慢病毒Cas9表达系统使用说明

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CRISPR Cas9 系统操作详细说明及具体步骤

CRISPR/Cas9 系统操作详细说明及具体步骤CRISPR/Cas9 是一种强大的基因组编辑工具，今天我们介绍CRISPR/Cas9 系统操作。

质粒介绍我们使用的是Feng Zhang 实验室的系统的pX330 质粒，如下图所示：酶切系统37 ℃, 3 hr；Run 1% gel，回收。

Elute 到50 mL H2O。

我们利用BbsI 消化载体形成粘末端，以利于下游oligo 退火产物的连接；酶切时请充分，且绝对不能加CIP 处理。

Target 设计Target 设计：通常情况下我们仅需要在你的目的位置附近找到NGG（N 代表任意核苷酸），然后找到其紧邻的上游20 nt 即可（如上图）。

目的位置的选择：我们绝大部分时候的目的是完全KO 一个基因，其原理是利用移码突变（CRISPR/Cas 系统诱导产生indel）。

所以我们一般选择距离起始密码子ATG 下游200bp 范围内的exon 区域。

另外，通常一个基因往往会转录成2 个以上的isoforms，所以请选择尽量靠近5』端的公共部分，保证每个isoform 都会成功移码突变通常情况下，为了便于下游KO mutants 的鉴定，我们往往可以作如上设计：即Cas9 的切割位点刚好被一个酶切位点跨过，且附近至少100 bp 内酶切位点唯一。

为了减少Off-Target 效应，请把设计好的Target 放在括号中的网址里去做预测，尽量找到一条脱靶效应较小的来继续下游实验。

20 nt 确定之后，请按照如上图所示合成两条配对的普通oligo 即可。

请注意突出的粘性末端以及补加的一个转录起始位点G。

克隆构建Validate target 的编辑效率单克隆的挑取单克隆可以有限稀释到96-well plate（～30 cells/plate）（CHO、293T、HeLa、MEF 等细胞系推荐使用）。

如果编辑效率50%，推荐分两块plate 即可，最终拿到20-30 个单克隆一般可以得到成功KO 的细胞系；或者铺到100 mm dish 里，一周后挑取单克隆（这种方法适合单细胞不容易成活的细胞系如SV589 等，但是挑取的单克隆往往不纯，有时需要重新亚克隆）。

Cas9蛋白过表达慢病毒包装构建步骤

Cas9蛋白过表达慢病毒包装构建步骤概述：以下采用Polyfect-V转染试剂为例说明慢病毒包装过程。

您也可以采用其它品牌转染试剂进行慢病毒包装。

转染试剂和质粒用量请参考生产厂家的说明书，也可以通过预实验决定。

无论采用哪种转染试剂，3种载体的相对比例应保持不变。

本例中病毒包装采用10cm培养皿。

如需用其它规格细胞培养器皿进行转染和病毒包装，请根据细胞相对生长面积对培养液体积和转染试剂用量进行相应调整。

1、转染前24小时，将293V细胞以4-5×106/10cm平皿密度接种，加入10ml 293V培养基37℃，5% CO2培养。

细胞转染前密度应达到80-90%。

2、漩涡震荡混匀Polyfect-V转染试剂。

3、准备2个离心管，按以下顺序分别制备质粒和转染试剂稀释液。

离心管1（质粒DNA）离心管2（转染试剂）Cas9慢病毒载体5μgPolyfect-V转染试剂20 μlpH1载体3.75μgDMEM无血清培养基480 μlpH2载体1.25μg-DMEM无血清培养基X μl-总体积500μl总体积500μl4、充分混匀。

