人NSPc1慢病毒过表达系统的建立与鉴定

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过表达慢病毒载体构建和包装手册 version1

过表达慢病毒载体构建和包装手册Version1.0吉凯基因二零一一年五月目录简介 (3)第一部分过表达慢病毒载体的制备实验流程 (4)实验材料 (5)过表达克隆制备 (6)第二部分慢病毒包装与滴度检测实验流程 (17)实验材料 (18)L e n t i v i r u s病毒包装 (21)病毒的收获及浓缩 (22)L e n t i v i r u s滴度测定 (24)参考文献 (33)简介慢病毒（Lentivirus）载体是以人类免疫缺陷型病毒（HIV）为基础发展起来的基因治疗载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力，并可以在体内较长期的表达且安全性高。

吉凯基因提供的慢病毒为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。

慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。

但该病毒仍然具有可能的潜在的生物学危险，吉凯基因建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒，除非已经完全公认某个基因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。

吉凯基因慢病毒载体系统由GV慢病毒载体系列、pHelper 1.0载体和pHelper 2.0载体三质粒组成。

GV慢载体中含有HIV的基本元件5’LTR和3’LTR以及其他辅助元件，例如WRE (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)。

通常根据不同的实验目的针对GV载体改造以进行基因功能研究。

pHelper 1.0载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码病毒特异性的酶；rev基因，编码调节gag和pol基因表达的调节因子。

pHelper 2.0载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。

吉凯基因过表达慢病毒产品可通过对GV慢病毒载体的改造和病毒包装，获得带有特定基因序列的慢病毒颗粒，以满足不同的实验需求。

人Shh基因重组过表达慢病毒载体的构建与鉴定

Ｗｅｉ — ｒａｎ，ｅｔａ１．（１．Ｃｈｉｎａ－ＪａｐａｎＵｎｉｏｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆ＿，ｉｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００３３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒＣａｒｒｙｉｎｇＳｈｈａｎｄｏｂｔａｉｎＳｈｈｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄｓｔａｂｌｅ
１９７０
ＣｈｉｎＪＬａｂＤｉａｇｎ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２Ｏ１３，Ｖｏｌ１７，Ｎｏ．１１
文章编号：１００７ —４２８７（２０１３）１１ —１９７０ —０３
人Ｓｈｈ基因重组过表达慢病毒载体的构建与鉴定
粒ｐＧＣ — Ｆｕ — Ｓｈｈ的测序Ｓｈｈ基因片段大小１３８６ｂｐ。通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ检测转染２９３Ｔ的样品，可以观察到７２～９５ＫＤａ处条特征带与Ｓｈｈ融合蛋白相吻合，判断Ｓｈｈ表达。通过ＰＣＲ扩增获得了Ｓｈｈ基因，将Ｓｈｈ克隆到慢病毒转移质粒ｐＣ－Ｃ — Ｆｕ中，并在２９３Ｔ细胞中包装产生慢病毒颗粒。结论成功构建了ｐＧＣ — ＦＵ — Ｓｈｈ — ＧＦＰ慢病毒过表达载体，获得了稳定转染的细胞株。

人NSPc1慢病毒过表达系统的建立与鉴定

李辉人 NSPc1 慢病毒过表达系统的建立与鉴定
441
2001 年，Nunes 等［1］通过原位杂交技术首次在小鼠胚胎发育过程中发现 Polycomb 家族蛋白（ polycomb group proteins，PcGs）新成员 NSPc1 （ nervous system polycomb 1）在神经系统特异高表达。NSPc1 在小鼠胚胎干细胞状态的维持过程中起非常重要的作用［2］。结合当前针对 PcG 家族中 NSPc1 的同源基因 Bmi1 在神经干细胞中的研究结果［3 － 4］，推测 NSPc1 在神经系统的发育、分化过程中可能具有重要作用。然而，由于神经细胞转染效率低，目前针对 NSPc1 的已有研究工作均以容易转染的肿瘤细胞系为模型［5 － 7］，在神经干细胞中的功能研究更是缺乏。本实验拟建立能够过表达 NSPc1 的 pLenti6 慢病毒系统，为神经干细胞等难以转染的原代细胞中开展 NSPc1 的功能研究奠定基础。
关键词：过表达； NSPc1；慢病毒载体；多梳家族
中图分类号： Q 782 文献标志码： A
Construction and identification of lentiviral over-expression system of human NSPc1 gene
LI Hui1 ，GONG Yan-hua2，3* ，HU Guang-yu3 ，YIN Bin3
Abstract： Objective To construct and identify lentiviral over-expression system to study the function of NSPc1 using over-expression technique． Methods The cDNA sequence of human NSPc1 was chosen to design the primer， and restricted enzyme site was added to primer sequences. The DNA purified from PCR was digested with double restriction enzymes and then linked with linearized pLenti6-TO-EGFP-TRIP． The recombinants were identified by restriction digestion and DNA sequencing． The plasmids of positive clones were transfected into 293T cells，and Western blot was used to identify the over-expression efficiency of the lentiviral vector． Then 293T cells were used to package the lentiviral particles and infected by obtained lentiviral particles． The over-expression efficiency of NSPc1 lentiviral system was examined by Western blot． Results The human NSPc1 sequences was successfully inserted into pLenti6-TO-EGFP-TRIP vector，which was identified by double restriction digestion and DNA sequencing． Western blot validated that both the lentiviral vector and lentiviral particle can effectively over-express human NSPc1 gene in 293T cells． Conclusion The construction of over-expression lentiviral system of human NSPc1 gene may support the further study of function of NSPc1 gene as a potential over-expression technique． Key words： over-expression； NSPc1； lentivirus vector； polycomb group

