果胶酶产生菌的分离及其产酶条件优1
果胶酶的制作工艺及流程
果胶酶的制作工艺及流程一、制作工艺流程是：原料→预处理→抽提→脱色→浓缩→干燥→成品。
二、具体过程1．原料及其处理鲜果皮或干燥保存的柚皮均可作为原料。
鲜果皮应及时处理，以免原料中产生果胶酶类水解作用，使果胶产量或胶凝度下降。
先将果皮搅碎至粒径2～3mm，置于蒸汽或沸水中处理5～8min，以钝化果胶酶活性。
杀酶后的原料再在水中清泡30min，并加热到90℃5min，压去汁液，用清水漂洗数次，尽可能除去苦味、色素及可溶性杂质。
榨出的汁液可供回收柚苷。
干皮温水浸泡复水后，采取以上同样处理备用。
2．抽提通常用酸法提取。
将处理过的柚皮倒入夹层锅中，加4倍水，并用工业盐酸调ph 至1．5～2．0，加热到95℃，在不断搅拌中保持恒温60min。
趁热过滤得果胶萃取液。
待冷却至50℃，加入1%～2%淀粉酶以分解其中的淀粉，酶作用终了时，再加热至80℃杀酶。
然后加0．5%～2%活性炭，在80℃下搅拌20min，过滤得脱色滤液。
因柚皮中钙、镁等离子含量较高，这些离子对果胶有封闭作用，影响果胶转化为水溶性果胶，同时也因皮中杂质含量高，而影响胶凝度，故酸法提取率较低，质量较差。
为解决以上问题，西南农业大学食品学院(1995)对酸法提取作了改进，即在酸法基础上，按干皮重量加入5%的732阳离子交换树脂或按浸提液重量加入0．3%～0．4%六偏磷酸钠，前者果胶得率可提高7．2%～8．56%，胶凝度提高30%以上，而后者得率提高25．35%～35．2%，其胶凝度可达180±3。
3．浓缩采用真空浓缩法，在55～60c的条件下，将提取液的果胶含量提高到4%～6．5%后进行后续工序处理。
近来作者和国内其他单位研究表明，超滤可用于果胶液浓缩，如用切割分子量为50 000u的管式聚丙烯腈膜超滤器，在温度45℃、ph3．0、压力0．2mpa 条件下进行超滤浓缩，可将果胶浓度浓缩至4．21%，而其杂质含量和经常性生产费用分别仅为真空浓缩的1／5和1／2～1／3。
产酸性果胶酶菌株的筛选及产酶条件的研究
目前 国 内果 胶酶 发 酵 的酶 活 力低 ， 导致 生 产 成 本 高 ， 限制 了该 酶 的广 泛 应 用 。本 文 报 道 一 株 高产 酸性 果 胶 酶
菌 株一 宇 佐 美 曲霉 （ ｐ ｒｉｕ ｓｍｉ） 一１的筛 选 以及 Ａｓｅｇｌ ｓｕ ａ ｉＹＬ ｌ 固 态 发 酵 产 果 胶 酶 的 发 酵 条 件 和 发 酵 培 养 基 的试 验 结
’ １］
利 用 黑 曲霉 ３３ ４菌 株 固态 发 酵 产 果 胶 酶 活 力 为 １ ４５ ．２ ７ ．４ Ｕ ｇ 张 健红 等 从 腐 烂 的 苹果 表皮 分 离 获得 一 株 芽 孢杆 ／。 菌 ＷＳ Ｂ ４ ０ 液体 发 酵产碱 性果 胶 酶活 力为 ３ ／ 。 Ｈ ０ － ２， ４Ｕ ｍＬ
吸 取 ０１ Ｌ适 当 稀 释 的 酶 液 ，加 至 ２ Ｌ用 ｐ ．ｍ ．ｍ ４ Ｈ ３５Ｎ ｚＰ ４ ．、 ａ Ｏ 一柠 檬 酸缓 冲液 配 制 的 ５ Ｌ果 胶 底 物 溶 Ｈ ．ｇ ０／
ｌ材 料 和 方 法
１１供 试 菌 株 ． 共 １ ０株 曲 霉 菌 株 ， 号 分 别 为 ： 佐 美 曲霉 Ｙ 一 ， 编 宇 Ｌ １
高 产果 胶 酶 的黑 曲霉 突变 株 Ｈ Ａ ，在优 化 的发 酵条 件 Ｙ４ 下 酶 活 力达 １ ８ ／。杨 辉 等 以苹 果 渣 为 产酶 诱 导剂 ， ５Ｕｇ ２
２２ ３ ７ ７３ ２
７１ ４ ５８ ５
ＨＬ ５ 一 ＨＬ ６ ．
ＨＬ ７ 一 ＨＩ＿ ，８
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ＨＬ ２ 一 ＨＬ ３ 一
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（Ｈ Ｎ ．
表 ２ 初筛 ４株 菌株 产 果 胶 酶 复筛 结 果
果胶酶的研究及其应用
2 果胶酶的应用
其次，天然生物活性物质提取物是目前中药进入国际市场 的一种理想方式，出口比例已超过中药，并呈上升趋势。 可利用果胶酶生产的提取物有：银杏叶提取物、大蒜油浓 缩液、蘑菇浓缩液、人参浆、当归浸膏、甘草液等。另外， 在金耳多糖，香菇多糖，金针菇多糖，山楂叶总黄酮等的 提取中也使用了果胶酶。利用酶类提取，不仅可提高萃取 率，还可提高纯度。 另外，在油料萃取方面，按照传统的生产工艺，菜籽油、 棕榈油、葵花籽油、橄榄油等一般是由正己烷等脂溶性溶 剂萃取制得。而正己烷是一种致癌物质。将果胶酶和纤维 素酶，半纤维素酶结合使用，可破坏油料作物的细胞壁， 便于油料的释放，从而提高萃取率。由于酶法提取条件温 和，油料中多酚物质和VE都有所增加，从而提高油料的 稳定性。
2 果胶酶的应用
2.1 利用果胶酶瓦解植物细胞的细胞壁 2.1.1 果胶酶澄清作用 果胶酶是能分解果胶质的多种酶的总称，包括果胶聚半乳 糖醛酸酶、聚甲基半乳糖醛酸酶、果胶甲酯水解酶、原果 胶酶。果胶酶作用于果胶中D-半乳糖醛酸残基之间的糖苷 键，可以打破果胶分子，软化果肉组织中的果胶质，使高 分子的半乳糖醛酸降解为半乳糖醛酸和果胶酸小分子物质， 并且果胶的多糖链也被降解，果胶分子的这种连续降解使 果酒的黏性下降，原来存在果酒中的固形物失去依托而沉 降下来，增强澄清效果，提高和加快了果酒的可滤性和过 滤速度。因此果胶酶是应用于果酒生产的重要酶制剂之一， 它被广泛用于果酒的澄清。
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果胶酶的研究及其应用
前言
果胶酶（Pectinases）是指分解果胶物质的多种 酶的总称，在食品加工、饲料加工、造纸、环境 保护、诱导植物抗病等方面都有很大的应用价值。 果胶酶可源于动物、植物和微生物。由于动、植 物及天然来源的果胶酶产量低且提取困难，不能 满足生产的需要；而微生物因生长速度快，生长 条件简单，代谢过程特殊和分布广因而成为果胶 酶的重要来源。随着果胶酶用量的增加及发酵工 业的发展，国内外学者对微生物果胶酶进行了深 入地研究，并已有多种微生物来源的果胶酶商品 酶制剂出售。本文主要从以下几方面概述了果胶 酶近年来的研究进展及其在果蔬、纺织、造纸加 工业中的应用概况。
果胶酶的生产工艺
果胶酶的生产工艺
果胶酶的生产工艺包括以下几个步骤：
1. 选材：选用高果胶含量的水果，如苹果、梨、柿子、西瓜等。
2. 切碎：将选好的水果清洗干净后切碎，以便于后续的提取。