5、将转染试剂稀释液（离心管2）加入质粒DNA溶液（离心管1）中，立刻充分混匀。

注意加入顺序非常重要。

6、室温孵育转染混合液15分钟。

7、将1ml转染混合液逐滴加入步骤1准备的细胞培养皿，前后晃动培养皿，充分混匀。

8、37℃培养。

9、4-6小时后，用10ml新鲜的293V培养基换液。

转染后24小时，用10ml病毒培养基换液。

10、转染后48小时收集细胞培养上清。

11、病毒上清可以直接用于感染目的细胞或者浓缩纯化后感染目的细胞。

推荐通过超速离心纯化、PEG6000浓缩纯化或者超滤法浓缩后再感染目的细胞。

12、病毒纯化后可以冻存在-80℃以备以后使用。

注意：1、Cas9蛋白的基因长4kb，Cas9表达慢病毒的包装效率和感染力比一般慢病毒低，推荐经过浓缩纯化再用于感染目的细胞。

2、Cas9基因较大，包装时产生的空壳病毒（即有病毒外壳，但没有组装进目的基因的病毒）比较多。

慢病毒Cas9表达系统使用说明

慢病毒Cas9表达系统使用说明本说明书用于：¾构建Cas9蛋白表达细胞系¾在Cas9蛋白表达细胞系中敲除目的基因适用于以下产品货号货号pLV‐Cas9载体系列 CR2001，CR2002pLV‐Cas9‐Nick载体系列 CR2003，CR2004pGR载体系列 CR2011~CR2013pGR‐EGFP载体系列 CR2014~CR2016北京英茂盛业生物科技有限公司北京市昌平区沙河镇青年创业大厦B‐916Tel：010‐62495135Emai：order@Web site：目录1、产品简介 (2)1.1CRISPR/gRNA基因敲除原理 (2)1.2慢病毒Cas9表达系统特点 (2)2、Cas9表达慢病毒制备 (3)2.1试剂准备 (3)2.2简要实验流程 (4)2.3实验前准备 (4)2.4病毒制备步骤 (5)2.4 PEG纯化慢病毒 (6)3、筛选Cas9表达稳定细胞株 (7)3.1 试剂 (7)3.2 实验前准备 (7)3.3 筛选细胞系实验步骤 (8)3.4 Cas9表达细胞系检测 (9)4、用pTYNE载体对Cas9表达细胞系进行验证 (10)4.1验证Cas9蛋白表达细胞系 (10)4.2验证Cas9Nicknase蛋白表达细胞系 (11)5、pGR和pGR‐EGFP载体构建 (13)5.1 pGR和pGR‐EGFP载体图谱 (13)5.2 靶点设计 (13)5.3 pGR载体构建步骤 (14)附录1 用到的产品 (17)附录2 引物列表 (17)11、产品简介1.1CRISPR/gRNA基因敲除原理CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。

在该机制中，Cas蛋白（CRISP‐associated protein）含有两个核酸酶结构域，可以分别切割两条DNA链。

CRISPR protocol2-质粒构建和建系

CRISPR/Cas9系统操作说明-2 ---基于lentiCRISPR v2应用指南-载体构建和建系汉恒生物提供CRISPR/Cas9载体的快速构建试剂盒，同时也提供各种载体构建和病毒包装（慢病毒、腺病毒和AAV）、建系服务lentiCRISPR v2载体是张锋实验室发布一个慢病毒载体，cas9和sgRNA 表达框在同一各载体上。

而且Cas9的C 端带有FLAG 融合标签，载体包含Puromycin 抗性基因，适合建系。

验证sgRNA 活性的时候也适合顺转；包装成慢病毒适合常规细胞系的建系。

构建非常方便。

说明lentiCRISPR v2https:///52961/☐克隆gDNA 使用BsmBI 位点，载体可以切出一个~1.9 kb 的filler 片段，便于confirm 酶切成功并利于载体回收；☐BsmBI 的位点是，酶切之后不需要CIP 脱磷也不会自连！☐Cas9的COOH 端带有FLAG tag,可以WB 或者Immunostaining；☐EFS promoter 被优化的小而强，极大提高了慢病毒包装的效率；☐载体带有Puromycin 抗性，可以富集转染/感染成功的细胞。

☐gDNA 设计方法和原则请参考上第一篇“CRISPR/Cas9系统操作说明”，链接如下：☐对于lentiCRISPR v2克隆，其合成的oligo 末端和pX330不同，请注意设计；☐怕大家看不懂，举个例子说明（克隆小白千万注意oligo 的方向）：gDNA 设计说明载体克隆说明☐Backbone的酶切体系同上一篇文章（说明：不脱磷处理参考黑框，脱磷参考红框内操作）；☐Oligo的退火条件也参考上一篇文章（说明：如果载体不脱磷，oligo不需要磷酸化；载体脱磷参考红框内操作，oligo就需要加磷处理！！！（红色框内是FengZhang提供的protocol，设计脱磷，可以参考））仅作参考病毒包装体系☐包装病毒使用的包装体系如下（for 100 mm dish ，6x106293T ）☐转染条件：用细胞转染试剂lipofiter （超便宜且好用）（汉恒生物，/cn/products/item/36，（或者lipo2000）DNA/lipofiter=1 μg ：2.5 μl☐收集48hr 和72hr 病毒上清，待用。