癌胚抗原慢病毒表达载体的制备及鉴定

癌胚抗原慢病毒表达载体的制备及鉴定郑红;张文玲;赵国强;董子明【期刊名称】《河南大学学报（医学版）》【年(卷),期】2009(028)002【摘要】目的:构建人癌胚抗原(CEA)慢病毒表达载体,以期在哺乳动物细胞中高效、稳定表达.方法:提取CEA阳性的人结肠癌组织总RNA,逆转录获得cDNA序列,CEA全基因引物进行PCR扩增,对所扩增出的大小约2100bp的基因片段胶回收纯化,与pGEM-T Easy载体连接得到重组质粒pGEM-T-CEA.分别用XhoL和Hind Ⅲ双酶切重组质粒pGEM-T-CEA和慢病毒载体pLentiGFP,将双粘CEA片段与羟化后的双粘线形载体pLentiGFP连接得重组载体pLentiGFP-CEA.pLentiGFP-CEA与慢病毒辅助包装载体pΔ8.2和pVSVG共转染293FT细胞,Western Blot验证CEA在转染293FT细胞中表达,72h后收集病毒上清.结果:通过PCR扩增获得了CEA基因,将CEA正向克隆到慢病毒转移质粒pLentiGFP中,并在293FT细胞中包装产生慢病毒颗粒.结论:成功构建了CEA慢病毒表达载体,为进一步从分子水平探讨CEA功能奠定了基础.【总页数】4页(P88-91)【作者】郑红;张文玲;赵国强;董子明【作者单位】郑州大学,基础医学院,河南,郑州,450052;郑州大学,基础医学院,河南,郑州,450052;郑州大学,基础医学院,河南,郑州,450052;郑州大学,基础医学院,河南,郑州,450052【正文语种】中文【中图分类】R73.3【相关文献】1.抗癌胚抗原单抗与生物素及链霉亲和素偶联物的制备及性能鉴定 [J], 李贵平;朱承谟2.LOX-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定 [J], 周蒨;吴慧恒;陈信良;董晓燕3.VASP基因RNA干扰慢病毒表达载体的构建与鉴定 [J], 王静;魏蕾;邱堃4.长链非编码RNA BRE-AS1慢病毒表达载体的构建与鉴定 [J], 周辉;余淦;徐华;叶章群5.长链非编码RNA-GAS5慢病毒表达载体构建及其转染效率鉴定 [J], 郑东颖;侯悦;李媛媛;杨云;乔宠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

携人源TPA基因的慢病毒表达质粒的构建与鉴定

基础．
１材料与方法
１１试剂与材料．
质粒ｐ－Ｇ — Ｆ，ＧＭ－Ｐ感受态细胞Ｊ０ＬＰＫｅＰｐＥＴＡ，ＧＭ１９为本实验室保存．快速连接试剂盒购自Ｐｏｇｒｍｅａ
公司，接酶、切酶Ｅ连内 ∞ＲＩ１Ｌ）（０ｇ、ＸｈＩＩＵ／Ｌ）ａｏ（Ｏ／、ＢｍＨＩＩＵ／Ｌ和Ｅｅ（Ｏ￣均购自２（Ｏ／）￣ｈＩＩＵ／Ｌ）ｐｒｎ公司．ｉｏｅｔｍｉｅ００购自Ｉｖｒｇｎ司，回收试剂盒（量）质粒提取试剂盒购自天为时代ｅｍｅｔＬｐｆｃｎ２０ａｎｉｏｅ公ｔ胶小、
要：用ＰＲ扩增人源ＴＰ基因，用酶切一连接的方法将目的片段亚克隆入慢病毒表达质利ＣＡ再
粒ｐ－Ｇ — ＦＬＰＫｅＰ中，Ｇ最后用测序、酶切和在２３细胞中瞬时表达的方法进行了鉴定．９结果显示：含人源ＴＡ基因的ｐ－Ｇ — Ｐ－ＦＰＬＰＫＴＡｅＰ慢病毒表达载体构建成功，Ｇ为进一步利用转基因术更加安技
３， ’引物正义链５端加有Ｘｏ酶切位点， ’ ｈＩ反义链３端有Ｂｍ酶切位点， ’ ａＨＩ产物长度约１０ｂ．７０ｐ反应体系４￣：０ｇ０Ｌ３ｎ质粒ＤＡ，ＰＲ缓冲液，．ｍｄＴ，Ｎ４Ｃ０４ＭＮＰ上下游引物各２Ｌ２Ｐｕ含Ｍｇ，ｆ酶（离子）反应．条件：４９ ℃预变性３ｉ；４ｍｎ９＊Ｃ变性４ｓ５℃退火３ｓ７ ℃延伸ｌｎ共３个循环；２０，７０，２ｍｉ，Ｏ７ ℃延伸１ｍｎ扩增０ｉ．