3. 溶解：将切碎的水果加水溶解在酸性条件下，如pH值为3-5左右，可使用柠檬酸、醋酸等。
4. 液态发酵：在酸性条件下，将加入酸的果汁加入产果胶酶的微生物（如大肠杆菌、酵母菌）中进行液态发酵。
发酵温度通常在25-30，发酵时间根据不同的微生物而有所不同。
5. 固态发酵：将果汁与产酶微生物混合后，加入发酵介质，如豆粕、麦麸、玉米粉等，进行固态发酵。
发酵温度通常在35-45，发酵时间需3天以上。
固态发酵可以提高酶的产量和保存时间。
6. 分离提取：将发酵后的混合物过滤或离心，得到果胶酶，可通过超滤、逆流、醋酸盐析等方法进一步纯化。
7. 调整活性：根据实际需要，可以通过加温、调节pH值等方法调整果胶酶的
活性。
8. 包装保存：将调整好活性的果胶酶装入适当的包装中，如瓶装、袋装等，存放在低温干燥处，以延长保存期限。
【高中生物】探究酶活性最适条件的实验
【高中生物】探究酶活性最适条件的实验一、实验类型及设计1.探索最佳温度的实验（1）自变量的操纵：设置一系列梯度温度（t1、t2、…、tn）。
（2）设计理念：（3）步骤写作：3.探索最佳pH值的实验（1）自变量的操纵：设置一系列梯度ph值（ph1、ph2、…、phn）。
（2）设计理念：（3）步骤写作：二、典型透析例题果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一。
果胶酶能够分解果胶，瓦解植物细胞壁及胞间层。
在果汁生产中应用果胶酶可以提高出汁率和澄清度。
请你帮助完成以下有关果胶酶和果汁生产的实验课题。
实验仪器和材料：澄清器、烧杯、试管、量筒、刀片、玻璃棒、漏斗、纱布等。
苹果、质量分数为2%的果胶酶溶液、蒸馏水等。
实验一：果胶酶在果汁生产中的作用实验方法和步骤：⑴将苹果洗净去皮，用磨浆机制成苹果泥，加入适量蒸馏水备用。
（2）取两个100ml清洁烧杯，编号1和2，按相应程序操作。
请填写表格中未填写的内容。
操作顺序项目烧杯一2①在烧杯中加入苹果泥20毫升20ml②2ml③注入蒸馏水④在恒温水浴中保温，并用玻璃棒不时搅拌10分钟10min（3）取出两个烧杯，同时过滤。
观察或比较并记录结果。
实验结果的预测及结论：果胶酶对果胶水解有催化作用。
实验二：验证果胶酶在果汁生产中的作用（1）在受试者的实验步骤中，在完成“在烧杯中添加苹果泥，在试管中添加果胶酶溶液，编号和分组”后，有以下两个操作：方法一：将试管中的果胶酶溶液和烧杯中的苹果泥相混合，再把混合液的ph分别调至4、5、6、……10。
方法二：将试管中的果胶酶溶液和烧杯中的苹果泥的pH值调节至4,5,6，。
10，然后将果胶酶溶液与pH值相等的苹果泥混合。
请问哪一种方法更为科学：，并说明理由：。
⑵ 实验步骤中还有玻璃棒搅拌操作，旨在减少实验误差。
⑶如果用曲线图的方式记录实验结果，在现有的条件下，当横坐标表示ph，纵坐标表示，实验的操作和记录是比较切实可行的。
根据你对酶特性的了解，在图20中选择一个最可能是实验结果的曲线图：。
果胶酶的生产工艺
果胶酶的生产工艺果胶酶是一种重要的工业酶，广泛应用于食品、医药和化工等领域。
果胶酶的生产工艺主要分为发酵法和微生物共代谢法两种。
发酵法是目前最常用的果胶酶生产工艺。
其主要步骤如下：1. 菌种培养：选择高效果胶酶生产菌株，并进行预培养。
预培养在适宜的培养基中进行，培养条件包括温度、pH值和培养时间等。
2. 发酵产酶：将预培养好的菌株接种到大规模发酵罐中，进行主发酵。
主发酵条件需调控合适，包括温度、pH值、发酵时间和转速等。
主发酵过程中，菌体会分泌出大量的果胶酶。
3. 分离与纯化：主发酵结束后，将发酵液进行固液分离，得到含果胶酶的液体部分。
然后通过酒精沉淀、离心和过滤等步骤进行粗提纯，将酶从其他杂质中分离出来。
4. 浓缩与干燥：将粗提纯后的果胶酶液进行浓缩，通常采用薄膜浓缩或离心浓缩。
然后将浓缩后的果胶酶溶液进行干燥，通常采用喷雾干燥或冷冻干燥技术。
5. 成品包装：将经过干燥的果胶酶进行包装，常见的包装方式包括塑料袋、铝箔袋和灌装瓶等。
另外，微生物共代谢法也是一种常用的果胶酶生产工艺，主要步骤如下：1. 菌种培养：选择具有果胶酶合成代谢途径的菌株，并进行预培养。
预培养条件与发酵法类似。
2. 子代发酵：将预培养好的菌株接种到适宜的培养基中，进行子代发酵。
子代发酵的目的是增加菌株的数量并促进果胶酶的合成。
3. 产酶代谢产物提取：子代发酵结束后，通过离心和过滤等方法，将微生物中的产酶代谢产物提取出来。
4. 分离与纯化：将提取的产酶代谢产物进行分离纯化，通常采用柱层析、超滤和透析等方法将果胶酶从其他杂质中分离出来。
5. 浓缩与干燥：与发酵法类似，将纯化后的果胶酶溶液进行浓缩和干燥，最终得到成品。
总的来说，果胶酶的生产工艺主要包括菌种培养、发酵产酶、分离与纯化、浓缩与干燥以及成品包装等步骤。
不同的生产工艺会根据具体情况和需求进行选择。
果胶酶讲解
葡萄糖异构酶从以下六个方面来了解和认识：1.酶的催化特性和来源2. 酶的功能用途3. 酶的结构和理化性质4. 酶的生产方法和提取纯化工艺5. 酶制剂在生产中的应用6. 该酶制剂的发展趋势一、酶的催化特性和来源•葡萄糖异构酶又称木糖异构酶，它可以催化D-木糖、D-葡萄糖，D-核糖等醛糖转化为相应的酮糖。
•目前为止，发现的产酶菌为细菌和放线菌，还有少量的米曲霉和酵母中。
1、催化特性由于葡萄糖异构化为果糖具有重要的经济意义，因此工业上习惯将D-木糖异构酶称为葡萄糖异构酶。
该酶一般只能催化C2与C4羟基为顺式的戊糖和己糖异构化，即只能催化D-木糖、D-核糖和D-葡萄糖异构化为对应的酮糖大多数微生物该酶是胞内酶，可以直接利用细胞进行异构化反应，但也有一些微生物可以产生胞外酶，因菌种菌龄培养条件而异。
2、来源细菌•主要是乳酸杆菌，如短乳杆菌、发酵乳杆菌、盖氏乳杆菌、李氏乳杆菌、甘露醇乳杆菌、产气气杆菌、阴沟气杆菌、果聚糖气杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热芽胞脂肪杆菌等。
放线菌•主要是链霉菌和诺卡菌，如白色链菌、包氏链霉菌、多毛链霉菌、黄微绿链霉菌、橄榄色链霉菌、秀红链霉菌、委内瑞拉链霉菌、达氏诺卡菌等。
•还有密苏里游动放线菌其他•米曲霉•酵母菌密苏里游动放线菌胞内酶达95%以上，嗜热放线菌M1033的胞外异构酶达99%，我国7号淀粉酶链霉菌M1033菌株也可以产生胞外葡萄糖异构酶。
