细胞电转染实验注意事项(engreen)
Neon电转染操作步骤
Protocol for Neon transfection system (100 μl Tips) 电穿孔技术的原理电穿孔技术是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性,达到将DNA导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。
该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移,另一方面应用于细胞融合,制备杂交细胞和动物克隆等影响电穿孔效率的因素电场强度:电压太低时,细胞膜的改变不足以允许DNA分子通过,而电压过高时又会造成细胞的不可逆损害。
对于大多数哺乳动物细胞而言,250~2500V/cm的电压可获得有效转染[2,3]。
电脉冲形状和长度:电脉冲形状主要有指数衰减式和方波两种,一般需20~100毫秒。
缓冲液:通常使用甘露醇和蔗糖等非离子缓冲液,但有报道认为HEPES缓冲液的转染效率更高,血清也可以提高转染效率[4]。
其它诸如转染温度、DNA浓度和构象等均会对转染效果产生影响。
1.Cultivate the required number of cells (5×105-2×106 adhere cell per each 100ul Neon Tip),the cells should be 70-90% confluent on the day of experiment. 实验前培养足够量的细胞（对于100ul的tip，每个tip需要5×105-2×106 贴壁细胞，可以根据实际情况调整），并使其在实验当天达到70%-90%的汇合度。
2.Pre-warm an aliquot of culture medium containing serum, DPBS and so on.预热实验所需的culture medium，DPBS等。
3.Prepare 6-well plate by filling the wells with 2.0 ml of culture medium containing serum andsupplements without antibiotics and pre-incubate plate in a humidified 37℃/5% CO2 incubator. 准备6孔板，在每孔中加入2.0 mL 不含抗生素的正常培养基，放到倒培养箱中预热。
细胞如何做好转染实验及提高实验效率
细胞如何做好转染实验及提高实验效率①从健康细胞开始Ⅰ转染实验前，细胞解冻后传代3–4次。
这使得细胞从解冻过程中恢复过来，并恢复正常的生长速度。
Ⅱ仅使用活性>90%的细胞——使用台盼蓝染色可轻松测定细胞活性。
Ⅲ定期传代细胞，切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。
如果让细胞长到汇合状态，可能会改变细胞的生长速度以及形态。
a. 请在汇合率达到90%之前对细胞进行传代。
我们建议您使用胰酶替代物Cellstripper™试剂(Corning 25-056-CI)使细胞脱壁。
Cellstripper™试剂可于室温下存储在通风橱中。
可通过添加过量的Cellstripper™来跳过PBS洗涤的步骤，然后吸弃全部液体，仅留可覆盖瓶子表面的液体。
b. 传代条件取决于所用的细胞系。
部分经验法则：对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK-293)，按1：10的比例分瓶。
对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)，按1：5的比例分瓶。
Ⅳ保留冻存的细胞系，并定期解冻新细胞。
传代次数高(>30–40)时，细胞的生长速度和形态会改变。
②进行实验之前，请先规划您的实验。
务必要熟悉实验方案、确定所需的材料量，并在开始实验前确认所需的一切物品条件均已齐备。
Ⅰ开始前，设计好铺板路线图，标注好每次处理或实验条件。
Ⅱ计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认有足够的下列材料：TransfectGRO减血清培养基(Corning 40-300-CVR)，Lipofectamine® 2000 或Lipofectamine® LTX试剂，以及DNA(0.5–1 µg/µL)。
③转染时，请使用优质DNA。
Ⅰ使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备DNA。
Ⅱ通过测量OD 260/280值来确定DNA纯度，测得的OD值应介于1.7–1.9]之间。
数值过高或过低均说明有杂质，不宜用于转染实验。
Ⅲ在无DNA/RNA酶的水或TE中稀释DNA。
Entranster-E：电转染过程中的影响因素
一电转的简介电穿孔转染，作为物理方法的一种，不仅能将DNA、RNA，还能将抗体、酶及其他生物活性分子转入细菌、酵母、动物细胞和植物细胞。
它是一种高效。
简便的基因转移系统，具有其他转移方法无法比拟的优越性，如操作简便、快捷，可重复性强，转染率高，适用广谱等，尤其对目前一般认为难转的悬浮培养细胞也能获得较高的转染。