AAV-SaCas9操作手册

汉恒生物‐‐pHBAAV‐SaCas9‐gRNA汉恒生物—腺相关病毒pHBAAV-SaCas9-gRNA操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）简介腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。

AA V 的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。

AAV基因组中有3个启动子(P5、P19和P40)和2个开放阅读读框(ORF)，rep和cap，如图1所示，它们在AA V病毒整合、复制和装配中其重要作用。

图1.AA V基因组结构二、腺相关病毒的优点1.安全性高：迄今从未发现野生型AA V对人体致病，重组AA V基因组序列上去除了大部分的野生型AA V基因组元件，进一步保证了安全性；2.免疫原性低：AA V2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3.宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4.表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5.物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；三、CRISPR/Cas9基因敲除原理CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。

II型CRISPR/Cas系统在发挥功能时仅需要一种蛋白即Cas9核酸酶参与。

Cas9核酸酶复合体由Cas9蛋白和两个非1编码的RNA-crRNA前体pre-crRNA和tracrRNA组成。

在酿脓链球菌(Streptococcus pyoge nes)中,pre-crRNA和tracrRNA均由CRISPR位点上转录而来,然后pre-crRNA通过其含有的重复序列和tracrRNA形成RNA异二聚体,并结合到Cas9蛋白上,Cas9蛋白再对pre-crRNA进行剪切以获得成熟的crRNA,成熟的crRNA上长度为20个碱基的向导序列通过与目的DNA的序列互补来引导整个Cas9复合体去切割目的DNA。

慢病毒表达系统的标准操作规程

慢病毒表达系统的标准操作规程（编号：026）
1、目的及适用范围
该SOP用来规范慢病毒表达系统的操作。

2、主要仪器
CO2细胞培养箱、超低温冰箱、超净工作台（生物安全级别）、普通台式离心机
3、试剂及配制方法
puromycin 储存浓度100mg/mL，无菌过滤，保存于-20℃。

Lipofectamine TM 2000(Invitrogen)
4、相关器皿的预处理
操作中涉及细胞的全部器皿均为无菌，全部基本溶剂为去离子水。

5、操作步骤
5.1 确定puromycin对靶细胞的致死浓度：确定puromycin的浓度梯度，作用于靶细胞，一周后选择细胞全部死亡的最低浓度为致死浓度。

5.2 构建目的基因克隆：参照质粒图谱，将目的基因克隆至慢病毒体系的载体质粒中。

5.3包装慢病毒
5.3.1提前24h准备细胞6-8×106 293T / 10cm皿。

使转染时细胞汇度达到80%以上。

5.3.2四质粒系统转染细胞，转染试剂为Lipofectamine TM 2000
pLL3.7-gene(vector) 15μg
VSVG 5μg
10cm皿RSV/REV 5μg
pMDLG 5μg
5.3.3 4-6h后换液。

5.4收获慢病毒：48h后收获病毒。

吸出细胞培养上清，2000rpm，10min离心。

收取上清。

可于-80℃保存。

5.5感染靶细胞
感染比例为：5mL病毒液/10cm 皿细胞，在感染时细胞汇度约为80%，12h后换液。

5.6 puromycin筛选阳性细胞
52。

CRISPRCAS9慢病毒系统概述.pdf

参考文献： Science. 2014 Jan 3;343(6166):84-7. doi: 10.1126/science.1247005 Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.
CRISPR/CAS9系统载体
慢病毒载体在基因功能学研究中具有独到优势：
RNAi证明：
CRISPR/CAS9验证：
Cancer Cell. 2014 May 12;25(5):652-65. doi: 10.1016/r.2014.03.016. Epub 2014 May 1. MLL3 is a haploinsufficient 7q tumor suppressor in acute myeloid leukemia
吉凯CAS9双载体慢病毒系统介绍
ctl nc C1 C2
Cas9
nc G1 nc G2 nc G3
切割： Lenti-CAS9-puro 滴度可达2E+8 已成功构建两株CAS9稳定表达细胞株
让我们用心，换取您的放心！
定位：Lenti-sgRNA-EGFP 滴度可达3E+8以上可成功引入突变
5prcas9系统系统载体载体质粒质粒慢病毒慢病毒腺病毒腺病毒构建时间构建时间7days快25days较快较快45days慢使用范围使用范围少数易转细胞窄大多数细胞宽宽大多数细胞宽宽导入效率导入效率少数较高多数高多数高多数高多数高细胞分裂表达水平细胞分裂表达水平减弱直至丢失稳定表达稳定表达减弱直至丢失对细胞状态影响对细胞状态影响较大小小较大持续表达时间持续表达时间短长可永久表达长可永久表达较长终会丢失功能学研究适用度功能学研究适用度局限适用适用细胞状态影响大慢病毒载体在基因功能学研究中具有独到优势