慢病毒载体的构建及低表达和过表达CEA EC9706细胞株的建立

Ｓｈｏ／ＢａｉＭｅｉａｃｅｃ，Ｚｈ．ｇｈｕＵｎｖｒｉｃｏｌｓｃｏｄｃｌＳｉｎｅｅｚｏｉｅｓｔｎｙ，Ｚｅｇｈｕｈｎｚｏ，Ｈｅａ０５Ｃｉａｎｎ４０２，ｈｎ）５
Ａｂｔａｔｓｒｃ：Ｏｂｅｔｖ：ＴｏｃｎｔｕｔｊｃｉｅｏｓｒｃＣＥＡｉｓＲＮＡｅｔｒａｄＣＥＡｘｒｓｉｎｖｃｏ，ｔａｋｇｅｔｖｒｓｐｒｉｌｓｖｃｏｎｅｐｅｓｏｅｔｒｏｐｃａｅｌｎｉｉｕａｔｅ，ｃ
慢病毒载体的构建及低表达和过表达ＣＡＥ９０细胞株的建立ＥＣ７６
郑红林波赵国强，子明，，董
（．河南大学医学院病理生理教研室，南开封４５０；．郑州学基础医学院，南郑州４０５）１河７０４２Ｉ大河５０２
第２９卷第３期
２１００年８月
河南大学学报（学版）医
ＪｕｎｌｏｎｎＵｎｖｒｉｙ（ｅｉａｃｅｃ）ｏｒａｆＨｅａｉｅｓｔＭｄｃｌｉｎｅＳ
ＶｏＬ２９Ｎｏ．３
Ａｕｇ．２００１
制，株稳定ＣＡ过表达的Ｅ９０１ＥＣ７６细胞株（Ｃ７６ＣＡ）结论：立了稳定低表达和过表达ＣＡ的Ｅ９０Ｅ９０Ｅ。建ＥＣ７６细
胞株，功调控食管癌Ｅ９０成Ｃ７６细胞中ＣＡ的表达，Ｅ为进一步从分子水平探讨ＣＡ的功能奠定了基础。Ｅ关键词：胚抗原；Ｃ７６慢病毒载体癌Ｅ９０；中图分类号：Ｒ３３７．文献标识码：Ａ文章编号：６２７０（０００ — ０６ —０１７ — ６６２１）３１０４

人ALPL基因慢病毒载体的构建及鉴定

人ALPL基因慢病毒载体的构建及鉴定陈哲;张立强;张文凯;付欣;轩昆;金岩【摘要】目的:构建肝/骨/肾型碱性磷酸酯酶(alkalinephosphatase,liver/bone/kidney,ALPL)基因慢病毒表达载体并观察其在骨髓间充质干细胞(BMMSC)中的表达情况,为进一步研究ALPL基因功能提供基础工具.方法:将PCR扩增的人ALPL基因片段和pENTR-2B入门质粒载体的双酶切产物进行连接后,转化感受态细胞；再将所得的pENTR-2B-ALPL入门质粒与Plenti6.3/V5-DEST载体进行重组,并经DNA测序鉴定后,转染GP2-293T细胞,制备慢病毒颗粒；最后用含Plenti6.3-ALPL表达载体的病毒感染BMMSC,并通过ALP染色、RT-PCR、Western blot检测ALPL基因和组织非特异性碱性磷酸酶(tissue-nonspecific alkaline phosphatase,TNAP)的表达.结果:PCR和测序证实人ALPL基因正确插入慢病毒载体；ALP染色、RT-PCR、Western blot检测结果显示,人ALPL慢病毒过表达质粒及相应病毒颗粒能在BMMSC中有效过表达ALPL基因.结论:成功建立ALPL慢病毒表达系统,并为后期深入了解TNAP功能打下了基础.%AIM: To construct human recombinant lentiviral vector of alkaline phosphatase liver/bone/kid-rnney (ALPL) gene-Plenti6. 3-ALPL. METHODS: The effective sequence of ALPL gene was cloned into the pENTR - 2B vector using restriction endonuclease digestion and DNA ligation methods. Then the pENTR - 2B - ALPL entry vectors and the Plenti6. 3/V5 - DEST lentiviral vectors were restructured. After DNA sequencing confirmation,the recombinant lentiviral vectors were transfected into GP2 - 293T cells to pack lentivirus. The Plenti6. 3 - ALPL virus was used to infect bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) and the expression of ALPL on bothRNA and protein levels was detected by ALP staining, RT - PCR and Western blot respectively. RESULTS: DNA sequencing and Western blot demonstrated that the lentivirus vector was constructed correctly. Moreover, ALP staining was enhanced in BMMSCs infected by the Plenti6. 3-ALPL. CONCLUSION: Recombinant lentiviral vector of ALPL gene was successfully constructed.【期刊名称】《牙体牙髓牙周病学杂志》【年(卷),期】2013(023)002【总页数】4页(P91-94)【关键词】ALPL;慢病毒表达载体;骨髓间充质干细胞【作者】陈哲;张立强;张文凯;付欣;轩昆;金岩【作者单位】第四军医大学口腔医学院,陕西西安710032;第四军医大学口腔医学院,陕西西安710032;第四军医大学口腔医学院,陕西西安710032;第四军医大学口腔医学院,陕西西安710032;第四军医大学口腔医学院,陕西西安710032;第四军医大学口腔医学院,陕西西安710032【正文语种】中文【中图分类】R780.2低碱性磷酸酯酶症［1］(hypophospatasia，HPP)是一种由ALPL基因突变导致骨骼和牙齿等发育异常的常染色体隐性遗传性疾病。

CBS基因过表达PC12细胞株的建立及鉴定

ＣＢＳ基因过表达ＰＣ１２细胞株的建立及鉴定尹蔚兰１，２，廖志强２，阳柏成２，姜骆永２，文芳１，邬力祥１（１中南大学基础医学院，长沙４１００８３；２南华大学医学院）摘要：目的　建立胱硫醚-β-合成酶（ＣＢＳ）基因过表达ＰＣ１２细胞株并进行鉴定。