生产葡萄糖异构酶的微生物分为诱导型需要木糖作为诱导剂组成型不添加木糖，是工业生产发展的方向二、酶的功能用途1. 将葡萄糖异构化为高果糖浆，味道纯正，具有较强保温性、着色性和防腐性，营养价值较高2. 可不经消化直接被肠胃吸收，果糖的代谢不受胰岛素调节，糖尿病人可以利用。
3. 是饮料、糕点等食品工业的理想用糖，在蜂蜜中含量最为丰富，它的甜度约为蔗糖的1.2-1.8倍。
4. 目前在全国范围内各国都大力发展果葡糖浆和结晶果糖的生产三、酶的结构和理化性质•淀粉的浆液经过α-淀粉酶的催化作用，可以形成糊精，糊精经过糖化酶的催化作用形成葡萄糖，葡萄糖在葡萄糖异构酶的催化作用下，分子的结构变化，这叫做G的异构化，G经异构化就形成了果糖，如果把果葡糖浆中的果糖和葡萄糖分离开来，经分离出来的葡萄糖再次进行异构化，并且如此反复多次，最后的混合物中果糖的含量可以达到70%-90%，这样的混合物就叫做高果糖浆。
产果胶酶黑曲霉发酵条件的优化
２０ 年 １ 月 ０８ ０
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豆粕 的 添加 量 （％ ）
图 １ 培 养 基 中豆粕含 量对 果胶 酶产量 的影 响 ２２ 培养 基 中添加诱 导物 对产酶 的影响 ．
诱导物
图 ２ 培养 基诱导 物对 果胶 酶产量 的 影响 作用程 度 ，对 细 胞 产 生 间接 影 响 ，改 变 某些 化 合
由 图 １ 以看 出 ，培养基 中添加 ２５ 可 ．％的豆 粕最 有 利 于产 酶 。
１２３ 斜面培养方法 ．．
挑斜 面 保 藏 菌 种 一 杯 ，接 于 Ｐ Ａ斜 面 培 养 Ｄ
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第 ２ 卷 第 ５期 ８ 技 术
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Ｖ０．８ Ｎ ５ １２ ｏ． Ｏ １ ２ ０ ｃ． ０ ８
产 果胶 酶 黑 曲霉 发酵 条 件 的优化
杜 国军 刘 晓兰 郑喜群
１１０ ） ６０６
取 ０５ ｌ 当稀释 的粗酶 液于 ２ｍ ．ｍ 适 ５ Ｌ比色管 中 ，加
１ 实验材料 与方法
１ １ 菌种 ．
入 ２０ ｌ ．％果胶溶液 （Ｈ ．）作为底物溶液， ． ４ ｍ０ ｐ ４０ ４ ℃水浴反应 ３ｒｎ ５ ０ ｉ，加 入 Ｄ Ｓ溶液 煮沸 ５ ｉ， ａ Ｎ ｍｎ 冷却 ， 定容至 ２Ｉ ，５０ｍ测定吸光值 。 ５ｌ ２ｎ Ｉ ｌ 酶活力定义为 ：在 ４ ℃，ｐ ４０条件下 ，每 ５ Ｈ． 分钟分解果胶生成 ｌ ｎｌ ￣ ｏ 半乳糖醛酸所需的酶量 ａ 为一个酶活力单位 （ ） ｕ。
果胶酶
果胶酶在果蔬汁饮料生产中的应用摘要：果胶酶普遍存在于细菌、真菌和植物中，是分解果胶类物质的多种酶的总称，在果蔬加工、饲料、纺织和造纸工业中应用地非常广泛。
果胶酶在果蔬饮料中应用地非常广泛，本文介绍了果胶的分类及作用机制，主要论述了过果胶酶在果蔬汁生产中的出汁率、澄清、超滤等方面的应用，并对果胶酶在果蔬汁加工中的应用等方面进行综述。
关键词：果胶酶；出汁率；澄清；膜通量。
1前言：随着社会经济的发展和人们生活水平的提高，果品成了人类健康不可缺少的营养物质。
我国有着丰富的果品资源，然而因果品本身营养丰富，含水量高，很容易受微生物侵入感染和腐蚀，导致保存期较短。
为了充分利用资源优势，提高我国农产品在国际市场上的竞争能力，必须大力发展果品加工业。
但是目前果品加工中存在着不少难题，例如果汁和果酒的澄清，果实的脱皮、加工过程中香气成分和营养物质的损耗等[1-4]。
解决这些难题仅仅靠改进加工工艺或增加设备投资是很难实现。
而果胶酶是目前应用在果蔬饮料生产中最主要的酶类，它可以水解果蔬加工过程中引起混浊的果胶以及一些多糖类成分；使得果蔬汁变得清澈透亮，同时改善果蔬汁的过滤效率进而提高其生产效率及出汁率，在果蔬饮料加工方面已得到广泛的应用[5]。
本文将就这些应用做一个综述。
果胶酶对甜菜渗出汁清净效果的影响。
1.1果胶酶的分类及作用机制果胶酶是催化果胶物质分解一类酶的总称。
果胶酶主要包括果胶酯酶、聚甲基半乳醛酸酶、聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸裂解酶和聚甲基半乳糖醛酸裂解酶等[6]。
若从生产、应用领域和最适用pH值来划分，则果胶酶通常可以分为酸性果胶酶和碱性果胶酶。
酸性果胶酶通常是指内聚半乳糖醛酸酶，原因是大多数的聚半乳糖醛酸酶的最适pH值为3.5～5.5。
它是以水解的作用方式无规则切断果胶酸分子的α—l，4糖苷键，主要应用于食品加工业中果蔬汁和果酒的提取及澄清[7]。
碱性果胶酶一般多指聚半乳糖醛酸裂解酶，它是以反式消去的作用方式裂解果胶酸分子的α—l，4糖苷键，将复杂的果胶分解成小分子，如半乳糖醛酸。
污泥中果胶分解菌分离纯化及鉴定
污泥中果胶分解菌的分离纯化及鉴定1、引言果胶酶在工业上可用于果汁果酒澄清提取、果实脱皮、麻类脱胶、饲料添加剂、中药营养液深加工以及作为天然食品的防腐剂、改善果蔬的感官品质等。
[1][2]近年来，随着我国果汁、果酒业的发展，果胶酶的需求也日益增加。
目前关于果胶酶产生菌的研究主要集中在酶活较高的霉菌，对细菌的研究很少，然而霉菌生产果胶酶存在产酶周期长、耗氧量多、菌丝易缠结等不足，因此筛选具有高酶活性细菌具有广泛的应用价值。
[3]由于土壤中微生物大量存在，对其进行分离时应选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。
但值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种生理生化反应鉴定才能得到[4] 。
2、材料与方法2.1 含菌样品含菌样品取自济南市西郊小清河河道污泥土壤2.2 培养基（1）富集培养基[5] ：牛肉膏5.0g/l、nacl 5.0g/l、k2hpo4 1.0g/l、kh2po4 0.3g/l、桔皮粉 20.0 g/l，ph 7.0。
（2）固体初筛培养基[6-7]：k2hpo4 1.0g/l、mgso4 0.5 g/l、nano3 3.0 g/l、feso4 0.01g/l、果胶2.0 g/l、琼脂15.0g/l、ph7.0。