慢病毒使用操作指南

慢病毒使用操作指南慢病毒是一种常用的实验工具，广泛应用于细胞和分子生物学研究。

本文档旨在提供慢病毒使用的操作指南，帮助研究人员更好地利用慢病毒进行实验研究。

第一部分：慢病毒基本知识1. 什么是慢病毒？慢病毒是一种具有RNA基因组的病毒，属于反转录病毒。

它能够将自身的RNA基因组逆转录成DNA，再与宿主细胞的基因组融合，长期稳定地存在于宿主细胞中。

2. 利用慢病毒进行基因转染的优势相比其他常用的基因转染方法，慢病毒具有以下优势：- 高效性：慢病毒能够高效地转染多种类型的细胞，包括非分裂细胞。

- 长期稳定性：慢病毒转染的基因能够长期稳定地存在于宿主细胞中。

- 遗传稳定性：慢病毒转染的基因可以遗传给后代细胞，因此适用于长期实验研究。

第二部分：慢病毒使用的关键步骤1. 选择合适的慢病毒载体慢病毒载体是慢病毒的基础构建单元，其中包含转录启动子、报告基因等必要的元件。

根据实验需要选择合适的载体。

2. 包装慢病毒慢病毒的包装是将慢病毒载体与包装载体共转染至特定细胞株，通过包装载体中的包装酶，将慢病毒的RNA基因组逆转录成DNA，形成可复制的慢病毒。

3. 提取慢病毒经包装后的细胞培养基中含有包装好的慢病毒。

可通过超速离心等方法，将细胞培养物离心，提取慢病毒。

4. 病毒滴定病毒滴定是用来确定病毒滴度的重要步骤。

通过适当稀释提取的慢病毒，将其感染指定细胞株，计算出感染单位的浓度。

5. 慢病毒感染及筛选将提取的慢病毒添加至目标细胞中，通过细胞培养和筛选，筛选出具有所需基因的细胞株。

第三部分：慢病毒使用的注意事项1. 安全操作慢病毒具有一定的传染性，进行实验时需要遵守生物安全操作规范，佩戴一次性手套、口罩等个人防护装备，避免直接接触慢病毒。

2. 避免交叉感染实验室中使用慢病毒时，应尽可能避免交叉感染。

定期对实验室环境进行消毒，使用一次性材料，避免共享器械等措施可以减少交叉感染的风险。

3. 合理控制病毒滴度对于不同类型的细胞，需要确定合适的病毒滴度，以避免过度感染或感染不足的情况。

基因编辑技术的CRISPRCas9系统的使用方法与注意事项

基因编辑技术的CRISPRCas9系统的使用方法与注意事项基因编辑技术是一项革命性的技术，可以精确地修改生物体的基因组，对于研究基因功能、开发新药和治疗遗传病等方面具有重大意义。