二电转原理电穿孔法是通过电场作用于细胞几微秒到几毫秒之后，在细胞膜上暂时形成小孔或开口，把大分子如DNA等导入细胞并最终进入细胞核的技术。
其过程简述如下：首先在电击过程中，细胞膜上出现穿孔，质粒在电泳力的作用下与细胞膜接触，并在细胞膜上电穿孔的区域形成一种可转移的复合物。
再次电击后，质粒脱离复合物并扩散至细胞质内，开始瞬转；同时小部分质粒进入核内与染色体整合，开始稳转。
一旦DNA扩散至细胞，膜上小孔会关闭。
三电穿孔转染条件的选择1 电场参数电场是电转染的重要因素，细胞在电场的作用下，膜通透性增加或是形成小孔，以完成转染过程。
因此电场强度是应该被优化的主要参数。
电场强度不能过高，过高会增加细胞的死亡率；也不能过低，过低不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔。
因此，一个适宜的电场强度至关重要。
不同细胞系具有不同的最佳场强值，其确定方法除了实验直接测定比较不同场强下转染率的高低外，还可以采取较为简便的间接法。
文献显示存活率在50%左右的电场参数为理想参数，故可间接测定存活率来确定最佳场强值。
2脉冲过程1）脉冲波形脉冲波形主要分为两种：1、方波脉冲；2、指数递减波脉冲。
方波脉冲是指：电压瞬间升至预设电压，保持电压放电，然后瞬间终止放电。
一般哺乳动物细胞电转染时选择方波脉冲，有较高的转染效率和细胞存活率。
指数递减波脉冲是指：先对电容充电，然后让电容完全放电，其电压变化呈指数递减。
一般这种波形的脉冲电转染适用于细菌、酵母菌、昆虫细胞。
2）脉冲时间脉冲时间的选定主要取决与脉冲波形。
在方波脉冲中，脉冲时间可直接设定。
Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤 注意事项
Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤注意事项2010-07-10 16:16Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。
已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。
特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA 以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。
下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA 混合。
保温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。
在室温保温20分钟。
关于细胞转染实验，这些你应该知道
关于细胞转染实验，这些你应该知道细胞转染目前已经成为研究和控制真核细胞基因表达的重要手段。
本文整理了一些关于转染实验前的准备工作及一些实验过程中的小贴士，希望这些信息能够帮助各位科研君们做好转染实验及提高实验效率。
① 从健康细胞开始Ⅰ 转染实验前，细胞解冻后传代3–4次。
这使得细胞从解冻过程中恢复过来，并恢复正常的生长速度。
Ⅱ 仅使用活性 >90%的细胞——使用台盼蓝染色可轻松测定细胞活性。
Ⅲ 定期传代细胞，切勿让细胞长到汇合状态或过度生长。
如果让细胞长到汇合状态，可能会改变细胞的生长速度以及形态。
a. 请在汇合率达到90%之前对细胞进行传代。
我们建议您使用胰酶替代物Cellstripper™试剂(Corning 25-056-CI)使细胞脱壁。
Cellstripper™试剂可于室温下存储在通风橱中。
可通过添加过量的Cellstripper™来跳过PBS洗涤的步骤，然后吸弃全部液体，仅留可覆盖瓶子表面的液体。
* 非酶类细胞分离溶液，其配方是螯合剂的专利配方，可温和分离组织培养物的贴壁细胞。
性质比胰酶更温和。
b. 传代条件取决于所用的细胞系。
部分经验法则：对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK-293)，按1：10的比例分瓶。
对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)，按1：5的比例分瓶。
Ⅳ 保留冻存的细胞系，并定期解冻新细胞。
传代次数高(>30–40)时，细胞的生长速度和形态会改变。
② 进行实验之前，请先规划您的实验。
务必要熟悉实验方案、确定所需的材料量，并在开始实验前确认所需的一切物品条件均已齐备。
Ⅰ 开始前，设计好铺板路线图，标注好每次处理或实验条件。
Ⅱ 计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认有足够的下列材料：TransfectGRO减血清培养基(Corning 40-300-CVR)，Lipofectamine® 2000 或Lipofectamine® LTX试剂，以及DNA(0.5–1 µg/µL)。
细胞电转实验基本原理及步骤
细胞电转实验基本原理及步骤转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术，是我们完成项目的最基本方法。
转染大致可分为3种途径：物理介导（电穿孔法、显微注射、基因枪）、化学介导、生物介导（病毒介导）。
