免疫组化实验方法
免疫组化实验结果分析
免疫组化实验结果分析免疫组化实验是一种常用的检测方法，用于检测组织或细胞中特定蛋白质的表达情况。
通过使用特异性抗体与待检测蛋白质结合，再通过染色或荧光技术来观察和分析结果。
本文将对免疫组化实验结果进行详细的分析和解读。
1. 实验方法本实验采用了免疫组化染色法来检测特定蛋白质的表达情况。
其中，我们选择了抗体A作为主要的检测抗体，用于对待测样本中目标蛋白质进行特异性结合。
同时，我们还使用了辅助抗体B，用于与抗体A结合并提供染色或荧光信号。
2. 样本来源本实验使用的样本来自于XXX组织/细胞，这是一个重要的背景信息。
样本的来源可能对结果的解读产生一定的影响，因此需要在结果分析时进行综合考虑。
3. 实验结果分析3.1 强阳性表达强阳性表达表示目标蛋白质在待测组织/细胞中高度表达。
在免疫组化染色结果中，强阳性表达通常呈现出深色的染色信号或明亮的荧光信号。
强阳性表达可能具有以下几个意义：3.1.1 与生理功能相关某些蛋白质的强阳性表达可能与特定的生理功能相关。
例如，在肿瘤标记物的检测中，强阳性表达可能意味着该蛋白质与肿瘤发生发展密切相关。
3.1.2 指示疾病状态在疾病的诊断中，某些蛋白质的强阳性表达可能成为判断疾病的重要指标。
例如，在乳腺癌的诊断中，HER2/neu蛋白的强阳性表达是肿瘤治疗策略选择的重要依据。
3.2 弱阳性表达弱阳性表达表示目标蛋白质在待测组织/细胞中低度表达。
在免疫组化染色结果中，弱阳性表达通常呈现出浅色的染色信号或弱荧光信号。
3.2.1 可能存在变异弱阳性表达可能意味着目标蛋白质表达量较低，但仍存在。
这可能与样本来源、疾病进展阶段或其他因素相关。
3.2.2 值得进一步研究虽然弱阳性表达表明目标蛋白质的表达水平较低，但仍值得进一步研究其在特定生理或病理过程中的作用和意义。
4. 阴性表达阴性表达表示目标蛋白质在待测组织/细胞中未被检测到。
在免疫组化染色结果中，阴性表达通常呈现出无染色信号或荧光信号。
免疫组化实验步骤
1.PBS冲洗5min×3次
2.加修复液，低温加热10min/高温2min
3.室温冷却10min
4.PBS冲洗5min×3次，用滤纸吸干PBS
5.滴加试剂A（封闭用正常山羊血清工作液），湿盒内室温孵育15min
6.一抗稀释
预实验：Anti-MGMT 1:100 1:200 1:400
Anti-XRCC1 1:100 1:200 1:400
Anti-P53 1:50 1:100 1:200
正式试验：Anti- MGMT 1:400
Anti-XRCC1 1:400
Anti- P53 1:100
7.滴加上述稀释好的一抗，4℃过夜
8.滴加二抗试剂B（生物素标记山羊抗兔IgG），室温孵育20min
9.PBS冲洗3min×3次，用滤纸吸干PBS
10.滴加试剂C（辣根酶标记链酶卵白素），室温孵育20min
11.PBS冲洗3min×3次，用滤纸吸干PBS
12.DBA显色，在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液。
13.自来水冲洗10min
14.苏木素复染
15.自来充分水冲洗，蒸馏水浸泡2min
16.酒精梯度脱水3min×7次
17.透明，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min
18.树胶封片，80℃烤箱烤干。
HE染色
1.苏木素染色10min，自来水充分冲洗。
2.伊红染色2min，自来水充分冲洗
3.酒精梯度脱水3min×7次
4.透明，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min
5.树胶封片，80℃烤箱烤干。
免疫组化实验步骤完整版
免疫组化实验步骤完整版步骤1：标本采集和固定首先，需要从待检测样本中采集组织或细胞。
可以使用手术切片、活体组织、培养的细胞等作为标本。
然后，将采集的样本固定在载玻片或切片上，以保持其结构和形态的完整性。
步骤2：抗原暴露和体细胞抗原消除接下来，需要处理标本以使抗原裸露出来，并消除非特异性的抗体结合和细胞膜结合的抗原。
这一步骤常常涉及对组织或细胞的预处理，例如用石蜡脱脂、酶解抗体和孵化等。
步骤3：抗体特异性结合选择特异性的抗体用于检测待测蛋白质。
这些抗体可以是直接标记的一抗，或间接标记的二抗。
一抗是专门与目标抗原结合的抗体，而二抗则可以与一抗结合，以提高信号的灵敏度和特异性。
这一步骤中还需要选择适当的阴性对照，即未携带待检测抗原的样本。
步骤4：探针检测根据需要，可以使用不同的探针来检测目标分子。
常用的探针有标记的一抗、荧光探针、放射性标记物等。
标记的一抗可以直接结合抗原，然后使用染色剂进行可视化；荧光探针则通过荧光显微镜进行检测；放射性标记物可以通过放射自显影等方法进行检测。
步骤5：显色和对比计数将荧光、酶标记或放射性标记的物质显色，以便于检测和计数。
在染色的过程中，需要防止非特异性的染色，例如使用阻断剂、胶原等。
步骤6：结果分析根据观察到的染色强度、分布模式等结果，分析待测蛋白质在样本中的表达情况。
这可能需要与阴性对照和阳性对照进行比较，以确定实验结果的可靠性。
步骤7：图像捕获和分析使用显微镜或其他成像设备，将荧光、染色或放射性标记的图像捕获下来。
可以使用图像分析软件来计算和比较样本中的染色强度、面积等参数。
步骤8：数据统计和结果报告根据实验结果进行数据统计和分析，并将结果记录在报告中。
报告应包括样本信息、实验方法、结果和结论等内容，并根据需要进行解释和讨论。
总结：免疫组化实验是一种广泛应用于研究、诊断和治疗的方法。
它的步骤包括标本采集和固定、抗原暴露和体细胞抗原消除、抗体特异性结合、探针检测、显色和对比计数、结果分析、图像捕获和分析、数据统计和结果报告。
免疫组化(IHC)实验具体步骤及说明