其中，CRISPR-Cas9系统是最常用的基因编辑工具，它具有操作简单、效率高和成本低廉的优势。

本文将介绍CRISPR-Cas9系统的使用方法和注意事项。

使用方法：1. 设计gRNA序列：gRNA（guide RNA）是CRISPR-Cas9系统中用于识别和定位特定基因序列的RNA分子。

根据需要编辑的基因序列，设计合适的gRNA序列。

良好的gRNA设计可以提高编辑效率和特异性。

2. 合成gRNA和Cas9蛋白：合成和纯化gRNA序列和Cas9蛋白，或购买商业化的CRISPR-Cas9试剂盒。

确保获得高质量的gRNA和稳定活性的Cas9蛋白。

3. 细胞培养和转染：根据实验需要，选择合适的细胞系进行培养。

将合成的gRNA和Cas9蛋白导入到目标细胞中，常用的转染方法包括化学法、电穿孔法和病毒载体介导的转染法。

4. 检测CRISPR-Cas9介导的基因编辑效果：在转染后的细胞中，通过DNA测序、聚合酶链反应（PCR）或荧光显微镜观察目标基因的编辑效果。

选择适当的检测方法进行检测。

注意事项：1. 设计合适的gRNA序列：良好的gRNA设计对于系统的特异性和编辑效率至关重要。

避免设计具有高度相似序列的gRNA，以减少非特异性切割的风险。

使用在线工具或软件来优化gRNA序列的设计，同时考虑基因组的特异性和可能的非特异性靶向。

2. 选择合适的细胞系：不同的细胞系对基因编辑的敏感性和编辑效率有所差异。

在进行实验之前，了解目标细胞系的特点，并选择合适的细胞系进行实验。

确保细胞系的完整性和纯度，以提高编辑效果的可靠性。

3. 优化转染条件：有效的转染是保证CRISPR-Cas9系统成功应用的重要步骤。

优化转染条件，以确保gRNA和Cas9蛋白在细胞内能够有效导入并发挥作用。

基因编辑技术CRISPRCas9的使用方法及注意事项

基因编辑技术CRISPRCas9的使用方法及注意事项概述基因编辑技术是一种革命性的科学工具，可以精确修改细胞和生物体的基因组。

其中CRISPR-Cas9成为最受关注的基因编辑技术之一，因其简便、高效和准确性而备受赞誉。

本文将介绍CRISPR-Cas9的使用方法及注意事项。

一、CRISPR-Cas9的基本原理CRISPR是Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats 的缩写，表示在易位区间（intergenic spacers）中间存在有一系列的短回文序列。

Cas9是一个典型的CRISPR相关蛋白，具有剪切双链DNA 的能力。

CRISPR-Cas9系统是通过引导RNA（sgRNA）与Cas9蛋白相结合，形成核酸酶复合物，使其能够精确地识别和通过碱基互补与目标基因的DNA序列结合并剪切。

二、CRISPR-Cas9的使用方法1．设计和合成引导RNA（sgRNA）sgRNA是CRISPR-Cas9系统中的关键部分，必须能够精确地与目标基因DNA序列配对。

在设计sgRNA时，需要注意以下几个方面：- sgRNA应该针对目标基因的特定区域，选择一个具有高度保守性的序列。

- 避免选择嵌合的互补序列，以免引起非特异性的DNA剪切。

- 确保sgRNA的序列无法与其他基因组中的DNA序列配对，以避免非特异性的DNA剪切。

2．合成Cas9蛋白Cas9蛋白可以由获得专利的CRISPR-Cas9公司购买，或者通过实验室内的表达系统获得。

合成或表达的Cas9蛋白可以通过亲和纯化方法来纯化。

3．转染CRISPR-Cas9系统将sgRNA和Cas9蛋白导入目标细胞的过程称为转染。

转染可以通过多种方法实现，包括化学物质转染、电穿孔转染、病毒载体转染等。

选择转染方法时，应根据特定的细胞类型和实验需求进行选择，并确保转染效率和毒性满足要求。

4．基因编辑的检测和分析在CRISPR-Cas9系统介导的基因编辑后，需要对编辑结果进行检测和分析。

基因编辑技术CRISPRCas9的使用指南

基因编辑技术CRISPRCas9的使用指南CRISPR-Cas9 基因编辑技术的使用指南引言：CRISPR-Cas9 基因编辑技术是一项革命性的生物技术，它能够准确地修改细胞或组织中的基因序列。

这项技术的发展开辟了新的研究领域，并有望推动医学、农业和生命科学领域的革新。

本文将详细介绍 CRISPR-Cas9 基因编辑技术的原理和步骤，以及一些常见的应用和未来的发展方向。

一、原理和步骤1. CRISPR-Cas9 系统原理CRISPR-Cas9 系统来源于大肠杆菌的抗病毒防御机制，其中CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）位于基因组中，Cas9 是一种核酸酶。

CRISPR-Cas9 基因编辑技术利用 CRISPR 导向 Cas9 酶精确切割靶基因的 DNA 序列，然后通过细胞自身的修复机制来修改该基因。

2. CRISPR-Cas9 基因编辑步骤（1）设计CRISPR RNA（crRNA）和转导RNA（tracrRNA）：crRNA 导向 Cas9 酶与靶基因结合，tracrRNA 与 crRNA 组成双RNA复合物。

（2）构建 CRISPR-Cas9 表达载体：将 tracrRNA 和 crRNA 序列合并，并插入携带 Cas9 基因的质粒，以构建 CRISPR-Cas9 表达载体。