方法　根据ＧｅｎＢａｎｋ数据库中的ＣＢＳｃＤＮＡ序列设计合成ＣＢＳ基因引物，ＰＣＲ扩增ＣＢＳ基因，并将其克隆到慢病毒过表达载体ＧＶ３４１中，用慢病毒过表达载体连同两种包装病毒载体对２９３Ｔ细胞进行转染，收获含ＣＢＳ慢病毒载体的上清液，用其感染正常的ＰＣ１２细胞，用嘌呤霉素进行筛选得到ＣＢＳ基因过表达ＰＣ１２细胞株。

用实时荧光定量ＰＣＲ法检测所得ＰＣ１２细胞（观察组）、空载体转染的ＰＣ１２细胞（对照组）、正常ＰＣ１２细胞（空白组）中的ＣＢＳｍＲＮＡ。

用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测上述三组细胞中的ＣＢＳ蛋白。

结果　观察组、对照组、空白组ＰＣ１２细胞ＣＢＳｍＲＮＡ表达量分别为１６２．２０±１１．２０、１．００±０．０３、２．３０±０．０７，ＣＢＳ蛋白表达量分别为１．５３±０．０９、１．００±０．１０、０．９６±０．１０。

观察组ＰＣ１２细胞ＣＢＳｍＲＮＡ、蛋白表达量均高于对照组和空白组（Ｐ均＜０．０５），对照组ＰＣ１２细胞ＣＢＳｍＲＮＡ、蛋白表达量与空白组相比差异均无统计学意义。

结论　成功构建ＣＢＳ基因过表达ＰＣ１２细胞株。

关键词：ＰＣ１２细胞；胱硫醚-β-合成酶；慢病毒载体ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２-２６６Ｘ．２０１６．２６．００５中图分类号：Ｑ７８２文献标志码：Ａ文章编号：１００２-２６６Ｘ（２０１６）２６-００１７-０３基金项目：国家自然科学基金资助项目（８１２００９８６）；国家级大学生创新创业训练计划项目（２０１３１０５５５１９６）。

第一作者简介：尹蔚兰（１９７３-），女，硕士，在读博士，副教授，主要研究方向为神经退行性疾病发病机制及防治。

慢病毒载体构建步骤

一、简介慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。

区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。

慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。

该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。

目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。

由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。

采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体，然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。

慢病毒载体能够产生表达shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。

慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。

在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶III启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶HI有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。

当RNA 聚合酶I遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。

U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶H依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达〜21ntRNA和〜50ntRNA茎环结构(stem loop)。

在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA),载体包含位于RNA聚合酶I启动子和4〜5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4个U 3 ’突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。

慢病毒介导过表达NTCP的NTCP-SK-Hep1细胞系构建

慢病毒介导过表达NTCP的NTCP-SK-Hep1细胞系构建勾英;刘正芸;肖冬焱;周艳萌;罗果;高兴红;王欢【摘要】目的建立钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)过表达的肝癌细胞系,以作为研究乙肝病毒(HBV)感染的细胞模型.方法构建NTCP慢病毒重组质粒 Gv-NTCP,挑取克隆进行PCR扩增和序列测定;将阳性重组质粒与慢病毒辅助质粒共转染HEK293T细胞,包装Gv-NTCP慢病毒并进行病毒滴度测定;Gv-NTCP慢病毒感染人肝癌细胞株SK-Hep1,嘌呤霉素筛选,通过荧光显微镜,PCR和Western blot 检测NTCP的表达.结果测序结果证实Gv-NTCP慢病毒载体构建成功;在HEK293T细胞中包装的Gv-NTCP慢病毒滴度为2.0×108 TU / mL;该病毒感染SK-Hep1细胞后,在荧光显微镜下可见感染细胞表达绿色荧光,PCR结果显示感染组的NTCP表达明显增高,WB结果显示感染组的NTCP蛋白表达明显增高.结论成功建立了NTCP过表达的人肝癌细胞系NTCP-SK-Hep1.%Objective To establish the SK-Hep1 cell lines over-expressed NTCP gene by lentiviral vector and further investigate the hepatitis B virus (HBV) cellmodel.Methods NTCP gene was amplified by PCR and sub-cloned into the lentiviral vector GV358 and then was assessed by DNA sequencing.The recombinant lentivirus was generated by co-transfection of three plasmids into HEK293T cells.The titer of virus was calculated according to the number of the viable HEK293T cells infected by the recombinant virus.The recombinant lentivirus was used to infect hepatocellular carcinoma cell line SK-Hep1.Puromycin was applied to screen stably-transfectedcells.Fluorescence microscope,real-time PCR and western blot assays were carried out to detect the expression of NTCP.Results DNA sequencingverified that NTCP was successfully inserted into GV358 vector,and Gv-NTCP virus was obtained in 293T cells.The titer of recombinant lentivirus was 2.0×108 TU/mL.The SK-Hep1 cell line was infected by GV-NTCP virus and the transfected cell line stably expressing NTCP gene was selected.The results of real-time PCR and western blot assays showed that NTCP gene expression in the stable transfected cell line was more than that in the control group (P<0.05).Conclusion A stable SK-Hep1 cell line with NTCP gene over-expression is successfully constructed.【期刊名称】《遵义医学院学报》【年(卷),期】2017(040)002【总页数】6页(P150-155)【关键词】钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白;肝癌细胞;慢病毒载体【作者】勾英;刘正芸;肖冬焱;周艳萌;罗果;高兴红;王欢【作者单位】遵义医学院医学微生物学教研室,贵州遵义 563099;遵义医学院医学与生物学研究中心,贵州遵义 563099;遵义医学院医学与生物学研究中心,贵州遵义 563099;贵州省普通高等学校传染病与生物安全特色重点实验室,贵州遵义563099;遵义医学院医学微生物学教研室,贵州遵义 563099;遵义医学院医学与生物学研究中心,贵州遵义 563099;遵义医学院医学微生物学教研室,贵州遵义563099;遵义医学院医学与生物学研究中心,贵州遵义 563099;贵州省普通高等学校传染病与生物安全特色重点实验室,贵州遵义 563099;遵义医学院医学与生物学研究中心,贵州遵义 563099;贵州省普通高等学校传染病与生物安全特色重点实验室,贵州遵义 563099;遵义医学院医学微生物学教研室,贵州遵义 563099;遵义医学院医学与生物学研究中心,贵州遵义 563099;贵州省普通高等学校传染病与生物安全特色重点实验室,贵州遵义 563099【正文语种】中文【中图分类】R346基础医学研究钠离子-牛磺胆酸钠共转运多肽(Na+/taurocholate cotransportingpolypeptide,NTCP)是多次跨膜糖蛋白，主要在肝细胞的基底膜上表达。