免疫组化（IHC）实验具体步骤及说明一、试剂和溶液乙醇: 无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇抗原修复液: 0.01M 的柠檬酸钠缓冲液：58.82g 柠檬酸三钠及7.56g 柠檬酸溶于200ml 纯水，调pH 至6.0，纯水1:100 稀释为工作液3%过氧化氢-甲醇: 30%的过氧化氢与无水甲醇1:9 稀释10X PBS: 80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L 纯水，调pH 至7.4 洗涤液: 1×PBS：纯水稀释10× PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS（1×PBST）super block，生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent 二抗，酶标亲和素UltraTek HRP，DAB 显色试剂盒：Cat. KT1002a 抗体稀释液：3%BSA-PBS 0.5%盐酸-乙醇：0.5～1%盐酸，95.0-95.5%乙醇苏木素：苏木精2g 溶于250ml 无水乙醇，十六水合硫酸铝17.6g 溶与750ml 纯水，以上溶液充分混合，加入碘酸钠0.2g 和冰醋酸20ml二、实验步骤1.组织固定：烘箱温度65-75℃ 30min 或者65℃过夜；2.脱蜡：二甲苯浸泡三次，每次10 分钟；3.水化：依次经过无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡，每次5min；4.洗涤：自来水冲洗1 次，PBS 浸泡3min；5.抗原修复：放入稀释100 倍的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0) 中，高压锅煮沸10min，常温冷却30min；6.洗涤：纯水浸泡2 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；7.灭活酶：室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min；8.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；9.封闭：加入适当体积的super block（KT1002a Reagent A），37℃温箱孵育5min；10.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；11.一抗：加入反应体积为0.15ml，适合浓度的一抗, 37℃ 湿盒孵育60min。
细胞免疫组化实验步骤
细胞免疫组化实验步骤细胞免疫组化实验步骤：1）脱蜡与水化：将石蜡切片放置于60°烤箱烤片30-60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固地贴在玻片上。
而后依次将其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各2min，水洗5min（不要直接对着切片冲洗）。
PBS洗3次，3 min/次。
2）细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液（40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸润切片30min（RT 避光），降低内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3次，3 min/次。
3）抗原修复：由于制作石蜡切片时，甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性，这一步就是让胞内的抗原决定簇重新“满血复活”。
这里常用微波修复，pH 6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火4min至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复2次，每次补足液体以免干片。
（当然有的朋友用酶修复法也是可以的）。
PBS洗3次，3 min/次。
4）血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。
此时可用“祖传”的油性笔围绕组织画圈，并对圈内的组织滴加稀释好的血清，37℃温箱中30min,用滤纸吸去多余的血清。
5）孵育一抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的一抗20ul，4℃过夜或者37℃1-2h。
PBS洗3次，3 min/次。
（一般4℃过夜后，需要将切片放置37℃复温45min，防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定）6）孵育二抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的二抗20ul，37℃1-2h，PBS洗3次，3 min/次。
7）切片显色：用DAB-H2O2显色10min，显色液最好是现用现配，此时要通过显微镜观察染色是否明显，10min内即可用蒸馏水终止显色。
8）复染及封片：为了形成细胞轮廓，更好的定位目标蛋白，可用Mayer苏木素染色30s，水洗，盐酸酒精分化2s，流水浸入15min。
免疫组化实验操作方法
免疫组化步骤：一．标本脱蜡及水化1.90℃恒温烘箱孵育半小时。
（或者60℃恒温烘箱孵育2h或过夜）（目的：使蜡块融化）2.依次放入二甲苯I,II各处理20min。
（目的：脱蜡）3.按不同的酒精浓度（100%，90%，80%，70%）（610室 100%，95%，80%，75%）分别水化10min。
（目的：洗去石蜡，然后一遍一遍置换高浓度的酒精）4.蒸馏水洗涤5min×2次。
（目的：洗去酒精）5.PBS缓冲液洗涤5min×2次。
二．标本抗原修复及封闭1.取出切片，放置于3%的过氧化氢槽中（30%过氧化氢30ml 加蒸馏水到300ml，即稀释10倍），室温孵育15min。
（目的：脱去内源性过氧化物酶）2.PBS缓冲液洗涤5min×2次。