（3）转染细胞：将CRISPR-Cas9 表达载体转染到目标细胞中。

（4）选择靶基因序列：根据研究需求，选择靶基因序列进行编辑。

（5）CRISPR-Cas9 基因编辑：Cas9 酶与 crRNA 引导的tracrRNA 结合后，结合到靶基因序列上，并切割目标DNA 序列。

（6）修复过程：细胞利用自身的修复机制修复被切割的DNA，可能通过非同源末端连接、同源重组或NHEJ机制来修复。

二、常见的应用1. 功能研究CRISPR-Cas9 技术可以通过靶向关键基因，在不同细胞类型中进行基因敲除、基因静默或基因突变，从而帮助科学家们研究基因功能的作用和机制。

Crispr Cas9 慢病毒构建的具体步骤及方法

Crispr/Cas9 慢病毒构建的具体步骤及方法简介Cas9蛋白的CDS长达4kb，克隆难度和包毒难度都相对大，将Cas9基因高效导入细胞是应用Cas9/CRISPR系统进行基因敲除的难点之一，极大地限制可供选择的将基因导入细胞的方法。

并且在用CRISPR/Cas9系统进行基因敲除时，还需要同时转入识别靶点的gRNA，筛选阳性细胞的抗性基因或荧光基因，用同源重组法进行基因敲除，还需要导入同源重组模板。

如此多的基因共同表达，很难得到较高的基因编辑效率，造成后续的阳性克隆筛选和检测工作难度大。

慢病毒Cas9表达体系，该体系采用慢病毒体系先在细胞中稳定表达Cas9蛋白，构建稳定表达Cas9蛋白的细胞系，再在该细胞系的基础上导入gRNA和基因敲除实验中用到的其它原件用于特异性基因敲除。

方法：a、实验方案设计更灵活。

由于不必表达大蛋白Cas9，可以根据细胞特性选择化学转染、腺病毒、腺相关病毒等多种方法导入或敲除相关基因；b、提高基因敲除效率。

在稳定表达Cas9蛋白的细胞系上进行基因敲除比瞬时转染Cas9进行基因敲除的效率更高；c、可对同一细胞进行多个基因敲除实验。

对于需要在同一个细胞系中进行多个基因的编辑或需要长期用一个细胞模型进行多项基因研究，先构建一个Cas9蛋白稳定表达的细胞系可显著提高后续实验的效率，降低实验难度。

优势：a、适用于在同一个细胞系中需要进行多个基因敲除的实验；b、基因敲除效率比直接质粒转染更高；c、提供多种不同荧光和抗性标记的慢病毒表达载体，更易筛选到基因敲除成功细胞；d、接受cas9蛋白稳定表达不同细胞系定制。

步骤流程A、cas9载体构建及慢病毒包装将cas9基因CDS区克隆至慢病毒载体，并进行cas9慢病毒包装。

B、稳定株筛选将cas9慢病毒感染特定的目的细胞，进行cas9稳定表达的细胞株筛选。

CRISPR-Cas9文库技术原理及应用

CRISPR-Cas9文库技术原理及应用CRISPR-Cas9技术原理CRISPR-Cas9技术凭借着成本低廉，操作方便，效率高等优点，CRISPR-Cas9技术迅速风靡全球的实验室，成为了生物科研的有力帮手，是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。

CRISPR-Cas9系统最初在大肠杆菌基因组中被发现，是细菌中抵抗外源病毒的免疫系统。

CRISPR-Cas9系统由两部分组成，一部分是用来识别靶基因组的，长度为20bp左右的sgRNA 序列，另外一部分是存在于CRISPR位点附近的双链DNA核酸酶——Cas9，能在sgRNA的引导下对靶位点进行切割，最终通过细胞内的非同源性末端连接机制（NHEJ）和同源重组修复机制（HDR）对形成断裂的DNA进行修复，从而形成基因的敲除和插入，最终实现基因的（定向）编辑。

与前两代技术相比，CRISPR-Cas9技术最大的突破是不仅可以对单个基因进行编辑，更重要的是可以同时对多个基因进行编辑，这也为全基因组筛选提供了有效的方法。

目前比较常见的文库类型包括：●CRISPR-Cas9 knock out文库●CRISPR panal文库●CRISPRa/i文库●psgRNA文库CRISPR-Cas9文库建库流程●靶位点确认及sgRNA文库设计●sgRNA文库芯片合成●sgRNA文库构建●QC验证文库质量●sgRNA文库慢病毒包装●感染稳定细胞株●药物筛选实验●细胞表型筛选●NGS测序验证功能基因CRISPR-Cas9文库应用方向1、药物靶点确定与验证CRISPR-Cas9筛选技术可以应用于药物靶点筛选中，通过大规模筛选技术，可以系统的分析、验证一些与抗药性相关的基因，从而为疾病治疗提供相关数据。

