免疫组化实验方法
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（3）去污剂：有利于复合物的形成，常用的非离子型去污剂有吐温-20， EDTA（0.01%），Triton X-100（0.1～1%）
（4）抗体稀释液中蛋白质浓度：稀释液中含无关蛋白质可以减少抗体的 非特异吸附，常用牛血清白蛋白
（5）防腐剂：微生物生长会干扰抗原抗体反应，稀释液和抗体液中加入 适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐
（6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻 融次数。
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酶标抗体法
• 通过共价键将酶结合在抗体上制成酶标抗体， 再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的 不溶性产物，于显微镜下进行细胞或组织表面 或内部某种抗原成分定位观察。
• 常用的酶--辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷 酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。
（6）温度和时间：较高的反应温度（37℃）可加速抗原抗体结合反应， 低温有利于抗原抗体结合率的提高
（7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。 选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇
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荧光素
1，异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC） 黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，最大吸收光谱为490～ 495 nm，最大发射光谱为520～530 nm，呈现明亮的黄绿 色荧光。最常用。
• ABC-HRP 辣根过氧化物酶：最通用的系统，使用范围广
• ABC-AP 碱性磷酸酶：灵敏度比较高，染色密度较低
• ABC-GO 葡萄糖氧化酶：灵敏度较低，适用于组织内源性 HRP或者AP含量比较高的组织，常与HRP或者AP系统配合进 行双染
• 优点：与免疫荧光技术相比，终产物可在普通 光镜下观察，切片能够长久保存，经锇酸处理 后，电子密度增强，可用于电镜观察。
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抗生物素-生物素-过氧化物酶技术 (avidin-biotin peroxidase complex
ABC)
• 原理：利用抗生物素分别连接生物素标记的第2抗体和生 物素标记的酶。其第1抗体不为标记物所标记，生物素标 记的第2抗体与ABC复合物相连接。ABC复合物是将过氧化 物酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化物酶连接物与 过量的抗生物素蛋白反应而制备的。常用：
③ 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对 比鲜明，能清晰判断结果。
④ 结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性 质和生化性质无影响，用于活体内标记， 结合物应无毒，附加抗原性小。
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7
常用的染色方法
• 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫 酶标法，亲和组织化学法
• 按标记物定位于抗原所在部位的手段，则 可将免疫细胞组织化学染色方法分为直接 法（一步法）、间接法（二步法）、桥连 法等。每进行一步结合反应。都会产生一 次阳性结果的放大效应。敏感性由高到低 依次为桥连法、间接法、直接法。
2．四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyante，TRITC）紫红色粉未，较稳定，最大吸收 光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC 发射的黄绿色荧光对比鲜明。
3．四乙基罗丹明（tetraethylrhodamine B 200，RB200） 褐红色粉未，最大吸收光谱570 nm，最大发射光谱596～ 600nm，呈橙红色荧光。价廉。
2．选择最佳固定液的标准：保持组织形态结构；保存抗原性。
（1）醛类固定剂：穿透性较强，收缩性小，是常用的固定剂。如10％中 性福尔马林液、4％多聚甲醛缓冲液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液 等。
（2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚 甲醛混合使用。
（3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分 子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使 用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
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3
免疫组化实验标本
• 组织标本（石蜡切片和冰冻切片） • 细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂
片）。 • 石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连
续切片，有利于各种染色对照观察；还能 长期存档；
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4
细胞和组织的固定
1．固定的作用--使细胞内蛋白质凝固、终止或抑制外源性和内源性酶
活性，最大限度地保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非 水溶性抗原，防止抗原弥散。
3．常用的固定方法--浸入法和灌注法（适用于动物实验研究）
组织新鲜 勿干燥 精体选积ppt 适中 固定液足够（>20倍） 5
抗体
常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
特性比较：
1. 均一性
2. 稳定性
3. 特异性
4. 重复性
5. 沉淀反应
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6
荧光素标记抗体
能够产生荧光并能作为染料的化合物称 为荧光色素。必备条件:
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染色注意事项
（1）在湿盒内进行，以免标本上的试剂干燥。
（2）酸碱度以接近体液环境为宜（PH 7.4左右）
（3）组织细胞要求新鲜，最好使用冷冻切片，固定 存档标本要求组织结构完好。
（4）切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4℃ 冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30％。
（5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景 非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验 摸索，找出最佳稀释度。
免疫组化实验方法
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1
免疫组织化学的概念
利用抗原与抗体特异性结合的原理，通 过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、 酶、金属离子、同位素）显色来确定组织 细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行 定位、定性及定量的研究，称为免疫组织 化学。
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Baidu Nhomakorabea