NSPc1-shRNA慢病毒表达载体的构建与鉴定

ＬＩＨｕｉ，ＧＯＮＧｎｈｚＹａ — ｕａ ’ ‘
，
Ｈｕｎ —ｕ，ＹＮＢｎ（ＤｐｉｏｇｎｍｒｌｙＭｅｉｌｏｌｅｏｈｎｓＰｏｌ’ ＵＧａｇｙＩｉｅｔｆＨｓｌｙａｄＥｂｙｏ，ｄｃｌｇＣｉｅｅｅｓｏｔｏｏｇａＣｅｆｅｐ
６７ —６９２２．
吴雅彬，宋加华，唐丽，高脚竞速运动对大学生心肺机能的等．影响［］吉首大学学报：Ｊ．自然科学版，０８２２）１０一２０，９（：２
平末端的双链后，与酶切后的ｐｅｔｏ３７载体片段进行连接、Ｌｎｉｘ．Ｌ转化。用双酶切及ＤＡ测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆质Ｎ粒并转染２３９Ｔ细胞，收集细胞全蛋白用Ｗｅｔｎ检测ＲＡ效果。结果ｓｒｅＮｉ
结论
重组克隆经酶切证实ｓＲＡ正确插入慢病毒载ｈＮ
摘要：目的能。方法
构建并鉴定ＮＰｌｓＲＡ慢病毒表达载体，Ｓｃ—ｈＮ以便应用ＲＡ技术以及慢病毒感染系统进一步研究ＮＰｌ的功ＮｉＳｃ设计针对ＮＰｌＲＡ靶序列的小发夹状ＲＡ，ＳｃｍＮＮ化学合成含茎环结构的正义链与反义链，退火形成带内切酶粘／
ＣｉｓＡａｅｙｏｄａｃｎｅ；ＤｐＢｏｈｍｓ，ｄａｏｌｅｏｈｎｓｅｌ’ ＡｍｄＰｌｅＦｒ：ＣｒｓｏｄｎｈｎｅｃｄｍｅｆＭｅｉｌｉｃｓｅｔｃＳｅｆｏｉｅｉｒＭｅｉｌＣｌｇＣｉｅＰｏｅｓｒｅｏｉｏｅ ‘ ｏｅｎｉｃｔｙｃｅｆｅｐｃｃｒｐｇ

核心结合因子α1过表达慢病毒载体的构建及鉴定

ｖｃｏｏｕｎＢＦｄ１ＲＵＮＸ２ｗａｏｓｒｃｅｙｒｃｍｂｎｎｅｔｒｆｒｈｍａＣ／ｓｃｎｔｕｔｄｂｅｏｉａｔＤＮＡｅｈｉｕ．ＴｅｒｓｌｎｅｔｉｌｅｔｒｅｎａｎｎＣＦ仅ＩｔｃｎｑｅｈｅｕｔｇｌｎｉｒｖｃｏｏｔｉｉｇｈＢｉｖａ／
转染２３９Ｔ细胞，经荧光显微镜观察和ＷｅｔｎＢｏ检测ｈＢＲＮ２因在２３ｓｒｌｅｔＣＦＯ１ＵＸ基ｔ／９Ｔ细胞内的瞬时表达。再利用脂质体转染法将ｐＣＦ — ＣＦ／ＵＸ、Ｈｌｅ１和ｐｅｐｒ．Ｇ — ＵｈＢ仅１Ｎ２ｐｅｐｒ．Ｒ０Ｈｌｅ２０三质粒共转染２３９Ｔ细胞，包装产生慢病毒，并通过实时荧光定量ＰＲ检测病毒滴度。结果重组质粒经测序证实，Ｃ插入片段与人ＣＦ仪１ＵＸＢ／ＲＮ２基因序列完全一致。荧光显微镜观
ＲＵＮＸ２ｗａｃｎｆｒｅｂＰＣＲｄｅｅｉｇ．ＴｈｇｎｒｔｄｅｏｓｏｉｍｄｙａｎｓｑｕｎｃｎｅｅｅａｅｒｃｍｂｉｎｔｎａｐＧＣ—ＦＵ—ｈＣＢＦ仅１ＲＵＮＸ２，ｗａｔａｓｅｔｄｉｔ２Ｔｃｌｓｓｒｆｃｅｎｎｏ９３ｅｌ
ｐＣ— Ｕ— ＣＦ０１ｐｌｅ１０ｎｄＨｅｐｒ．ｂｉｏｅｔｍｉｅ００－ｄａｅｒｎｆｃｉｎＧＦｈＢ【．Ｈｅｐｒ．ａｐｌｅ２０ｙＬｐｆｅａｎ２０ｍｅｉｔｄｔｓｔ．Ｔｅｔｅｆｃｎｅｔｔｄｖｒｓａｄ－ａｅｏｈｉｒｏｏｃｎｒｅｉｗｓｅｔａｕ