（3）保存培养基[5]：桔皮粉2.0 g，用100ml蒸馏水煮沸30min，4层纱布过滤后定容至100ml，加入牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g、nacl 0.5g、k2hpo4 0.1g、kh2po40.03g、加琼脂2.0g煮沸，ph7.0。
产原果胶酶菌株的筛选及其产酶条件优化
Screening of strain producing protopectinase and optimizing the fermentation conditions
TIAN Ya-hong
(College of Life Science, Hebei United University, Tangshan 063000)
从土样中分离得到4株对底物有作用活性的 产酶菌株，各菌株的产酶情况如图1所示。编号为 WJ-2的原果胶酶活性明显高于其他菌株，所以选 用此菌株作为原果胶酶的实验菌株。观察菌落特 征，如图2所示。
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鲜甘薯渣为实验室提取淀粉和甘薯蛋白后剩 余残渣，于60 ℃烘干，备用。 豆粕粉：市售；原果胶：六偏磷酸钠洗涤法 制备[2]；其他化学试剂均为分析纯。 1.2 主要仪器 台式电热干燥箱、电子天平：天津泰斯特仪 器有限公司；YXJ-1离心机：江苏市金坛中大仪 器厂；TDA-8002电热恒温水浴锅：余姚市东方电 工仪器厂。 1.3 培养基 菌种筛选培养基：察氏培养基；产酶培养 基：豆粕粉1 g，K2HPO4 3.8 g，KH2PO4 0.2 g，水 100 mL，pH5.0~6.0，160 r/min。 1.4 菌种的分离及筛选 1.4.1 菌种来源 自唐山市水果批发市场一长期倾 倒腐烂水果的土壤中分离纯化得到。 1.4.2 菌种的分离及筛选 经稀释分离法筛选出 单菌株，进一步分离纯化后，接种发酵后测其原 果胶酶酶活。选取高酶活性的菌株接至察氏平板 内，观察菌落特征。 1.5 1 方法 粗酶液制备 将发酵液于常温下4000 r/
收稿日期：2011-10-19 基金项目：河北省唐山市科技局项目(10120201c)。 作者简介：田亚红(1979—)，女，河北无极人，硕士，讲师，主要从事发酵工艺优化的研究工作。
大曲中产果胶酶微生物的分离鉴定及其产酶活力评价研究
理论研究
ＤＯＩ：１０．１９３９２／ｊ．ｃｎｋｉ．１６７１７３４１．２０２００９２２５
大曲中产果胶酶微生物的
分离鉴定及其产酶活力评价研究
马美玉
淮北师范大学信息学院生物工程 Байду номын сангаас徽淮北 ２３５０００
摘 要：为研究大曲中微生物的组成，分析产果胶酶的特征采取研究的方式，研究泸州老窖酿酒大曲中微生物的分离鉴定情 况。运用两种霉菌测定酶活筛选出活力最高的霉菌。一直以来中国传统发酵技术的运用，广泛在调味品行业、酿酒行业，在饮食 上有非常深厚的影响。白酒酿造的时候会以“大曲”为发酵剂进行发酵，大曲含有众多的微生物和酶。但是在目前人们对酶的认 识还极度缺乏，因此对大曲中产果胶酶微生物的分离鉴定及其产酶活力评价研究有很重要的意义。
关键词：大曲；产果胶酶；微生物；分离鉴定；产酶活力
国内目前对大曲中的微生物以及所含有的酶系认识还需 要加强，由于认识不够完善和系统，因此在微生物领域还需要 加强研究来补充这个领域内的空白。只有做好研究之后才可 以更好的利用大曲，运用大曲酿酒是国内的传统工艺，泸州老 窖是典型白酒的代表，在国内有很重要的地位，由于发酵工艺 和制作工序独特老道，因此此酒有独特的香气和口感，研究的 时候从白酒中分离鉴定产果胶酶微生物进行系统合理的研究， 整理出相关的笔记为微生物的运用奠定理论基础。
１试验分析 １．１分离微生物 语言稀释法和划线分离的方式从大曲中分离出 ２０株微生 物，细菌 １５株真菌 ５株分别做好标记，其中真菌中有三株为耐 热均，分离之后的菌保存与８０℃的试验内以防后续使用。 １．２测定果胶酶 测定果胶酶酶活，运用 ＤＮＳ发测定上述菌株中的产果胶酶 活力，以标准曲线换算酶活力单位后测得所有的酶都有产果胶 酶的能力，其中有两株产酶能力高于其他株，分别为一株真菌、 一株细菌。 １．３高产果胶酶 通过对产果胶酶能力高的真菌、细菌分别运用 ＩＴＳ序列进 行 ＰＣＲ扩增得出产物，产物在 ０．０１（％）的琼脂糖凝胶电泳确 认之后送 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司进行测序得出结果，对比真菌和细菌 的最终结果，最 终 得 出 细 菌 与 鹑 鸡 肠 球 菌 之 间 的 相 似 度 高 达 ９９％，真菌与湿热子囊菌之间的相似度为百分之百。 １．４细菌产果胶酶 在不同的环境下，ＰＨ对酶的可解离基团解离状态会产生 很大的影响直到影响酶的催化活性，因此测定酶的特定 ＰＨ环 境值，对酶的合理生产尤为关键。字试验中针对细菌的产生的 产果胶酶进行 ＰＨ环境值测定，最终的结果表示细菌可以适应 对方 ＰＨ值为 ３．０，属于酸性。除了 ＰＨ之外温度的影响也很重 要，测定了细菌的最适反应温度，测定出在 ５０℃的时候酶活性 最为活跃，低于 ５０℃的时候酶活随着温度的升高而升高，５０℃ 为巅峰值，超过之后酶活降低。但是在 ６０～７０℃之间酶活存在 回升的情况。把处于不同 ＰＨ环境下的缓冲液进行处理之后的 产果胶酶放置在 ３０℃的情况下保温 １ｈ，取样在一定的倍数下 稀释后测定酶活，与没有处理的酶进行对照评价 ＰＨ的稳定性。 最终结果显示细菌具有良好的稳定性，在 ＰＨ＝３、５～１１之间酶 活力为 ４０％［１］。 将产果胶酶放置在不同的温度水浴锅中保温 １ｈ之后取 样，按照一定的倍数稀释后在合适的条件下测定酶活，与 １００％ 未处理过的酶液进行对照评估热稳定性。最终的结果显示在 ３０℃ ～６０℃之间热稳定性能良好，再这样的环境下保温 １ｈ后 酶的剩余酶活力仍旧保持在 ５０％以上。但是超过 ５０℃之后酶 活力明显下降，６０℃的时候酶活力为 ２０％。
2020届高中生物一轮复习人教版 发酵工程作业含答案
2020届一轮复习人教版发酵工程作业1．做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是()A．高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖B．倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上C．为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落D．用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上解析：选D在高压灭菌的操作过程中，加热结束后应让灭菌锅内温度自然下降，待压力表的指针指到零时，打开放气阀，旋松螺栓，打开盖子。
