 10-4cm3 = 10-4 ml
(二)免疫细胞功能的测定
1．T细胞功能测定
（ 1 ） T 淋巴细胞增殖试验： T 细胞受到特异性抗原
或有丝分裂原（PHA、ConA）刺激后可发生增殖，
•成败的关键因素： 组织的固定、包埋
抗体（特异性、浓度、孵育温度和时间）
非特异性抗原的封闭
内源性酶或自发荧光的消减
显色
思考：为什么有的抗体能用于冰冻切片却不能用于石蜡切片？
五、免疫印迹技术 –Western Blotting （分子生物学实验方法）
一. 蛋白质样品的提取分离
二. 蛋白质样品的定量
结果判断 • 设立实验对照:阳性对照和阴性对照
• 阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表面型
TNFR1–/–
TNFR1–/–/TNFRR2–/–
Figure 3. mTNF induces infiltration of innate immune cells and angiostasis in tumors from TNFR1–/– but not TNFR1–/–/R2–/– mice. and CD31+ (E and F) cells as indicated. G and H, for confocal microscopy analysis, tissue sections were stained with Cy3-labeled anti-CD31 for blood vessel endothelial cells (green) and the VasoTACS in situ kit to detect apoptosis (red). Arrows, apoptotic endothelial cells in the tumor.
洗涤。
（2）加稀释的受检样本，其中的特异抗体与固相抗原
结合，形成固相抗原抗体复合物，孵育洗涤。
（3）加酶标抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而
使该抗体间接地标记上酶，孵育洗涤。
（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量
。
☆间接法的特点 • 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病 的诊断。 • 间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一 酶标抗体检测相应抗体。 • 间接法成功的关键在于抗原的纯度。特别应注意 除去能与一般健康人血清发生反应的杂质。若抗 原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被 效果。
（2）巨噬细胞吞噬试验：将待测巨噬细胞与某种可
被吞噬又易于计数的颗粒性物质（如鸡红细胞）混
合温育后，颗粒物质被巨噬细胞吞噬，根据吞噬百
分率即可反映巨噬细胞的吞噬能力。
三、细胞因子的检测
酶联免疫吸附试验-ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
•基础: 抗原或抗体的固相化
用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：
双抗体夹心法测抗原（常用） • 夹心法 双抗原夹心法测抗体 • 间接法测抗体（常用）
竞争法测抗原
• 竞争法 竞争法测抗体 • 捕获包被法测抗体 • 亲和素-生物素 ELISA法
双抗体（原）夹心法测抗体
双抗原夹心法
双抗体夹心法
*
待测抗体
*
酶标抗原
酶标抗体
细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。
详细见后述
3．细胞毒试验
细胞毒实验技术是检测 CTL 、 NK 等细胞杀伤靶
细胞活性的一种细胞学技术。主要用于肿瘤免疫、
移植排斥反应和病毒感染等方面的研究。
（1）放射性核素释放法：(51Cr、125I—UdR)
51Cr
release
CTL
51Cr
labeled
可通过以下三种方法检测。
1）形态计数法
2）3H-TdR或125I-UdR掺入法
放射性元素 wash
Stimulate
Assay
3）MTT（噻唑蓝）比色法 MTT是一种可接受氢离子的淡黄色唑氮盐染料，被
活细胞线粒体呼吸链中的琥珀酸脱氢酶和细胞色素
还原，生成不溶于水的深紫色结晶产物甲簪。因此
甲簪的生成量仅与活细胞数目成正比。细胞增殖速
三. 制备SDS－PAGE胶
四. 转移电泳及免疫印迹
五. 结果分析-用Western Blot 图片灰度分析软件
imageJ或Quantity One
免疫学三大工具比较
• 免疫荧光是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和荧 光标记技术，通过荧光激发，来对组织（细胞）内抗原进行
定位、定性及定量的研究（主要是定位）。样本是细胞或组
一、抗原抗体的检测技术 免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系
列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞 因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研 究中的应用。 免疫学技术的应用极为广泛，疾病的诊断 、疗效评价及理论研究等。
二、免疫细胞的检测 对机体参与免疫应答的细胞进行鉴定,计数及功能测定 (一)细胞计数—细胞计数板 *准备细胞计数器：70%乙醇 →制备单个细胞悬液：贴壁细胞需胰酶消化 →加样 → 细胞计数： 100 倍镜下观察，“计上不计下，计 左不计右”
抗原或抗体的酶标记 * *
•用途：目标蛋白的定性或定量分析
ELISA三个必要试剂：
（1）固相的抗原或抗体，
即"免疫吸附剂"（immunosorbent）;