（目的：洗去过氧化氢）3.取出标本，加入95℃~100℃预热抗原修复液（柠檬酸抗原修复液，PH 6.0）中低火、微波15min。
（抗原修复液先加热至100℃沸腾，然后微波炉调至解冻档，即差不多95℃~100℃。
目的：打开键，利于之后的抗原抗体反应）4.自然冷却至室温。
（或者放在冰水里冷却，速度较快）5.PBS缓冲液洗涤3min×3。
6.取出切片，擦干切片组织周围的液体，放置于湿盒中，标本加入羊血清（5%~10%），每张片子约50ul（30ul~50ul不等，即覆盖组织即可），室温孵育30min。
（此步骤为封闭）（SUPER PAP PEN在组织周围画圈，即可防止羊血清外溢）三．抗体加入及显色1.将切片上的液体甩干，滴加入50ul一抗工作液于组织上，于4℃冰箱中过夜（一般8~10小时，时间过一些问题也不大）。
（或者37℃恒温箱中孵育2h）2.将切片上的液体甩干，放置PBS缓冲液中洗涤3~5min×3~5次。
（时间可以短一些，但多洗涤几次）3.将切片上的液体甩干，加入二抗（每张片子约30ul~50ul，覆盖组织即可）室温下孵育30min。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。
2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。
步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。
2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。
3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。
步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。
2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。
步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。
抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。
2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。
孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。
步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。
2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。
步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。
2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。
步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。
常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。
2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。
步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。
2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。
步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。
2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。
这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。
免疫组化实验方法
免疫组化实验方法免疫组化（Immunohistochemistry，简称IHC）是一种利用特异性抗体与组织或细胞特定抗原结合的方法，以此可以检测细胞或组织中蛋白质的表达和分布情况。
IHC技术已广泛应用于病理学、癌症诊断、生物医学研究等领域。
以下是免疫组化实验的常用方法：1.样本处理：通常以石蜡包埋切片作为实验样本。
首先，从固定的组织或细胞中取得标本，然后进行脱水、透明化和浸蜡等处理。
接下来，使用切片机将组织或细胞切割成厚度为3-5μm的切片。
2.抗原恢复：由于样本的固定和包埋可能导致抗原的损伤，因此需要对切片进行抗原恢复处理。
常见的抗原恢复方法包括热处理、酶解法和酸性水解法。
热处理是将切片置于缓冲液中，在高温下进行退火。
酶解法是使用胰蛋白酶等酶对切片进行消化。
酸性水解法则使用盐酸或酶进行酸性处理。
3.抗体结合：选择特异性的一抗体与目标抗原结合。
一抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以经商业采购或自家制备。
将一抗体加入待检测切片上，让其与目标抗原结合。
4. 第二抗体结合：待检测切片上结合了一抗体的抗原后，需要添加第二抗体与一抗体结合。
第二抗体通常是反相应物免疫球蛋白（Secondary Antibody），如反人IgG，反兔IgG等。
第二抗体上常会标记有发光物质、酶标记物或荧光染料，用于可视化结果。
5.可视化和显色：根据选择的第二抗体，可以选择显色方法。
例如，辣根过氧化物酶（HRP）结合的第二抗体可以使用3,3'-二氨基联苯思（DAB）作为底物，呈棕色或棕黄色；荧光标记的第二抗体可以用荧光显微镜进行观察。
6.伪染色：为了辅助观察和识别目标组织或细胞，可以进行伪染色。
常见的伪染色方法有对比染色、核染色和细胞质染色等。
7.阴性对照和阳性对照：为了确保实验结果的准确性和可靠性，同时进行阴性对照和阳性对照实验。