倒平板时，用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是完全取下放到一边。
接种环经火焰灼烧灭菌后应在火焰旁冷却后，再用其挑取菌落。
在微生物的培养中，一般将培养皿倒置，在皿底上用记号笔做标记。
2．(2019·滨州模拟)微生物培养过程中，要十分重视无菌操作。
现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染。
请分析下列操作中错误的是()①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢②接种操作要在酒精灯火焰附近进行③无菌繁殖脱毒苗时，植物的外植体要进行消毒④家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌⑤培养基要进行高压蒸汽灭菌⑥加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌A．①③B．②④C．③⑤D．④⑥解析：选D无菌操作包括消毒和灭菌。
需进行消毒处理的有植物的外植体及操作人员的双手等，需进行灭菌的有器皿、培养基、添加剂(指示剂或染色剂)等。
煮沸可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，属于消毒；为防止空气中杂菌污染，接种操作要在酒精灯火焰附近进行；家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能灭菌；培养基常进行高压蒸汽灭菌。
故④⑥操作错误。
3．(2019·乐山联考)下列关于有关传统发酵技术的叙述，正确的是()A．在果酒的制作过程中，应先去除葡萄的枝梗，再进行多次反复冲洗，这样才可以洗得彻底B．果酒、果醋的发酵装置中，充气口的作用是在发酵时连接充气泵进行充气，排气口的作用是在酒精发酵时排出二氧化碳C．豆腐上长满毛霉后，需加盐腌制8天左右，这样可以抑制微生物的生长，避免豆腐变质，又能使豆腐析出水分，使豆腐块变硬D．制作泡菜时要选火候好、无裂纹、无砂眼、盖子吻合好的坛子，需要加水密封，目的是隔绝空气，抑制细菌繁殖解析：选C在果酒的制作过程中，应先冲洗葡萄，然后再去除葡萄的枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会；冲洗以洗去灰尘为目的，不能多次反复冲洗，以防洗去附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。
果胶酶详细介绍
1、果胶酶【简介]】果胶酶由黑曲霉经发酵精制而得。
外观呈浅黄色粉末状。
果胶酶主要用于果蔬汁饮料及果酒的榨汁及澄清，对分解果胶具有良好的作用。
【PH值特性】作用PH：2.5-6.0，最适作用PH3.5。
【温度特性】作用温度为15-55℃左右。
最适作用温度为50℃。
【应用范围】①果浆用酶：②果汁用酶：【贮存】本品最佳贮藏条件为4-15℃，一般为室温贮藏，避免阳光直射。
果胶酶本质上是聚半乳糖醛酸水解酶,果胶酶水解果胶主要生成β-半乳糖醛酸,可用次碘酸钠法进行半乳醛酸的定量,从而测定果胶酶活力2、果胶酶产品是采用国际公认卫生安全的优良菌种，应用最先进的代谢调控技术，自然状态下纯种发酵、多级膜精制而成的新一代果胶酶产品。
果胶酶能大大增加压榨和离心分离的能力，节能降耗，提高出汁率10－30％。
能迅速澄清果蔬汁，使果蔬汁更透明，超滤更简洁、更经济。
能非常有效地降解果胶以及其他导致混浊的各类物质，保证产品良好的色值及澄清度，提升果蔬汁感官品质。
增色加香，提升感官质量。
能有效预防产品的后浑浊，保证果汁货架储存期的稳定性。
3、由黑曲霉经发酵精制而得。
外观呈浅黄色粉末状。
果胶酶主要用于果蔬汁饮料及果酒的榨汁及澄清，对分解果胶具有良好的作用。
用途：酶制剂【应用范围】①果浆用酶；②果汁用酶。
【贮存】本品最佳贮藏条件为4-15℃，一般为室温贮藏，避免阳光直射。
果胶酶本质上是聚半乳糖醛酸水解酶,果胶酶水解果胶主要生成β-半乳糖醛酸,可用次碘酸钠法进行半乳醛酸的定量,从而测定果胶酶活力4、果胶酶：果胶酶由黑曲霉经发酵精制而得。
外观呈浅黄色粉末状。
作用PH：2.5-6.0，最适作用PH3.5。
作用温度为15-55℃左右。
最适作用温度为50℃。
果胶酶主要用于果蔬汁饮料及果酒的榨汁及澄清，对分解果胶具有良好的作用。
5、本产品采用我公司独有的专利技术“果胶酶工业生产方法”和优秀的菌种生产，活力高、能力强。
【酶活定义】在45℃，pH值=9的条件下，1分钟使聚半乳糖醛酸裂解产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸的酶量。
果胶酶活性测定实验报告
一、实验设计实验序号实验三实验名称特定产物工业生产菌种发酵试验时间2010年13日-23日实验室基础生物2（121）一、实验目的1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；2、了解酶学性质的研究.3、了解影响果胶酶对果汁澄清效果的各种因素二、实验与原理1、果胶酶概况（1）、果胶质：是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖，是一类高分子碳水化合物，它的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。
（2）、果胶酶：是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中。
（3）、产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌，但目前商品果胶酶多数来自霉菌。
（4）、果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。
2、果胶酶的酶活测定方法（1）、粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。