构建人SMARCAL1基因过表达慢病毒载体调控胚肾细胞增殖

构建⼈SMARCAL1基因过表达慢病毒载体调控胚肾细胞增殖摘要：⽂题释义：SMARCAL1：⼜称为HepA相关蛋⽩，是⼀种ATP驱动的退⽕解旋酶，属于SNF2蛋⽩家族，参与着DNA修复、损伤以及⼀些基因的转录调控。

在肾脏发育过程中SMARCAL1表现为空间和时间选择性表达模式来参与其发育与成熟。

Wnt通路：是由复杂的蛋⽩⽹络组成的信号通路，包含50余种蛋⽩以及相关基因。

Wnt信号蛋⽩与细胞膜上的受体结合后激活胞内信号通路，调节靶基因的表达，在胚胎发育过程中对细胞的增殖、分化、迁徙、极性和凋亡均起到重要的作⽤。

背景：研究发现SMARCAL1在⼈类发育和成熟肾脏的多种细胞类型中选择性表达，表明其在肾脏发育过程中发挥着重要的功能作⽤。

⽬的：探讨SMARCAL1过表达对于胚肾细胞增殖功能的影响。

⽅法：取293T细胞和HEK293细胞的第3代细胞⽤于实验。

选⽤pHBLV-CMV-MCS-3FLAG-EF1-ZsGreen-T2A-PURO 载体构建⼈SMARCAL1基因过表达慢病毒载体，转染293T细胞包装慢病毒。

实验分为3组：空⽩组为⽆处理的HEK293细胞；阴性对照组为转染空载病毒的HEK293细胞；SMARCAL1过表达组为转染SMARCAL1过表达病毒的HEK293细胞。

对SMARCAL1过表达慢病毒转染后⽤嘌呤霉素筛选获得稳定转染细胞株。

通过观察转染率来检测病毒滴度；荧光定量PCR和Western印迹法验证稳转细胞株；CCK-8和EdU染⾊法检测细胞增殖情况；进⼀步通过荧光定量PCR探讨对Wnt通路的影响。

结果与结论：①SMARCAL1过表达质粒基因序列与⽬的基因⼀致，经慢病毒包装后测得SMARCAL1过表达慢病毒滴度为1×108 TU/mL，空载慢病毒滴度为3×108 TU/mL；②与空⽩组和阴性对照组⽐较，SMARCAL1过表达慢病毒转染后细胞中SMARCAL1 mRNA和蛋⽩⽔平显著升⾼ (P < 0.05)，细胞增殖活⼒明显下降(P < 0.05)，Wnt通路中CTNNB1和WNT4基因表达⽔平降低(P < 0.05)；③实验结果表明，SMARCAL1过表达慢病毒载体构建成功并能够在细胞中顺利表达；SMARCAL1基因可能通过Wnt通信号通路参与调节胚肾细胞增殖，进⽽影响肾脏发育。

Med19过表达慢病毒载体的构建及鉴定

Med19过表达慢病毒载体的构建及鉴定王晓艳;李莉华;郭子健;饶敏【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2011(027)022【摘要】Objective To construct a lentiviral expression vector of human Medl9 and identify its expression in 293T cells. Methods Human Medl9 sequence was amplified, purified, ligated with lentiviral vector plasmid and verified by sequencing. The verified plasmids were transfected into 293T cells by lipofectamine 2000. Transfection efficiency was assayed by both immunofluorescence microscopy and western blot. Medl9 lentiviral vector plasmid from the selected constructs was propagated and harvested with a virus packaging system, and the virus titers were determined. Results The Medl9 gene was successfully constructed into pGC-FU-Medl9 express lentiviral vector. Medl9 expression was observed using fluorescence microscope after the transfection. Western blotting also showed Medl9 expression in the transfected 293T cells. The Medl9 gene sequence of the vector was successfully verified by sequencing. The concentrated titer of virus suspension was 2xlO9 Tu/mL. Conclusion The human Medl9 lentiviral expression vector was successfully constructed. This facilitates further studying Medl9 biological function.%目的:构建含Med19基因的过表达慢病毒载体.方法:用PCR技术获得Med19基因片段,将其连接入酶切后的线性慢病毒载体,转化感受态细胞进行PCR及测序鉴定.脂质体转染法共转染293T细胞,荧光显微镜及Western blot检测转染效率.包装成慢病毒,实时定量PCR检测病毒滴度.结果:成功获取Med19基因,测序证实所获取基因序列完全正确.荧光显微镜以及Western blot检测均证实pGC-FU-Med19携有正确的Med19基因,并能在293T细胞中表达.实时定量PCR检测病毒滴度为2×109 TU/mL.结论:成功构建Med19基因慢病毒表达栽体,为进一步研究其生物学功能奠定了基础.【总页数】3页(P4013-4015)【作者】王晓艳;李莉华;郭子健;饶敏【作者单位】214062,江苏省无锡市,苏州大学附属第四医院肿瘤研究所;214062,江苏省无锡市,苏州大学附属第四医院肿瘤研究所;214062,江苏省无锡市,苏州大学附属第四医院肿瘤研究所;214062,江苏省无锡市,苏州大学附属第四医院肿瘤研究所【正文语种】中文【相关文献】1.网素蛋白1和增强绿色荧光蛋白基因共表达慢病毒载体构建和鉴定及在结直肠癌细胞SW480中表达 [J], 何佳;邓峰美;林友胜;刘漪沦2.人骨诱导因子和绿色荧光蛋白基因共表达慢病毒载体的构建和鉴定及在HT-29细胞中的表达 [J], 霍永旭;李宇;刘雁军;郭元彪;杨春蕾;赵聪3.microRNA-223过表达与抑制表达慢病毒载体的构建及鉴定 [J], 王韵;吉宁;周敏;江潞;陈谦明4.小鼠Sirt3基因过表达慢病毒载体的构建及其表达鉴定 [J], 孙钦儒;贾宁5.TAZ诱导性过表达慢病毒载体的构建、鉴定及诱导过表达TAZ神经母细胞瘤细胞株的建立 [J], 阮红峰;应忠明;罗环因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