SCIENCE发表文章[1]，研究人员利用CRISPR-Cas9文库筛选人类黑色素瘤A375细胞中的18,080个基因进行筛选，最终发现NF2、CUL3等4个基因参与了黑色素瘤A375细胞中的耐药调节过程。

慢病毒使用操作手册

慢病毒使用操作手册简介：慢病毒（Lentivirus）是一种常用于生命科学研究中的病毒载体，其具有较强的基因转染能力和稳定的基因表达特性。

本操作手册旨在向研究者提供一个详细的慢病毒使用指南，帮助他们顺利进行慢病毒基因转染实验并获得准确可靠的研究结果。

一、慢病毒基本原理慢病毒属于反转录病毒，其基因组为单链RNA。

慢病毒在寄主细胞内通过逆转录过程将RNA转录为DNA，随后将DNA插入宿主基因组中。

这使得慢病毒成为将外源基因稳定集成到宿主基因组中的理想工具。

二、慢病毒使用前准备1. 实验室条件准备：确保工作台面干净整洁，并准备好所需的培养物、培养器具和试剂。

2. 慢病毒载体制备：根据实验需要，选择合适的慢病毒载体，并通过慢病毒包装系统将目标基因插入载体中。

三、慢病毒转染实验步骤1. 细胞培养：将目标细胞接种在培养皿中，并选择合适的培养基进行细胞培养。

2. 慢病毒感染：将预制的慢病毒悬液加入培养皿中，控制感染浓度和时间，以实现最佳的感染效果。

3. 筛选标记：根据实验需要，在感染后适当的时间点添加筛选标记物，如抗生素或荧光标记剂。

4. 选择和扩增：将受筛选标记影响的细胞单克隆分离，扩增和保存。

5. 验证表达：使用合适的实验方法，如western blot或PCR等，来确认目标基因的表达情况。

6. 结果分析：对实验结果进行统计学分析，并绘制适当的图表。

四、注意事项和常见问题解决方案1. 实验前应认真阅读文献，了解慢病毒的基本原理和实验操作流程。

2. 制备慢病毒载体时，应仔细验证目标基因的序列和正确插入。

3. 慢病毒感染时应注意控制感染浓度和时间，避免细胞毒性和非特异性感染。

4. 筛选标记物的选择应根据实验需要和细胞类型进行合理选择。

5. 实验过程中，注意严格遵守实验室安全和生物安全操作规范。

6. 常见问题解决方案：如遇到感染效率低或细胞毒性问题，可以尝试优化感染条件或调整细胞培养条件。

如果基因表达不稳定，可以尝试选择合适的筛选标记物或优化基因载体。

【神助攻系列】Cas9稳定表达细胞系

【神助攻系列】Cas9稳定表达细胞系CRISPR-Cas9CRISPR/Cas9基因敲除系统由有DNA切割活性Cas9蛋⽩蛋⽩及识别特异靶点的gRNA组成，由于只需对系统中的gRNA进⾏编辑就能实现靶点识别，极⼤了简化了构建基因敲除载体的⼯作。