（2）、脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。
（3）、次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。
（4）、还原糖法（DNS法）：根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种还原糖，与3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。
3、微生物发酵生产产品受以下条件制约：（1）、培养基成分：C源、N源、无机盐、水和生长因子（2）、培养条件：温度、pH、溶解氧等（3）、附加条件：诱导物、表面活性剂等4、酶催化反应的进行受多种因素的影响：底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂、抑制剂三、设备与材料（一）、培养基1、菌种筛选使用培养基（1）、基本培养基:果胶1% 、磷酸氢二钠0.5%、蛋白胨1%、pH4.5、琼脂2.0%。
（2）、分离培养基：果胶0.5%、磷酸氢二钠0.5%、琼脂2.0%、H4.5。
一种果胶酶生产菌株的分离及其产酶条件优化
株， 并将 分离得到的菌株在摇瓶发酵 培养 、 测定其酶活力 ， 其发酵 培养基 的初始 ｐ 最适 温度 、 Ｈ、 最适接 种量及
发酵周期进行初步研究． 结果表 明 ： 经过筛选得到 的产果胶 酶菌株在发 酵培养基 的初 始 ｐ Ｈ为 ７ ０ 培养 温度 ．、
为３ ３℃ 、 接种量为 ３ ％ 、 ０ 发酵周期为 ５ ６ｈ时， 此菌株产酶的酶活力最 高 ， 化后 的条件 大大提高 了菌株的产 优
蛋 白胨 质 量 分 数 １ ， 化 钠 质 量 分 数 ０ ５ ； ％ 氯 ． ％ 发 酵 培养基 ： 胶质 量 分 数 ０ ５ ， 白胨 质 量 分数 果 ．％ 蛋
１ ， 化钠 质量分 数 ０ ５ ％ 氯 ． ％．
１２ 方法 ．
尽管 自然 界 中天 然果 胶 酶 广泛 存 在 于 动植 物
第３ ４卷第 ４期
２１年 ０ ０２ ４月
武
汉
工
程
大
学
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报
Ｖｏ． ４ Ｎｏ ４ １３ ． Ａｐ ． ２ １ ｒ ０２
Ｊ Ｗ ｕ ａ Ｉｓ． Ｔ ｅ ． ． ｈ ｎ ｎｔ ｅ ｈ
文章 编 号 ：６４— ８ ９ ２ １ ）４— ０ ５ ４ １７ ２ ６ （ ０２ ０ ０ １ —０
污 水处 理池采 集 土样． １ １２ 试 剂与 仪 器 ．．
产 ）Ｄ Ｓｐ 计 ， ， Ｎ ，Ｈ 电子天 平 ，０ １型振 荡愠 温 培 养 ２０
收 稿 日期 ：０２— ３—１ ２１ ０ ５
１２ １ 筛选路 线 ．． 菌 种保 存 ． １２２ 筛选方 法 ．．
采 样 土样 一 富集 培养 一 初
筛 培养 一复 筛培 养一 种 子罐 培 养一 发 酵罐 培 养一 ａ ．富集 培养 ： 将采 集 到 的土
黑曲霉WZW001液态发酵产果胶酶的工艺条件优化
于水果 与农 副产 品加工 中 ．对 于提 高果汁 的 出汁 率， 改 善过滤 效果 及澄清 作用效 果显 著 果胶 酶
Ｐｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｃ ｏ ｎｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｐｔ ｉ ｍｉ ｚ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐｅ ｃ ｔ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ ｂ ｙ ｓ ｕｂ ｍｅ ｒ ｇ ｅ ｄ
ｆ ｅ ｒ ｍｅ ｎｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗｉ ｔ ｈ Ａｓ ｐｅ ｒ ｇ ｉ ｌ ｌ ｕ ｓ ｎ ｉ ｇｅ ｒ Ｗ ＺＷ Ｏ ０ １
ｔ ｅ ｍｐ ｅ ｒ ａ ｔ ｕ ｒ ｅ ３ ０ ℃ ．ｓ ｅ ｅ ｄ ｖ ｏ ｌ ｕ ｍｅ ２ ｍＬ ／ １ ０ ０ ｍＬ ．Ｕ ｎ ｄ ｅ ｒ ｔ ｈ ｅ ｓ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｏ ｎ ｓ ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ ａ ｃ ｉ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ ｐ ｅ ｅ ｔ ｉ ．
第４ ２ 卷第３ 期
发 酵 科 技 通 讯
黑 曲霉 ＷＺ ＷＯ ０ １ 液态发酵产果 胶酶 的工艺条件优化
吴鹏飞 ， 魏 春， 沈 江伟 。 徐 力， 汪 钊
（ 浙 江 Ｔ业 大 学 生 物 与 环境 １ ＿ 程学院 ， 浙江 杭州 ３ １ ０ ０ １ ４ ）
摘
要 ：采用 菌株 黑曲 霉 ＷＺ Ｗ０ ０ １ ，通过 实验探 索 了该 菌株 液 态发 酵 生产 果胶 酶 的 工艺条
ｎａ ｓ ｅ ｒ ｅ ａ ｃ ｈ ｅ ｄ ５ ４． ６ ５ Ｕ／ ｍＬ，ｉ ｍｐ ｒ ｏ ｖ ｅ ｄ ４５ ． ２％ ｗｈ ｅ ｎ ｃ ｏ ｍｐ ａ ｒ ｅ ｄ ｗｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｉ ｎ ｉ ｔ ｉ ａ ｌ ｐ ｒ ｏ ｃ ｅ ｓ ｓ ｃ ｏ ｎ ｄｉ ｔ ｉ ｏ ｎ
件 。经培 养基优 化及发 酵条件 优化 确 定该 菌株 发 酵培养基 的组 成为 （ ｇ ／ １ ０ ０ ｍＬ ） ： 麸皮 ４ ｇ ， 硫
黑曲霉液态发酵橘子皮产果胶酶工艺条件优化
黑曲霉液态发酵橘子皮产果胶酶工艺条件优化引言果胶酶（pectinase）是一种重要的酶类，在食品、饲料、纺织等工业中广泛应用。
黑曲霉（Aspergillus niger）作为一种产果胶酶的常见微生物菌株，已成为工业生产果胶酶的重要源。
本研究旨在优化黑曲霉液态发酵橘子皮产果胶酶的工艺条件，以提高果胶酶的产量和活性。