SOX17_过表达慢病毒载体和稳定转染细胞系的构建

第 49 卷第 6 期2023年 11 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.6Nov.2023DOI：10.13481/j.1671‑587X.20230603SOX17过表达慢病毒载体和稳定转染细胞系的构建黄少婷1,2, 李友1,2, 吴钊淳2, 何嘉文2, 廖科棋2, 李胜男1,2（1. 广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室，广东湛江524002；2. 广东医科大学附属医院神经病学研究所，广东湛江524002）［摘要］目的目的：构建性别决定区Y盒17（SOX17）过表达慢病毒载体，使用SOX17过表达慢病毒感染PC12细胞并建立稳定过表达SOX17的细胞系。

方法：在NCBI数据库中查找、设计并合成SOX17过表达序列，将其与经Bam HⅠ和AgeⅠ双酶切的慢病毒GV492载体连接，构建GV492-SOX17过表达重组质粒。

琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，筛选携带GV492-SOX17过表达重组质粒的阳性菌，克隆后测序。

将GV492空载质粒和GV492-SOX17过表达重组质粒分别转染至人胚肾HEK 293T细胞中，转染48 h后收集GV492对照慢病毒和GV492-SOX17过表达慢病毒进行包装并测定病毒滴度。

将PC12细胞分为空白组、GV492对照组和GV492-SOX17组，空白组不作处理，GV492对照组和GV492-SOX17组分别采用相应慢病毒感染细胞（感染复数＝100），10 mg·L－1嘌呤霉素筛选成功感染慢病毒的PC12细胞，荧光显微镜观察各组PC12细胞生长状态及绿色荧光表达情况。

采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组PC12细胞中SOX17 mRNA表达水平，Western blotting 法检测各组PC12细胞中SOX17蛋白表达水平。

结果结果：GV492-SOX17过表达重组质粒的基因片段长度约为744 bp， GV492-SOX17过表达重组质粒基因序列与设计合成的SOX17过表达序列一致。

人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒质粒构建及其过表达和降表达白血病细胞株的建立

人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒质粒构建及其过表达和降表达白血病细胞株的建立支蕾;宋娟;姚智;杨洁【期刊名称】《天津医科大学学报》【年(卷),期】2013(019)003【摘要】目的:分别构建人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒载体并建立其过表达(NB4-pCDH-p100)和降表达(NB4-pLKO-shp100)的NB4人白血病细胞系.方法:对于人类P100蛋白过表达慢病毒质粒构建,利用Eco RI和BamHI限制性内切酶对已构建好的质粒pEGFP-C2-p100进行双酶切以获得p100基因片段,回收纯化后连接到慢病毒载体pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上;对于人类P100蛋白降表达慢病毒质粒构建,设计针对人类p100基因的siRNA序列,进一步合成靶序列的Oligo DNA并构建pLKO.3G-shp100质粒.将构建好的P100蛋白过表达和降表达质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,包装产生假病毒颗粒.收集浓缩假病毒颗粒感染NB4细胞,并筛选单克隆细胞株.荧光显微镜下观察感染效率,利用Western blot方法检测细胞株中P100蛋白的表达水平.结果:通过对重组质粒进行酶切鉴定,观察到插入的人类p100片段和其干扰片段,并获得了P100蛋白过表达和降表达NB4细胞株,荧光显微镜下检测到感染效率达90％以上,Western blot方法证实NB4-pCDH-p100细胞株中P100蛋白表达水平明显增高,NB4-pLKO-shp100细胞株中P100蛋白表达水平明显降低.结论:成功构建了人类P100蛋白过表达和降表达慢病毒质粒并建立其过表达和降表达白血病细胞株,可为有关人类P100蛋白功能及作用机制研究奠定基础.【总页数】6页(P169-173,259)【作者】支蕾;宋娟;姚智;杨洁【作者单位】天津医科大学免疫学系,国家教育部免疫微环境与疾病重点实验室,天津市细胞与分子免疫学重点实验室,天津300070;天津医科大学免疫学系,国家教育部免疫微环境与疾病重点实验室,天津市细胞与分子免疫学重点实验室,天津300070;天津医科大学免疫学系,国家教育部免疫微环境与疾病重点实验室,天津市细胞与分子免疫学重点实验室,天津300070;天津医科大学免疫学系,国家教育部免疫微环境与疾病重点实验室,天津市细胞与分子免疫学重点实验室,天津300070【正文语种】中文【中图分类】Q7【相关文献】1.慢病毒载体的构建及低表达和过表达CEA EC9706细胞株的建立 [J], 郑红;林波;赵国强;董子明2.过表达N-cadherin基因慢病毒表达载体的构建及稳定细胞株的建立 [J], 李想;秦雪柳;丁梅;曲德伟3.人CARABIN蛋白过表达慢病毒载体构建及其稳定表达细胞株的筛选 [J], 刘凯玉;蒋维;王瑞娜;吴家雪;党永军4.TAZ诱导性过表达慢病毒载体的构建、鉴定及诱导过表达TAZ神经母细胞瘤细胞株的建立 [J], 阮红峰;应忠明;罗环5.转录因子E2F1及其突变体真核表达质粒的构建及稳定表达细胞株的建立 [J], 安娇;朱长军;王雅洁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

