高迁移率族蛋白1刺激人肾系膜细胞增殖并分泌纤维化相关因子

高迁移率族蛋白1刺激人肾系膜细胞增殖并分泌纤维化相关

因子

摘要】目的：探讨高迁移率族蛋白1（high mobility group prptein,HMGB1)在促使人肾系膜细胞(human renal mesangial cell, HRMCs)增殖及分泌纤维化相关因子中的作用。方法：用不同浓度梯度的重组HMGB1刺激体外培养的人肾系膜细胞，以CCK-8测定人人肾系膜细胞增殖情况，以ELISA方法检测培养上清液中纤维化相关因子TGF-β1的分泌量，以real-time PCR法测定细胞周期蛋白cyclinD、PNCA蛋白的表达。结果：一定浓度的HMGB1可刺激人肾小球系膜细胞的增殖，细胞内细胞周期蛋白cyclinD、PNCA基因表达增加，细胞培养上清液中TGF-β1浓度增高。结论：HMGB1通过刺激人肾小球系膜细胞增殖并分泌TGF-β1参与了肾脏纤维化过程。

【关键词】高迁移率族蛋白1；人系膜细胞；纤维化；TGF-β1；增殖；细胞因子【中图分类号】R68 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）36-0023-03

Effect rHGMB1 on proliferation of human renal mesangial cells and secretion of fibrosis-related cytokines.

Zhou Jianguang,Chen Yu.

Department of General Medicine, The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310019, China.

【Abstract】Objective To investigate the role of HMGB1 in inducing human renal mesangial cells (HMCs) to proliferate and secret fibrosis-related cytokines. Methods Recombinant protein HMGB1 (rHMGB1) was incubated with HMCs and then proliferation assay was carried out with CCK-8; cyclinD and PCNA genes were determined with real time PCR; supernate of cultured HRMCs with rHMGB1 was examined for detection of TGF-β1 with ELISA method. Results HMGB1 promoted proliferation of HRMCs; HMGB1 increased expression of cyclinD and PCNA genes involving cell proliferation; rHMGB1 increased secretion of TGF-β1 in supernate of cultured HMCs. Conclusion rHMGB1 was involved in fibrosis of kidney by inducing HRMCs to proliferate and secret fibrosis-related cytokines.

【Key words】HMGB1; Human renal mesangial cells; Fibrosis; Cytokines; Proliferation; TGF-β1

肾脏纤维化是多种疾病导致肾功能衰竭的共同通路。肾脏系膜细胞的增殖，纤维化相关因子对肾脏固有细胞的刺激，是肾脏纤维化的两个重要因素。慢性的炎症反应又是导致肾脏纤维化的另一重要因素。高迁移率族蛋白1（high mobility group prptein, HMGB1)是晚期炎症因子，可诱发和促进炎症反应，也和多个脏器的纤维化有关。狼疮性肾炎的主要病理表现为增生性肾小球肾炎。我们在前期狼疮小鼠的研究中发现，系膜增生明显的小鼠肾脏组织HMGB1表达明显升高。据此推测HMGB1可能促进人肾系膜细胞的增殖，后者分泌纤维化相关因子，促使肾脏纤维化的进程。本实验拟通过体外细胞学实验观察重组HMGB1对人肾系膜细胞增殖和纤维化相关因子分泌的影响。

1.材料和方法

1.1 材料和试剂

CCK-8试剂盒购买自江苏碧云天生物有限公司，逆转录试剂盒以及Real time-PCR试剂盒购自TAKARA公司。ELISA试剂盒（TGFbeta1）购自RD公司。人肾系

膜细胞株购自上海信裕生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养人肾系膜细胞株，于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液、

5%CO2、37℃的孵箱中传代培养。生长至80%融合时，饥饿培养24小时，使细

胞同步。按照处理因素不同进行分组：加入低中高不同浓度（据预实验）的HMGB1刺激后进行下一步实验，设置空白对照组。

1.2.2 CKK-8检测细胞增殖培养于96孔培养板的经过相关因素处理的系膜细胞，每孔加入10μl CCK-8，放置于孵箱中2小时后，置于分光光密度仪570nm读

取吸光度。每个浓度设置5个复孔，重复实验3次。

1.2.3用ELISA方法检测培养上清液中的纤维化相关因子购买TGFβ1的ELISA

试剂盒，留取经相关因素处理的系膜细胞培养上清液，按照试剂盒步骤检测相关

因子。

1.2.4 Real time PCR法检测cyclin D、PCNA基因表达水平经相关因素处理的系

膜细胞，用1ml Trizol总RNA提取试剂盒提取总RNA。取2μg提取的总RNA，用TAKARA试剂盒逆转录为cDNA，并进行Real time PCR检测。cyclin D的引物序列

为5’-GGATGCTGGAGGTCTGCGA-3’(正向)5’-AGAGGCCACGAACATGCAAG-3’(反

向),PCNA的引物序列5’-CGCGGATCCATGTTCGAGGCGCGCCTG-3’(正向)，5’-CCGCTCGAGCTAAGATCCTTCTTCATCCTCGATC-3’(反向)。

1.3 统计学处理

使用SPSS19统计软件进行分析，组间差异用t检验，P<0.05提示具有统计学

意义。

2.结果

2.1 高浓度HMGB1能够显著促进人系膜细胞HMCs增殖

我们将HMC细胞培养在不同浓度的HMGB1培养基内，观察期48h后细胞增

殖情况。HMGB1浓度分比为0ng、20ng、50ng、100ng和500ng。利用MTT法检测，我们发现48h后，随着HMGB1浓度增加，细胞的数量随之增加20ng、50ng、100ng和500ng依次增加，同时相互之间差别显著（P<0.05），见图1。

Fig.1 Proliferation of HMCs with different concentration of rHMGB1

图1 不同浓度的rHMGB1促进HMCs细胞增殖

2.2 HMGB1增加细胞增殖相关基因PCNA和cyclin D的表达

利用real time PCR法，我们检测PCNA和cyclin D的mRNA在不同浓度rHMBG1处理后的

表达情况。

如图2和3所示，rHGMB1可以上调PCNA和cyclin D mRNA的表达（GB200），和空白

对照组（con）相比具有统计学意义(P<0.05)