优化前的工艺条件在黑曲霉液态发酵橘子皮产果胶酶的传统工艺中，一般采用以下条件： 1. 发酵时间：48小时 2. 温度：30℃ 3. 初始pH：5.0 4. 容器容积：250 mL 5. 橘子皮浓度：5% 6. 静置转速：150 rpm优化工艺条件的步骤第一步：发酵时间的优化1.设置不同时间点的发酵时间，如24小时、36小时、48小时和72小时。
2.分别在以上时间点采集发酵液，检测果胶酶的产量和活性。
3.对不同时间点的结果进行比较，选择产量和活性最高的时间点。
第二步：温度的优化1.设置不同温度的发酵条件，如25℃、30℃、35℃和40℃。
2.在不同温度下进行发酵，采集发酵液，检测果胶酶的产量和活性。
3.对不同温度的结果进行比较，选择产量和活性最高的温度。
第三步：初始pH的优化1.设置不同初始pH的发酵条件，如4.0、5.0、6.0和7.0。
2.在不同初始pH下进行发酵，采集发酵液，检测果胶酶的产量和活性。
3.对不同初始pH的结果进行比较，选择产量和活性最高的初始pH值。
第四步：容器容积的优化1.设置不同容器容积的发酵条件，如100 mL、250 mL、500 mL和1000 mL。
2.在不同容器容积下进行发酵，采集发酵液，检测果胶酶的产量和活性。
3.对不同容器容积的结果进行比较，选择产量和活性最高的容器容积。
第五步：橘子皮浓度的优化1.设置不同橘子皮浓度的发酵条件，如2%、5%、8%和10%。
2.在不同浓度下进行发酵，采集发酵液，检测果胶酶的产量和活性。
3.对不同橘子皮浓度的结果进行比较，选择产量和活性最高的浓度。
果胶酶产生菌的筛选及其条件优化2
实验序号实验7 实验名称特定产物工业生产菌种发酵及应用性质研究（一）实验时间2011.11.15--12.15 实验室118一、实验目的：1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；2、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会运用微生物生态知识分离产酶微生物；3、掌握果胶酶活性测定的原理，学会果胶酶活性的测定方法；4、了解酶学性质的研究。
二、实验原理1、果胶质：果胶是植物中的一种酸性多糖物质，它通常为白色至淡黄色粉末，稍带酸味，具有水溶性，工业上即可分离，其分子量约5万——30万，主要存在于植物的细胞壁和细胞内层，为内部细胞的支撑物质。
果胶质是一类高分子碳水化合物，普遍存在与高等植物的细胞壁及细胞壁间作为结构物质。
2、果胶酶：分解果胶的一个多酶复合物，通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶。
通过它们的联合作用使果胶质得以完全分解。
天然的果胶质在原果胶酶作用下，转化成水可溶性的果胶；果胶被果胶甲酯水解酶催化去掉甲酯基团，生成果胶酸；果胶酸经果胶酸水解酶类和果胶酸裂合酶类降解生成半乳糖醛酸。
细菌、放线菌、酵母菌和霉菌都可以发酵产生果胶酶，但是目前商品果胶酶主要来自于霉菌。
果胶酶主要用于果胶的分解，在水果的加工、葡萄酒的生产、麻类脱胶和饲料方面。
3、果胶酶的酶活测定方法：①、粘度降低法：利用粘度计测量一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。
②、脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。
③、次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。
④、还原糖法（DNS法）：测定在一定反应时间内，水解果胶产生的还原糖的量。
根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸是一种还原糖，与3，5-二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。
4、影响微生物发酵的因素有很多；①、培养基的成分（营养物质及其浓度）例如：碳源的种类、氮源的种类、碳源的浓度、氮源的浓度、无机盐、水含量等；②、菌种接种的量；③、发酵条件：温度、PH、溶解氧等；④、附加条件：诱导物、表面活性剂等（5）、酶催化反应的进行也受到多方面因素的影响：底物浓度、酶浓度、温度、PH、激活剂、抑制剂。
黑曲霉HG_1发酵苹果渣生产果胶酶的工艺优化及部分酶学性质
菌种保存与培养采 用 PDA 培养 基: 马 铃薯 200g, 去 皮, 切 成 小 块, 加 水 1000ml 煮 沸 20min, 过 滤, 取 浸 汁, 加 水 补 足 1000ml,装, 灭菌 30min。
Abstr act: Objective: Optimize the culture medium and fermentation conditions of Aspergillus niger HG- 1 to produce pectinase from apple pom2 ace in solid state fermentation; and reveal some prime characteristic of the pectinase. Method: Monofactorial and orthogonal experiments were
摘要: 目的: 采用价格低廉的农业废弃物苹果渣为主要原料生产果 胶酶, 优化其生产 工艺, 并对果胶 酶的部 分酶学 性质进 行 研究。方法 : 以黑曲霉 HG- 1 为生 产菌种, 采用 单因 子实 验和 正交 试验 进行 固态 发酵。结 果: 最 适培 养基 为苹 果渣 10g、棉 粕
10g、( NH4) 2SO4 0. 2g、K2HPO4 0. 06g、初始水分含量 60% ; 最适发酵 条件为装 料量为 20g 干料P250ml 三角 瓶, 30 e 恒温培 养 48h, 果
果渣中分离获得, 具有较高的果胶酶产 量, 适 合以苹 果渣为 原 料进行生长繁殖; 苹 果渣产 自烟 台北方 安德 利果汁 股份 有 限 公司; 棉粕购自当地饲料市场。 1. 1. 2 试剂
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果胶酶产生菌的分离及其产酶条件优1 果胶酶产生菌的分离及其产酶条件优化
摘要:通过野外采集样品，从中筛选出两株产酶相对较高的菌株，并对其酶学
性质进行初步研究，探索其最适生长时间，生长的环境温度，最适ph，以及最适
接种量，并设计实验方案。
第一部分前言