2
最突出的优点
• 在更广阔的范围内，把结构与功能及代谢 结合起来，在微观世界原位地确定组织及 细胞结构的化学成分，达到方法统一，定 性可靠，定位准确，定量可能。
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8
染色的基本程序
①标记抗体与标本中抗原反应结合； ②用缓冲液洗去未结合的成分； ③直接观察结果；或显色后再用显微镜观察。
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9
反应条件
抗原抗体结合属于可逆性反应，具有共性的反应条件：
（1）PH：中性及弱硷性条件（PH 7～8）有利于免疫复合物的形成
（2）离子强度：0.01～0.02 M的低离于强度有利于免疫复合物的形成
（4）抗体稀释液中蛋白质浓度：稀释液中含无关蛋白质可以减少抗体的 非特异吸附，常用牛血清白蛋白
（5）防腐剂：微生物生长会干扰抗原抗体反应，稀释液和抗体液中加入 适量的叠氮钠或硫柳汞以防腐
（6）所购抗体应及早使用，尽量减少抗体溶液的冻 融次数。
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酶标抗体法
• 通过共价键将酶结合在抗体上制成酶标抗体， 再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的 不溶性产物，于显微镜下进行细胞或组织表面 或内部某种抗原成分定位观察。
• 常用的酶--辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷 酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。
（6）温度和时间：较高的反应温度（37℃）可加速抗原抗体结合反应， 低温有利于抗原抗体结合率的提高
（7）洗涤：除去未结合抗原或抗体，除去非特异性吸附造成的背景染色。 选用自来水、生理盐水或PBS等，加去污剂并在洗涤过程中加以振摇
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荧光素
1，异硫氰酸荧光黄（fluorescein isothiocyanate，FITC） 黄色、橙黄色或褐黄色结晶粉末，最大吸收光谱为490～ 495 nm，最大发射光谱为520～530 nm，呈现明亮的黄绿 色荧光。最常用。
• ABC-HRP 辣根过氧化物酶：最通用的系统，使用范围广
• ABC-AP 碱性磷酸酶：灵敏度比较高，染色密度较低
• ABC-GO 葡萄糖氧化酶：灵敏度较低，适用于组织内源性 HRP或者AP含量比较高的组织，常与HRP或者AP系统配合进 行双染
• 优点：与免疫荧光技术相比，终产物可在普通 光镜下观察，切片能够长久保存，经锇酸处理 后，电子密度增强，可用于电镜观察。
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抗生物素-生物素-过氧化物酶技术 (avidin-biotin peroxidase complex
ABC)
• 原理：利用抗生物素分别连接生物素标记的第2抗体和生 物素标记的酶。其第1抗体不为标记物所标记，生物素标 记的第2抗体与ABC复合物相连接。ABC复合物是将过氧化 物酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化物酶连接物与 过量的抗生物素蛋白反应而制备的。常用：
③ 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对 比鲜明，能清晰判断结果。
④ 结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性 质和生化性质无影响，用于活体内标记， 结合物应无毒，附加抗原性小。
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常用的染色方法
• 根据标记物的不同分为免疫荧光法，免疫 酶标法，亲和组织化学法
• 按标记物定位于抗原所在部位的手段，则 可将免疫细胞组织化学染色方法分为直接 法（一步法）、间接法（二步法）、桥连 法等。每进行一步结合反应。都会产生一 次阳性结果的放大效应。敏感性由高到低 依次为桥连法、间接法、直接法。
2．四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamine isothiocyante，TRITC）紫红色粉未，较稳定，最大吸收 光谱550nm，最大发射光谱620nm，呈橙红色荧光，与FITC 发射的黄绿色荧光对比鲜明。
3．四乙基罗丹明（tetraethylrhodamine B 200，RB200） 褐红色粉未，最大吸收光谱570 nm，最大发射光谱596～ 600nm，呈橙红色荧光。价廉。
2．选择最佳固定液的标准：保持组织形态结构；保存抗原性。
（1）醛类固定剂：穿透性较强，收缩性小，是常用的固定剂。如10％中 性福尔马林液、4％多聚甲醛缓冲液、戊二醛-甲醛液、乙酸-甲醛液 等。
（2）非醛类固定剂：适用于多肽类激素的组织固定，常与戊二醛或多聚 甲醛混合使用。
（3）丙酸及醇类固定剂：沉淀蛋白质和糖，保存抗原性较好。但对低分 子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质的保存效果较差，和其它试剂混合使 用加以解决，如加冰乙酸、乙醚、氯仿、甲醛等。
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免疫组化实验标本
• 组织标本（石蜡切片和冰冻切片） • 细胞标本（组织印片、细胞爬片和细胞涂
片）。 • 石蜡切片对于组织形态保存好，且能作连
续切片，有利于各种染色对照观察；还能 长期存档；
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细胞和组织的固定
1．固定的作用--使细胞内蛋白质凝固、终止或抑制外源性和内源性酶
活性，最大限度地保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非 水溶性抗原，防止抗原弥散。
3．常用的固定方法--浸入法和灌注法（适用于动物实验研究）
组织新鲜 勿干燥 精体选积ppt 适中 固定液足够（>20倍） 5
抗体
常用的抗体为单克隆抗体和多克隆抗体。
特性比较：
1. 均一性
2. 稳定性
3. 特异性
4. 重复性
5. 沉淀反应
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荧光素标记抗体
能够产生荧光并能作为染料的化合物称 为荧光色素。必备条件:
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染色注意事项
（1）在湿盒内进行，以免标本上的试剂干燥。
（2）酸碱度以接近体液环境为宜（PH 7.4左右）
（3）组织细胞要求新鲜，最好使用冷冻切片，固定 存档标本要求组织结构完好。
（4）切片经染色后，应及时观察并照相。切片在4℃ 冰箱内过夜，其荧光强度将减弱约30％。
（5）调整抗体稀释度以获得最佳染色效果，以背景 非特异性染色最小为标准，对每一批抗体必须试验 摸索，找出最佳稀释度。
免疫组化实验方法
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1
免疫组织化学的概念
利用抗原与抗体特异性结合的原理，通 过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、 酶、金属离子、同位素）显色来确定组织 细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行 定位、定性及定量的研究，称为免疫组织 化学。
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最突出的优点
• 在更广阔的范围内，把结构与功能及代谢 结合起来，在微观世界原位地确定组织及 细胞结构的化学成分，达到方法统一，定 性可靠，定位准确，定量可能。
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染色的基本程序
①标记抗体与标本中抗原反应结合； ②用缓冲液洗去未结合的成分； ③直接观察结果；或显色后再用显微镜观察。
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反应条件
抗原抗体结合属于可逆性反应，具有共性的反应条件：
（1）PH：中性及弱硷性条件（PH 7～8）有利于免疫复合物的形成
（2）离子强度：0.01～0.02 M的低离于强度有利于免疫复合物的形成