阴性对照是在实验中将第一抗体替换为非特异性抗体或缺少抗体的处理组织或细胞组织；阳性对照是在实验中使用已知表达目标蛋白的组织或细胞进行处理。
免疫组化鉴定菌种的方法
免疫组化鉴定菌种的方法免疫组化是一种常用的实验技术，用于鉴定菌种和研究细胞和组织之间的相互作用。
该技术基于免疫学原理，通过特异性抗体与靶分子结合来检测菌种的存在和特有的生物学功能。
本文将介绍免疫组化鉴定菌种的原理和常见的实验方法。
一、免疫组化原理免疫组化利用抗体与其特异性蛋白质抗原结合的特性，通过荧光染料或酶标记来检测目标分子的存在。
该技术主要包括以下几个步骤：1.样品处理：菌株或细胞培养液通常需要经过固定、包埋或脱水等处理，以保持其形态和结构的完整性。
2.抗体孵育：将标记有特异性抗体的荧光染料或酶标记与待检测的样品接触，使其与目标抗原结合。
3.清洗：将未结合的抗体去除，以减少非特异性背景信号。
4.信号检测：通过荧光显微镜或酶标测定，观察目标分子的位置和表达水平。
二、免疫组化实验方法1.免疫组化染色法免疫组化染色法是一种常用的实验方法，用于在细胞和组织中检测特定抗原的分布和表达。
该方法可分为直接法和间接法：直接法：将已标记的抗原直接与待检测的组织或细胞接触，然后观察染色结果。
这种方法操作简单、快速，但特异性较差，主要适用于已知抗原的情况。
间接法：通过与辅助抗体结合来增强染色信号的强度和特异性。
首先将待检测样品孵育于特异性抗原的抗体中，然后孵育与特异性抗体结合的辅助抗体，最后使用荧光染料或酶标记的二抗进行检测。
该方法灵敏度高，适用于未知抗原的情况。
2.免疫组化电镜法免疫组化电镜法结合了免疫组化和电子显微镜技术，可用于检测细胞和组织中微小结构的特异性抗原。
该方法主要分为直接法和间接法：直接法：直接将标记有特异性抗体的金或其他金属胶体颗粒与待检测的组织或细胞接触，观察金颗粒在电镜下的位置。
间接法：与免疫组化染色法类似，通过辅助抗体结合来增强信号强度和特异性。
在免疫反应后，使用标记有金或其他金属胶体颗粒的二抗进行检测。
3.免疫组化流式细胞术免疫组化流式细胞术常用于检测细胞表面或细胞内特异的蛋白质抗原。
该方法主要分为两种：直接流式细胞术：将标记有荧光染料的特异性抗体与待检测细胞接触，然后通过流式细胞仪测定细胞的荧光强度和受体数目。
蛋白实验技术——免疫组化实验步骤
蛋白实验技术——免疫组化实验步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉。
2. 水浴锅。
（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB，ph6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226；2H2O，用10mmol/L NaOH调至ph8.0，加水至1000ml。
4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris 碱，用1N的HCl调至ph8.0，加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS（PBS）配制。
8．TBS/PBS PH9.0–9.5，适用于荧光纤维镜标本；ph7.0-7.4适合光学纤维标本。
（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复：在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
免疫组化实验原理及其步骤
免疫组化实验原理及其步骤嘿，大家好，今天我们要聊聊一个超级有趣的实验——免疫组化实验。
你可能会想：“这是什么鬼？”别担心，咱们用最简单的话把它讲明白。
免疫组化实验，听名字就知道，这和免疫系统以及化学反应有点关系。
说白了，它就是用来检测我们身体里特定的蛋白质的工具。
没错，就是那个神奇的、能让我们知道某种蛋白质在不在，或者它的分布在哪里的实验。
那么，如何一步一步搞定这个实验呢？跟我来，我们从头到尾聊一聊！1. 实验准备工作1.1 选定目标蛋白质首先，我们得知道我们想找什么蛋白质。
是不是想要了解细胞里某种蛋白质的分布？那我们得选择一个合适的抗体。
抗体就像是我们实验中的侦探，它们专门找那些蛋白质。
就像你找某个人要用手机上的定位功能，这些抗体就是那种“定位器”。
1.2 准备样品样品嘛，就是你要研究的东西。
比如你要研究的可能是人体组织切片。
你得把这些组织样品切得很薄，就像切西瓜一样，薄薄的一片，才容易观察。
切片之后，还要把它们放到玻璃片上，搞成一个个“小故事”。
2. 实验步骤2.1 固定和包埋好，准备工作做好后，我们就开始实验了。
首先得把样品固定住，不让它们跑来跑去。
这一步叫做“固定”。
用化学药品把组织里的蛋白质固定住，就像给它们穿上了防护服。
然后，我们还得把这些样品“包埋”在一种特殊的材料里，这样在切片时才不容易碎。
2.2 脱蜡和重水化包埋后的样品通常会用蜡包裹起来。
为了能继续实验，我们需要先把蜡去掉。
这一步叫做“脱蜡”。
然后，我们再用水把样品重水化，这样蛋白质就能在液体中恢复原样。
2.3 封闭和染色脱了蜡的样品，还要用一种封闭剂封闭一下。
这个步骤很重要，因为封闭剂能防止抗体跟样品中的其他成分“亲密接触”，影响实验结果。
接着，我们就可以加入“抗体”了。
抗体会专门找出我们想要的目标蛋白质，就像玩寻宝游戏，找到它们就行了。
然后，用染色剂把目标蛋白质染成颜色，这样我们在显微镜下才能看到。
2.4 显微观察好了，最后一步就到了。
免疫组化法实验操作步骤
免疫组化法实验操作步骤免疫组织化学(Immunohistochemistry, IHC)是一种利用抗体与组织中的抗原特异性结合的技术。
它是一种重要的研究方法，可以用于检测和定位组织中的特定蛋白质和其他生化分子。
以下是免疫组织化学实验的一般操作步骤：1.样本处理：a.固定：将待检测的组织样本进行固定处理，以保持其形态结构并保留组织内的抗原。
b.切片：将固定的组织样本切成非常薄的切片（通常为3-5微米厚），并将其放置在载玻片上。
2.抗原解蓝（抗原恢复）：a.对于不同类型的组织样本，选择适当的抗原解蓝方法。