（2）酶标记的抗原或抗体， 称为"结合物"（conjugate）； （3）酶反应的底物。
ELISA基本的实验过程： a.包被 b.抗原抗体反应 c.酶促反应,显色 d.终止显色，读取数据。 对照和标准曲线： 阳性对照 阴性对照 定量测定：标准品制作标准曲线 待测样品的合理稀释
• 原理：根据抗原抗体反应的原理，先将已知的
抗原（抗体）标记上荧光素制成荧光标记物， 再用这种荧光标记物作为分子探针检查细胞或 组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织 中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，荧光 素受激发光的照射而发出明亮的荧光，可以看 见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗 体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量 。
ELISA与Western Blotting比较
• WB可以看到特异性的条带，但是定量比较麻烦； • ELISA可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那 得到的数值就不可信； • WB只能半定量,但是可以检测细胞膜蛋白,这点ELISA做不到； • WB所检测的一般是抗原，而ELISA抗原抗体都可以检测； • WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体 、降解产物等，一句话，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白 起作用的；而ELISA无能为力； • WB一次处理量就是一块胶版，10-20个样品最多了。ELISA一 块96孔板一次可以处理96个样本，可以设置多个复孔、对照 、梯度样等来提高检测的可信度。
4．吞噬功能测定 （1）硝基蓝四氮唑试验：硝基蓝四氮唑（NBT）是 一种水溶性的淡黄色染料。由于在杀菌过程中产生 反应性氧中间物（ROI），其中超氧阴离子（O2-） 能使被吞噬进细胞内的 NBT 还原成不溶性蓝黑色甲 臜颗粒，沉积于胞浆中，光镜下计数 NBT 阳性细胞 ，可反应中性粒细胞的吞噬功能。
Target cell CTL
Target cell
Assay Cr51 release
Target cell
（2）乳酸脱氢酶释放法：细胞受损，LDH释放，
LDH在催化乳酸生成丙酮酸的同时将NAD+还原成
NADH 。后者再通过递氢体 - 吩嗪二甲酯硫酸盐
(PMS) 还原碘硝基氯化氮唑蓝 (INT) 或硝基氯化四 氮唑蓝(NBT)形成有色的甲簪类化合物，在490nm 或570nm波长处读取的OD值，经计算即可得NK细 胞活性. （3）MTT比色分析法
ELISPOT（酶联免疫斑点法）
方法是用抗原包被固相，然后加入抗原特异性B细胞。如果 B细胞产生抗体，抗体与班上的抗原结合。加入二抗和显色 剂就会显色。一个斑点就代表一个产生抗体的细胞。
此法的主要优点是:
① 稳定、特异，且抗原用量少；
②与ELISA联合使用，可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌
，并可定源自文库测定； ③可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。
2．B细胞功能测定
B 细胞受多克隆激活剂或特异性抗原刺激后，
活化、增殖，最后分化为浆细胞，产生抗体。抗体
可以在血浆和其他体液中检出，检测抗体是测定 B
细胞功能的最主要的方法。 （1）B淋巴细胞增殖试验：LPS或PWM刺激
（2）B细胞产生抗体能力的检测：
1）ELISA检测培养上清中抗体的量。
2）ELISPOT（酶联免疫斑点法）可检测抗体分泌
四、免疫组织化学 Immunohistochemistry 原理：抗原抗体反应，抗体标记技术（荧光、酶）
用途：组织或细胞内抗原的定性和定位
流程：
免疫荧光技术（immunofluorescence ，IF）
• 定义：将免疫学方法（抗原抗体特异结合）与荧
光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内
分布的方法。
免疫学试验方法
Commonly used immunological methods
Liu Kangkang
kangll227@126.com
免疫
识别和清除抗原性异物
可能有利，也可能有害
免疫应答
免疫系统具有区别“自己”和“非己”的能力
免疫耐受
免疫学检测与免疫学技术
一、抗原抗体的检测技术 二、免疫细胞的检测 三、细胞因子的检测-ELISA 四、免疫组织化学 五、免疫印迹技术 –Western Blotting 六、 流式细胞术 七、PCR技术 八、基因沉默技术
待测抗原
包被抗原 包被抗体
Anti-HIV, Anti-HBs
HBsAg ,HCV core Ag, HBeAg,HBV preS1,PreS2
☆双抗体夹心法测抗原步骤
包被特异性抗体
洗涤
加入待测样品
孵育 洗涤
加酶标特异性抗体
孵育 洗涤
底物显色
☆双抗体夹心法测抗原特点
• 抗原浓度过高出现钩状效应（Hook effect）: 所得结果将低于实际含量，严重时甚至可出现
度越快，则甲簪生成的量越多，吸光度越高；细胞
毒性越大，则甲簪生成的量越少，吸光度越低。
MTT实验流程
1. 细胞的增殖和细胞毒实验，一般可在96孔细胞培养板中进行。 2. 每孔加入100微升细胞悬液。细胞的数量取决于实验目的和培养时间。增殖实验 每孔通常加入103个以上数量的细胞；细胞毒性实验每孔至少加入5x103个或以上数 量的细胞(具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等 因素确定)。 3. 接种的细胞按照实验需要，送入细胞培养箱进行培养。增殖实验通常要给予010微升特定的药物或生长因子进行刺激。细胞毒实验通常要给予0-10微升抑制因子