CRISPR-Cas9 赋予我们精准编辑基因的能⼒在 Google 学术上，CRISPR Cas9 相关的⽂献已经超过 51700 篇。

为何使⽤cas9的稳定表达细胞系在哺乳动物细胞培养系统中，⼤多数基因组编辑都是通过瞬时转染或慢病毒转导来完成的，这对于常规的低通量应⽤来说是很有效的。

图 1. CRISPR/Cas9介导的基因组编辑原理图然⽽，对于其他的应⽤，能够稳定表达其中⼀个组成部分，即CRISPR-Cas9核酸酶，会更加有效。

cas9 稳定细胞系应⽤1)sgRNA功能验证;2)使⽤慢病毒CRISPR进⾏基因敲除;3)sgRNA⽂库筛选;4)可诱导的基因组编辑。

应⽤1:sgRNA功能验证单个sgRNAs本⾝的效率存在差异。

在进⾏⼤量的筛选⼯作之前，需要确定哪些CRISPR sgRNAs能够更加⾼效的进⾏基因组编辑。

图 2. 通过IndelCheck™体系对 CRISPR sgRNAs功能验证实验流程。

收集经 CRISPR 或 TALEN 转染的细胞，并针对靶点序列设计引物，使⽤靶点 PCR 试剂盒（1）扩增经过 CRISPR/TALEN 扩增的靶点序列。

所得的 PCR 产物经解链退⽕⽣成杂交 DNA 双链产物，其中部分部分可能存在错配，可以被 T7 核酸内切酶 I 试剂盒（2）酶切检出。

如果CRISPR/TALEN 对基因组的编辑功能是阳性的，错配酶切所产⽣的条带可以通过电泳跑胶观察到。

应⽤2:使⽤慢病毒CRISPR进⾏基因敲除利⽤慢病毒介导CRISPR⽅法：（1）⼀个慢病毒表达Cas9和sgRNA（2）转导两种不同的慢病毒，⼀种表达Cas9，另⼀种表达sgRNA。

Cas9表达慢病毒载体是什么？

Cas9表达慢病毒载体是什么？CRISPR/Cas9（规律成簇的间隔短回文重复序列及相关蛋白9）核酸酶表达载体属于几种新兴的基因组编辑工具之一（另外两种是ZFN和TALEN），可在基因组的靶位点快速有效地产生突变。

这些质粒载体编码的特异性RNA，能够引导DNA核酸酶（或缺刻酶）编辑基因组中特定位点的DNA序列。

Cas9是RNA引导DNA核酸酶，是天然原核免疫系统的一部分，赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。

在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。

为了方便使用，我们设计的CRISPR/Cas9载体能够在一个载体上同时有效表达Cas9核酸酶（或缺刻酶）和引导RNA（gRNA）。

使用CRISPR打靶目的基因需要目标细胞同时表达Cas9和特异gRNA。

这可以通过在同一个载体上共表达Cas9和gRNA，也可以通过在两个载体各上自表达Cas9和gRNA来实现。

使用Cas9和gRNA 两个载体分开表达的优势在于可使用不同的gRNA与不同的Cas9变体组合（如野生型Cas9，Cas9n，dCas9），这取决于用户的实验目的。

此外，使用单独的Cas9表达载体有利于生产稳转细胞株或者动物模型，然后使用不同的gRNA进行打靶。

这种方式比起gRNA/Cas9共表达载体转导可以获得更高的打靶效率。

Cas9表达慢病毒载体可以高效地将Cas9基因通过病毒颗粒导入使用质粒方式难转染的哺乳动物细胞。

Cas9慢病毒载体首先以质粒的方式构建并使用E. coli扩增，然后与多个辅助质粒一同转染至包装细胞。

载体上的两个LTR区域之间的DNA序列将被转录成RNA，而辅助质粒表达的病毒蛋白进一步与这些RNA组装形成完整的病毒颗粒。

有活性的病毒颗粒被释放到上清液中。

Cas9核酸酶应用说明及实例展示

Cas9核酸酶应用说明及实例展示Product Description:Recombinant Streptococcus pyogenes Cas9 (wt) protein expressed in an E. coli .Form:LiquidPreparation Method:E. coli expression systemPurity:≥ 95% by SDS-PAGEActivity:20 nM CRISPR/Cas9-C-NLS nuclease incubated for 1 hour at 37℃ result in 90% digestion of the substrate DNA as determined by agarose gel electrophoresis.Recommend Usage:CRISPR Genome editingThe optimal working dilution should be determined by the end user.Storage Buffer:In 10 mM Tris, 300 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% Glycerol PH 7.4Storage Instruction:Store at -20°C.Aliquot to avoid repeated freezing and thawing.Cas9核酸酶参数说明：描述：在大肠杆菌中表达的重组化脓性链球菌Cas9（wt）蛋白。

形式：液体制备方法：E。

大肠杆菌表达系统纯度：≥ SDS-PAGE显示95%活性：20 nM CRISPR/Cas9-C-NLS核酸酶在37℃下孵育1小时，通过琼脂糖凝胶电泳测定，底物DNA的消化率为90%。

推荐用途：CRISPR基因组编辑最佳工作稀释度应由最终用户确定。

储存缓冲液：在10mM Tris、300mM NaCl、0.1mM EDTA、1mM DTT、50%甘油PH 7.4中储存说明：在-20°C下储存。