b.抗原解蓝可以通过加热、酶解或其他方法来恢复组织样本中的抗原。
3.阻断非特异性结合：a. 使用一种非特异性的蛋白质来阻断载玻片上未特异性结合的位点，例如牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)或小鼠免疫球蛋白(Mouse IgG)。
b.加入适当浓度的阻断剂，并孵育片玻片上的切片，以阻断非特异性结合位点。
4.主抗体孵育：a.加入含有特定抗原的主抗体溶液，其可以与组织样本中特定的抗原结合。
b.孵育片玻片上的切片，使主抗体与待检测的抗原结合。
5.洗涤：a.用缓冲液或PBS等洗涤溶液洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的主抗体。
6.二抗孵育：b.孵育片玻片上的切片，使辅助抗体与主抗体结合。
7.洗涤：a.再次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的辅助抗体。
8.信号放大：a.可根据需要，使用染色剂或底物来增强或显色识别待检测抗原的结合位置。
b.例如，使用荧光染料或酶底物，通过显微镜观察或光镜观察，可使抗原可视化。
9.洗涤：a.最后一次用缓冲液或PBS洗涤载玻片上的切片，以去除未结合的染色剂或底物。
10.封片：a.加入适当的封片剂，如富含丙酮的溶液，将载玻片上的切片封装起来，以保护切片和保存染色结果。
免疫组织化学是一种复杂的实验技术，需要仔细的操作和精确的控制条件才能得到准确的结果。
免疫组化的实验步骤
1. 取出常规石蜡切片，烘干后进行脱蜡和水化处理，以获取未变性的蛋白质分子。
2. 进行抗原修复，即在高温高压条件下，打破样本蛋白的交联修复，以使蛋白分子能够更好的与特异性抗体结合。
3. 加去离子水或1% Triton X-100（具有破坏细胞膜的作用）进行细胞膜穿透或细胞膜破裂，以方便抗体进入细胞内。
4. 加适当浓度的特异性抗体，第一抗体，一般是一支针对特定抗原（蛋白质、组织细胞等）的多克隆或单克隆抗体。
5. 洗脱，去除未结合的第一抗体，保留与抗原特异性结合的抗体和抗原复合物。
6. 加入第二抗体，与第一抗体结合的二抗，如亲和力较强的羊抗人IgG的HRP 标记二抗，并进行标记。
7. 洗脱，去除未结合的第二抗体。
8. 加入特定的底物，如DAB素，检测相应的表达信号。
免疫组化实验步骤、常见问题及解决方案
免疫组化实验步骤、常见问题及解决方案免疫组化实验虽然看上去非常简单，然而做起来却容易“花样百出”，让实验人员的精神备受摧残。
因此，今天小编在这里跟大家详细介绍一下免疫组化实验的步骤以及常见问题和解决方案，让大家的免疫组化实验更加顺畅。
免疫组化实验主要包括石蜡切片的免疫组化技术(IHC-P)和冰冻切片的免疫组化技术(IHC-F)，今天主要讲的是IHC-P。
实验步骤详解：1，取材颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取所需的组织，切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透。
注意取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化，切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。
2，切片制备(1)固定将切好的组织(<5mm3)用生理盐水组织洗一下，立即投入4%多聚甲醛(PFA)或10%中性福尔马林(NBF)中固定，根据组织大小和松密程度室温4-48h。
若取材是小鼠大脑或神经组织，可以采用灌流的方式进行固定。
(2)洗涤材料经固定后,水或酒精(若采用含有苦味酸的固定剂bouin，就用酒精洗涤)冲洗，数小时或过夜，目的是去除组织内固定液及结晶沉淀。
(3)脱水目的是因为透明剂多是苯类，苯和水不互溶，用到的材料是酒精，将组织依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。
(4)透明由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。
当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。
一般是用纯酒精、二甲苯等量混合液浸润材料1-2h，再换纯透明剂(二甲苯、苯、氯仿、正丁醇)。
(5)浸蜡和包埋透蜡的目的是除去组织中的透明剂(如二甲苯等)，使石蜡渗浸到组织内部达到饱和程度以便包埋。
先放入二甲苯和石蜡各半的混合液，再放入熔化的石蜡中浸润，透蜡时间根据组织大小而定。
浸蜡之后放入包埋盒用石蜡进行包埋。
免疫组化实验步骤及配方
免疫组化实验步骤及配方免疫组化实验是一种用于检测和定位特定蛋白质在细胞、组织或器官中表达的技术。
免疫组化实验包括一系列步骤，如抗原修复、非特异性结合抑制、免疫原和次级抗体处理、显色/荧光染色等。
下面将详细介绍免疫组化实验的步骤及配方。
1.抗原修复：抗原修复是为了恢复因组织固定而引起的抗原性损失。
一般使用高温或酶解方法进行抗原修复。
-高温方法：将组织切片置于高温缓冲液中加热，一般在95°C下加热15-20分钟。
-酶解方法：如胰酶消化、蛋白酶消化等。
例如，可以使用0.1%胰酶在37°C下进行酶解。
2.非特异性结合抑制：非特异性结合抑制是为了防止免疫试剂（如次级抗体）与非特异性蛋白结合，从而降低假阳性结果。
一般使用正常动物血清或胶体等进行非特异性结合抑制。
-正常动物血清：根据动物源种类（如小鼠、兔子等）选择相应的正常动物血清。
-胶体：如牛血清蛋白、牛血清白蛋白等。
可以在最终稀释液中加入1-2%的胶体。
3.免疫原处理：免疫原处理是为了增强目标抗原与抗体的结合效率，一般通过与次级抗体或酵素结合。
根据具体实验需求，可以选择荧光标记、酶标记或金标记等不同的方式进行免疫原处理。
-荧光标记：如荧光素等。
-酶标记：如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
-金标记：如胶体金、纳米金等。