慢病毒介导的miPSC－EC YAP基因过表达及稳定感染细胞系的建立

慢病毒介导的miPSC－EC YAP基因过表达及稳定感染细胞系的建立张雪;郝长宁;曾庆坛;阚科佳;陈佳全;吴圣俊;严泽振;张岚【期刊名称】《中国血管外科杂志（电子版）》【年(卷),期】2016(8)1【摘要】Objective To establish a miPSC-EC (Mouse induced pluripotent stem cell-Endothelial cell) line with stable YAP gene overexpression and lay a foundation for the studies of miPSC-EC with YAP overexpression in vitro and in vivo. Methods Reconstruct the plasmid pCMV-Flag-YAP2-5SA to recombinant lentiviral expression plasmid pPGK-2Flag-YAP2-Puro.Package the pPGK-2Flag-YAP2-Puro plasmid and packaging plasmids into mature lentivirus to infect 293FT cells. The supernatant of the infected cells was harvested to infect endothelial cells derived from miPSC and a stably infected cell line miPSC-EC/YAP were screened by puromycin. The YAP expression of miPSC-EC/YAP was detected by real-time PCR and Western blot. Results The lentivirus carrying YAP was constructed successfully and with a virus titer of 1.2×109TU/ml. The cells induced from miPSC had the same morphology of endothelial cells. Almost all cells expressed endothelial cell marker CD31.The expression level of YAP mRNA in miPSC-EC/YAP was obviously higher than that of the nontransfected cells. The YAP protein in miPSC-EC/YAP was obviously expressed,and while the YAP protein in nontransfected cells was almost not expressed. ConclusionLentivirus vector of YAP gene overexpressing is successfully constructed. EC derived from miPSC is successfully induced. The cell line miPSC-EC/YAP with stable YAP gene overexpression is established successfully.%目的：建立稳定过表达Yes 相关蛋白（YAP）的小鼠诱导性多能干细胞来源的内皮细胞（miPSC－EC）系，为 miPSC－EC 过表达 YAP 基因的体内外实验研究奠定基础。

NSPc1对小鼠神经干细胞增殖分化影响初探的开题报告

NSPc1对小鼠神经干细胞增殖分化影响初探的开题报告一、研究背景神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是一类能够自我更新和分化为神经元和神经胶质细胞的细胞类型。

NSCs在神经系统发育过程中起到重要作用，并在成年神经系统中存在，具有参与神经再生和修复的潜力。

因此，探究NSCs的分化调控机制及其对其增殖分化的影响对于神经系统疾病的治疗及再生医学具有重要的意义。

NSPc1是一种神经发育调节蛋白，已被证明在胚胎发育中促进神经干/前体细胞的增殖和定向分化。

在成年中枢神经系统中，NSPc1的表达也存在，并与神经元再生和胶质细胞增生有关。

因此，研究NSPc1对NSCs增殖和分化的影响，可以为深入探究NSCs分化调控机制和神经系统再生提供新的思路。

二、研究目的本研究旨在探究NSPc1对小鼠NSCs增殖分化的影响，并初步探究其作用机制，为进一步研究NSCs分化调控机制和神经系统再生提供基础。

三、研究内容1.小鼠NSCs培养和鉴定采用小鼠NSCs原代培养方法，根据干细胞特性进行鉴定，并筛选出适宜的细胞供后续研究使用。

2.NSPc1干扰和过表达采用RNAi和基因转染等技术干扰和过表达NSPc1蛋白，在细胞水平上探究NSPc1对NSCs增殖和分化的影响。

3.细胞增殖和分化分析通过MTT法和CFSE染色法检测NSPCs增殖活性和细胞周期；CCK-8实验检测NSPCs分化能力，免疫荧光染色和Western blotting检测神经干细胞和神经元标志物的表达水平。

4.初步探究NSPc1调控NSCs增殖分化的分子机制通过全基因组转录组测序分析，研究NSPc1对NSCs增殖分化的调控机制。

四、研究意义1.为深入探究NSCs分化调控机制和神经系统再生提供新的思路。

2.探究NSPc1在NSCs增殖和分化中的作用机制，为神经系统疾病的治疗和再生提供理论基础和实验依据。

3.积累了更为丰富的神经干细胞实验技术手段，为日后神经干细胞的研究提供经验和借鉴。