果胶酶是一类分解果胶物质的多种酶的总称，主要包括原果胶酶，果胶脂酶，果胶裂解酶及多聚半乳糖醛酸酶四大类，因其能有效的分解果肉组织中的果胶物质,而广泛应用于食品加工、酿酒工业等方面。
此外，果胶酶在生物制药，生物污染防治，农产品加工，饲料等其他生物大规模产业也用途广泛，因而需求量也是日益增加，由于自然界中天然果胶酶广泛存在于动、植物体内，因产量较低而难以作为大规模提取，因此，寻求高效的果胶酶生产方法也更加重要，现阶段，采用微生物发酵，并从其代谢产物中提取果胶酶方法，已应用的日加成熟，各种高产、高效的菌株纷纷被筛选出来，而广泛应用于发酵生产。
一、果胶酶产生菌
(一)果胶酶产生菌的选育
据报到，在自然界中，已知的果胶酶产生菌多达40余种，其中多数为细菌和
霉菌，还有少数的放线菌、酵母菌。
1.材料和方法:
1.1实验材料:
采集果园土壤及腐烂的柑橘、桔子、甜瓜等水果腐烂的部分。
1.2培养基:
1.2.1富集培养基: 5%的葡萄糖，0.3%酵母膏，0.5%蛋白栋。
1.2.2选择培养基: 磷酸氢二钾0.01g，硫酸镁0.05g，硝酸钠0.3g，硫酸亚铁0.001g，果胶
0.5g，琼脂2.5g，水100ml，ph自然。
1.2.3液体培养基: 磷酸氢二钾0.01g，硫酸镁0.05g，硝酸钠0.3g，硫酸亚铁0.001g，庶糖
0.5g，水100ml，ph自然。
1.2.4土豆斜面培养基:20%土豆，20%葡萄糖，2%琼脂，ph自然
1.3菌株筛选方法
1.3.1筛选路线:采样增殖初筛复筛保存
1.3.2筛选方法
(1)增殖培养:将采集得的土壤及水果腐烂部分用无菌水稀释，搅拌充分后，静置5分钟，取上清液10ml至于50ml富集培养液中，30?,150r/min培养2-3天。
(2)菌株初筛:取富集液进行适当稀释，并涂布于选择培养基中，30?，培养3-4天，选取菌落形态较好的平板，加入0.1%的刚果红溶液，染色30min后，菌落周围有透明圈形成的即为产果胶酶菌株，观察透明圈产生快慢及其大小。
(3)菌株复筛:选取产透明圈的菌株，于选择培养平板上接种培养连续接种4-5代后，选取最优菌株，液体培养测其酶活力。
1.4酶活力测定
1.4.1半乳糖醛酸标准曲线的绘制
取1mg/ml半乳糖醛酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于试管中，补水至1ml加DNS试剂3ml，混合后于沸水中煮10分钟，冷却后定容至15ml，于分光光度计540nm波长下测吸光度(A)。
以吸光度为纵坐标，半乳糖醛酸量为横坐标，绘制标准曲线，二次重复试验的均值用最小二乘法拟合一元线性方程y=ax+b，求出吸光度与半乳糖醛酸量的关系。
1.4.2液体曲5000r/min离心取上清，
1.4.3 酶活力测定
取15ml离心管加入1%的果胶溶液0.8ml，50度预热3分钟，加酶液0.2ml，混合，50度水解10分钟，加DNS试剂3ml，混合后于沸水浴中10分钟，冷却定容至15ml，离心分离2000r 10Min,取上清10ml,空白调0，540nm下测定吸光度值。
酶活力单位计算
酶活力=(A*S*D*1000)/(0.2*10)
式中:A—测得吸光度
S—测得光吸收在标准曲线上对应的半乳糖醛酸量，mg数
D—酶液或酶粉的稀释系数
(3)酶活力单位定义:在本测定条件下，每分钟水解果胶产生1ug还原糖(以半乳糖醛酸计)所需酶量定义为一个酶活力单位(u)。
2.结果与分析
2.1 果胶酶产生菌种的筛选结果
初步筛选获得5株菌株，分别编号为A1 A2 A3 A4 A5 通过测量曲的果胶酶活力进行复筛，结果如下图
图初步筛选五种菌株酶活力比较
其中，A1、 A2两种菌种产酶活力相对较为接近，因此将对这两种菌株进行单独比较
2.2菌株产酶条件研究
2.2.1半乳糖醛酸量与吸光度的关系,如下图
2.2.2 发酵时间对两菌株产酶影响
在自然ph，温度30?，转速150r/min，接种量相同条件下，测量两菌株随时间变化，其酶活力大小的变化，结果表明，两酶的最适发酵时间为48-60小时，此时的产酶的量和酶活力都最高，如下图:
培养时间对产酶的影响
2.2.
3.发酵温度对两菌株酶活力影响
在自然ph，转速150r/min，接种量相同条件下，培养时间2天，两类菌株酶活力随温度的变化如下图，结果表明，两菌株最适的生长温度位于28-31度，此时
果胶酶的活力最大，超过31?时，酶活力有明显下降趋势，甚至无法生长，温度过低，则酶活力较低，如下图:
培养温度对产酶的影响
2.2.4 在培养时间(48h)、培养温度(30?)。
接种量相同的条件下，转速为
150r/min，不同的ph下两种菌种产酶的活力变化，从结果可以看出，两菌株的生长最适ph为6-7之间，即为自然ph条件下，两菌株有最高产酶效益，ph过高或过低皆会使两菌株生长受抑制，甚至无法生长。
如下图:
初始 Ph对产酶影响
2.2.5 在自然ph,温度30?，转速150r/min，培养时间为96h条件下，控制接种量为平时的10%、20%、30%、40%，两种菌株的产酶效果变化，从下图可以看出，接种量位于20-30%时，酶活力达到最高，接种量过低，菌株的生长时间较
长，酶活较低，而接种量过大时，刚造成短时间积累大量次级代谢产物而影响产酶效果，如下图:
接种量对产酶的影响
3结论
3.1平板涂布法，筛选出A1 A2 A3 A4 A5五种产果胶酶的菌株，初步确定A1 A2 为产酶较高的两株菌株。
3.2对A1 A2 进行酶学性质研究发现，如下表:
A1 A2
最适生长时间48 60
(h)
最适生长温度28 31
(?)
最适ph 自然自然
最适接种量(%) 20 30
优缺点 A1生长繁殖周期较短，具快速的生A2具长的生长期，所需培养温度也长期，同时生长的外界环境易于获较高，培养条件有些难度，但产酶
得，但产酶效益较低，酶学曲线波效益较高，总体酶学曲线稳定性较
动较大，稳定性差好，具长的稳定期。
1. Ph=3.5柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液:柠檬酸7.355g+柠檬酸钠4.41g,定容于500ml容量瓶中,
2. 0.1%半乳糖醛酸溶液:0.1g烘干的半乳糖醛酸粉末定容于100ml容量瓶中,
3. DNS试剂:3,5二硝基水杨酸10g+加NaoH16g,酒石酸甲钠
300g,500ml水定容于1L容量
瓶中,十天后使用,
4. 1%果胶:1g加适量缓冲液,热水浴50度,加热至糊状转入100ml容量瓶中,补缓冲液至
100ml,有效期3天。