4.次级抗体处理：次级抗体处理是为了增强免疫原与目标抗原之间的结合效应。
一般使用来自其他物种的抗体作为次级抗体。
根据不同实验需求，可以选择与荧光标记、酶标记或金标记结合的次级抗体。
-荧光标记：如青蒿素标记的抗兔荧光标记抗体等。
-酶标记：如HRP标记抗体、AP标记抗体等。
-金标记：如碳标记抗体、金标记抗体等。
5.显色/荧光染色：显色/荧光染色是为了可视化目标抗原的分布和定位。
根据不同的免疫标记试剂，可以选择适当的染色方法。
-显色：如DAB（3,3'-二氨基联苯）染色。
-荧光染色：根据使用的荧光标记试剂选择相应的染色方法，如DAPI 染色、FITC染色等。
免疫组化EnVision 两步法的实验步骤
免疫组化EnVision 两步法的实验步骤免疫组化（Elivison二步法）（1）石蜡切片置于67℃烘箱中，烘片2小时，脱蜡至水，用pH7.4的PBS冲洗三次，每次3分钟（3×3’）。
（2）取一定量pH=6.0柠檬酸盐缓冲液，加入微波盒中，微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档微波处理10分钟，取出微波盒流水自然泠却，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用PBS冲洗2×3’。
(注：不是所有的抗体都需要微波修复的，视具体情况而定)（3）每张切片加1滴3% H2O2，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS 冲洗3×3’。
（4）除去PBS液，每张切片加1滴相应的第一抗体（相应稀释倍数），室温下孵育2小时。
（5）PBS冲洗3×5’。
除去PBS液，每张切片加1滴聚合物增强剂（试剂A），室温下孵育20分钟。
PBS冲洗3×3’。
（6）除去PBS液，每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物（试剂B），室温下孵育30分钟。
PBS 冲洗3×5’（7）除去PBS液，每张切片加1滴新鲜配制的DAB液，显微镜下观察5分钟。
（8）苏木素复染，0.1%HCl分化，自来水冲洗，蓝化，切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，晾干后观察。
注：即用型第二代免疫组化Elivision plus广谱试剂盒，购自福州脉新生物技术开发有限公司。
包括：生物素化抗兔二抗、亲和素（Reagent A）、生物素－辣根过氧化物酶（Reagent B）、二氨基联苯胺（DAB）免疫组织化学工作流程1 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(PH7.4)冲洗三次，每次5分钟。
PBS配制（2000ml）PH7.4氯化钠：17g磷酸二氢钠：0.4g磷酸氢二钠：6.3g2 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
我科采用压力锅进行抗原修复，取一定量的修复液于压力锅中，加热至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续加热至喷气，从喷气开始计时，2分钟后，压力锅离开热源，冷却至室温（也可以稍冷后，在自来水龙头下加速冷却）。
免疫组化方法
免疫组化方法
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测组织或细胞中特定蛋白质
的表达和定位。
其基本原理是利用特异性抗体与目标蛋白质结合，再通过
染色或荧光标记等方法来检测抗体与蛋白质的结合情况。
免疫组化方法主
要包括以下几个步骤：1.样品制备：将组织或细胞样品固定、切片或涂片
等处理，以便于后续的抗体结合和检测。
2.抗原修复：对于某些抗原易于
失活或难以检测的样品，需要进行抗原修复处理，如加热、酶解等，以恢
复抗原的结构和活性。
3.抗体结合：将特异性抗体加入样品中，与目标蛋
白质结合形成免疫复合物。
抗体可以是单克隆或多克隆，也可以是直接标
记或间接标记的。
4.洗涤：用缓冲液洗涤样品，去除未结合的抗体和杂质，以减少假阳性的干扰。
5.检测标记：将荧光标记、酶标记或金标记等标记
物加入样品中，与免疫复合物结合，以便于检测和定位。
6.显色或荧光：
通过染色或荧光显微镜等设备，观察样品中的免疫复合物的分布和定位，
以确定目标蛋白质的表达和定位情况。
总之，免疫组化方法是一种高灵敏度、高特异性的实验技术，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和药物开
发等领域。
免疫组化实验步骤及配方
免疫组化步骤1.多聚甲醛灌流取材,多聚甲醛后固定,30%多聚糖溶液沉糖;2.冰冻切片1d-14d 脊髓>=20μm;14d-28d>=10μm;DRG d=10μm3.0.01M PBS洗 10min×3次;4.1N HCL 暴露抗原 30min；5.去离子水洗,0.01M PBST洗 10min×3次；6.3%双氧水0.01M PBS配制洗10min,灭活内源性HRP；7.0.01M PBST洗 10min×3次；8.5%-10%血清封闭30min0.01M PBST 配制；9.一抗过夜,一抗用PBST稀释；10. 0.01M PBS洗 10min×3次,二抗3孵育小时；11. 0.01M PBS洗 10min×3次,HRP-亲和素3小时；12. 0.01M PBS洗 10min×3次,DAB显色 12-18min;免疫组化常用试剂配制1. 0.1M PB: 14.5g Na2HPO4·12H2O500mL H2ONaH2PO4·2H2O2. 0.1M PBS : 500mL 0.1M PB 45g NaCl3. 0.01M PBST: 100mL 0.01M PBS 10滴 Triton X-1004. IN HCL: 盐酸：水=1：105. 4%多聚甲醛： 13.6g KH2PO43.6g NaOH40g 多聚甲醛1000mL H2O注：1. 需要60°C加热溶解,过滤使用；2.多聚甲醛每次比需要多称10g,以弥补后面过滤的损失；3.现将多聚甲醛溶于1000mL水中,然后一边加热搅拌一边缓慢加入多聚甲醛的助溶剂NaOH,待NaOH和多聚甲醛都完全溶解后再加入KH2PO4,溶后过滤备用;液：以0..1M PB配制,DAB浓度%,H2O2浓度%;注：1. H2O2临用时再加；2.用DAB染后用0.01M PB洗;7. 30%蔗糖： 150g 蔗糖500mL 4%多聚甲醛注：可同时沉糖后固定;8.封闭液：10%山羊血清做免疫荧光时另加%BSA;。
免疫组化实验报告
免疫组化实验报告免疫组化实验报告免疫组化实验是一种常用于生物医学研究领域的技术，它通过利用抗体与特定抗原的结合来检测和定位细胞或组织中的特定蛋白质。
本次实验旨在探究免疫组化实验的原理、步骤以及在疾病诊断和治疗中的应用。
一、实验原理免疫组化实验基于免疫学的原理，即利用机体免疫系统产生的抗体与特定抗原结合的特异性。
在实验中，首先需要制备特定抗原的抗体，通常通过免疫动物（如小鼠）注射抗原，使其产生特异性抗体。
然后，将这些抗体与待检测的细胞或组织样本进行反应，通过标记抗体的方法来检测和定位特定蛋白质。
二、实验步骤1. 细胞或组织的固定和切片：首先，将待检测的细胞或组织样本固定在载玻片上，常用的固定剂有甲醛、乙醛等。
然后，将固定的样本进行切片处理，通常使用微型切片机或手工切片刀进行切片。
2. 抗体的制备和标记：制备特定抗原的抗体是实验的关键步骤之一。
通常，将抗原注射到小鼠等免疫动物体内，使其产生特异性抗体。
然后，从免疫动物的血清中提取抗体。
为了方便检测和定位，可以将这些抗体标记上荧光染料或酶等物质。
3. 抗体与样本的反应：将标记好的抗体与待检测的细胞或组织样本进行反应，使抗体与特定蛋白质结合。
这一步通常需要在适当的温度和时间条件下进行，以确保反应的充分和特异性。
4. 反应产物的可视化：根据抗体标记的方式不同，可采用不同的方法来可视化反应产物。
如果是标记了荧光染料的抗体，可以使用荧光显微镜观察样本；如果是标记了酶的抗体，可以使用底物与酶的反应产生颜色变化，再通过显微镜观察。
三、实验应用免疫组化实验在疾病诊断和治疗中具有广泛的应用价值。
例如，在肿瘤学中，通过检测肿瘤标志物的表达情况，可以帮助医生确定肿瘤的类型、分级和预后。
此外，免疫组化实验还可用于研究疾病的发生机制、筛选新的治疗靶点以及评估药物疗效。
在临床诊断中，免疫组化实验也发挥着重要的作用。
例如，通过检测心肌标志物的表达情况，可以帮助医生判断心肌梗死的程度和范围。
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（1）醛类固定剂：穿透性较强，收缩性小，是常用的固定剂。如10％中 性福尔马林液、4％多聚甲醛缓冲液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液 等。
（2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚 甲醛混合使用。
（3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分 子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使 用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
2．四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyante，TRITC）紫红色粉未，较稳定，最大吸收 光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC 发射的黄绿色荧光对比鲜明。
3．四乙基罗丹明（tetraethylrhodamine B 200，RB200） 褐红色粉未，最大吸收光谱570 nm，最大发射光谱596～ 600nm，呈橙红色荧光。价廉。
（6）温度和时间：较高的反应温度（37℃）可加速抗原抗体结合反应， 低温有利于抗原抗体结合率的提高
（7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。 选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇
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10
荧光素
1，异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC） 黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，最大吸收光谱为490～ 495 nm，最大发射光谱为520～530 nm，呈现明亮的黄绿 色荧光。最常用。
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3
免疫组化实验标本
• 组织标本（石蜡切片和冰冻切片） • 细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂
片）。 • 石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连
续切片，有利于各种染色对照观察；还能 长期存档；
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4
细胞和组织的固定
1．固定的作用--使细胞内蛋白质凝固、终止或抑制外源性和内源性酶
活性，最大限度地保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非 水溶性抗原，防止抗原弥散。
• ABC-HRP 辣根过氧化物酶：最通用的系统，使用范围广
• ABC-AP 碱性磷酸酶：灵敏度比较高，染色密度较低
• ABC-GO 葡萄糖氧化酶：灵敏度较低，适用于组织内源性 HRP或者AP含量比较高的组织，常与HRP或者AP系统配合进 行双染
③ 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对 比鲜明，能清晰判断结果。
④ 结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性 质和生化性质无影响，用于活体内标记， 结合物应无毒，附加抗原性小。
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7
常用的染色方法
• 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫 酶标法，亲和组织化学法
• 按标记物定位于抗原所在部位的手段，则 可将免疫细胞组织化学染色方法分为直接 法（一步法）、间接法（二步法）、桥连 法等。每进行一步结合反应。都会产生一 次阳性结果的放大效应。敏感性由高到低 依次为桥连法、间接法、直接法。
3．常用的固定方法--浸入法和灌注法（适用于动物实验研究）
组织新鲜 勿干燥 精体选积ppt 适中 固定液足够（>20倍） 5
抗体
常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
特性比较：
1. 均一性
2. 稳定性
3. 特异性
4. 重复性
5. 沉淀反应
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荧光素标记抗体
能够产生荧光并能作为染料的化合物称 为荧光色素。必备条件:
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8
染色的基本程序
①标记抗体与标本中抗原反应结合； ②用缓冲液洗去未结合的成分； ③直接观察结果；或显色后再用显微镜观察。
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9
反应条件
抗原抗体结合属于可逆性反应，具有共性的反应条件：
（1）PH：中性及弱硷性条件（PH 7～8）有利于免疫复合物的形成
（2）离子强度：0.01～0.02 M的低离于强度有利于免疫复合物的形成
（3）去污剂：有利于复合物的形成，常用的非离子型去污剂有吐温-20， EDTA（0.01%），Triton X-100（0.1～1%）
（4）抗体稀释液中蛋白质浓度：稀释液中含无关蛋白质可以减少抗体的 非特异吸附，常用牛血清白蛋白
（5）防腐剂：微生物生长会干扰抗原抗体反应，稀释液和抗体液中加入 适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐
免疫组化实验方法
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1
免疫组织化学的概念
利用抗原与抗体特异性结合的原理，通 过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、 酶、金属离子、同位素）显色来确定组织 细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行 定位、定性及定量的研究，称为免疫组织 化学。
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2
最突出的优点
• 在更广阔的范围内，把结构与功能及代谢 结合起来，在微观世界原位地确定组织及 细胞结构的化学成分，达到方法统一，定 性可靠，定位准确，定量可能。
（6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻 融次数。
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酶标抗体法
• 通过共价键将酶结合在抗体上制成酶标抗体， 再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的 不溶性产物，于显微镜下进行细胞或组织表面 或内部某种抗原成分定位观察。
• 常用的酶--辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷 酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。
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染色注意事项
（1）在湿盒内进行，以免标本上的试剂干燥。
（2）酸碱度以接近体液环境为宜（PH 7.4左右）
（3）组织细胞要求新鲜，最好使用冷冻切片，固定 存档标本要求组织结构完好。
（4）切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4℃ 冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30％。
（5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景 非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验 摸索，找出最佳稀释度。
• 优点：与免疫荧光技术相比，终产物可在普通 光镜下观察，切片能够长久保存，经锇酸处理 后，电子密度增强，可用于电镜观察。
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抗生物素-生物素-过氧化物酶技术 (avidin-biotin peroxidase complex
ABC)
• 原理：利用抗生物素分别连接生物素标记的第2抗体和生 物素标记的酶。其第1抗体不为标记物所标记，生物素标 记的第2抗体与ABC复合物相连接。ABC复合物是将过氧化 物酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化物酶连接物与 过量的抗生物素蛋白反应而制备的。常用：