细胞电转染一、实验原理：细胞电转染（电转），也叫细胞电穿孔，是用短暂的高场强电脉冲处理细胞，沿细胞膜的电压差异会让电流可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促，从而使外源大分子物质DNA、RNA、蛋白质、一些小分子等进入细胞膜内部。
二、影响因素1. 细胞状态为保证电转后细胞的存活率，最好选取处于对数生长期的细胞。
因为处于对数生长期的细胞分裂更为旺盛，细胞膜表面结构的致密性与稳定期的细胞相比较差，因此在电转后，细胞膜的恢复能力更强，从而提高电转后的细胞存活率。
同时，处于有丝分裂期的细胞会更容易接受外源物质，有利于提高细胞的转染效率。
2.电转参数选择合适的电转参数对于电转实验非常重要，电转参数包括电压（500v-1900v）、脉冲（10 ms-45 ms）、次数（1-5），一般都分布在这一区间内。
参数过低，不能增加膜的通透性或在膜上形成小孔，外援物质无法进入细胞内达到转染的目的；参数过高，细胞膜发生不可逆破碎，细胞死亡率增加，转染失败，因此在电转染实验中合适的电转参数尤为重要。
不同细胞的形态、特性及耐受度等都不同，实验前需要我们先通过电转预实验来摸索出最合适的电转参数，而后再进行正式试验。
3.其他电击会对细胞造成一定程度的伤害，而具有细胞膜修复成分的电转缓冲液可以将电击对细胞的损伤降到最低，从而降低转染后细胞的死亡率，提高转染效率。
三、电转预实验实验目的：在开展正式实验前摸索出最合适的电转参数。
实验流程1.实验前准备：电转杯、电转枪、电转Tip头（无菌）；处于对数生长期的细胞（细胞状态良好，至少维持合适密度生长2代，未发生过汇合）；2.设置若干个实验组，贴壁细胞建议1×105个/组、悬浮细胞建议2×105个/组；以贴壁细胞为例：弃去培养上清，用PBS轻柔冲洗细胞，抽净PBS，加胰酶消化细胞，待细胞脱落后加完全培养基终止消化，轻柔的吹打细胞悬液，尽量形成单细胞悬液，计数，取细胞与1.5 EP管内，离心，PBS清洗一遍。
细胞转染的最全知识介绍，收藏这一篇就够了······
细胞转染的最全知识介绍，收藏这一篇就够了······定义：细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。
应用：在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中。
简介：转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。
一、转染的途径大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类：1.物理介导：电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例。
2.化学介导：方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术。
3.生物介导：方法有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。
二、常规转染技术：1.瞬时转染（transient transfection）：外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其他调控元件的分析。
一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24~72h小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统和荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。
2.稳定转染（Stable transfected）：外源DNA既可以整合到宿主细胞中，也可能作为一种游离体（episome）存在。
实验室祖传的转染攻略请收好
实验室祖传的转染攻略请收好不论是刚进实验室的新人，还是熟门熟路的老鸟，相信只要做过转染，或多或少都遇到过一些糟心事儿，要么细胞不生长，要么压根儿没转入。
那些次次转染都成功的，怕不是天选之子，就是幸运星本尊。
当然，大部分人靠运气吃饭是会饿死的，只有提高实验水平才是真· 出路。
下面我们就来详细的了解一下转染，以及它「毁」人不倦的那些坑。
什么是转染？转染是指将外源 DNA 或 RNA 片段导入到真核细胞而获得新的遗传标志的过程。
一般转染技术包括两大类：瞬时转染和稳定转染。
就瞬时转染而言，转染的DNA/RNA 没有整合到宿主基因组中，所以外源DNA/RNA 将会在后续的细胞有丝分裂过程中丢失。
外源基因的表达是短暂的，通常只持续几天，但表达效率高，导入的高拷贝DNA/RNA 会产生高水平的蛋白表达。
对于稳定转染，通常我们又称为永久转染，外源 DNA 能整合到宿主基因组，因此转染的宿主细胞及其子代细胞的基因组中会同时保留外源 DNA 片段。
外源基因整合到染色体中的概率很小，单拷贝或低拷贝稳定整合的 DNA 会导致低水平的蛋白表达。
稳定转染的转染效率只有瞬时转染的 1~10％，且适用于使用带有诱导型启动子的载体研究。
常见的转染方法常见的转染手段有物理方法、化学试剂和生物介导三大类。
如电转染、显微注射、磷酸钙共沉淀、病毒转染等。
不同的转染方法各有千秋（见表1），使用哪种方法需要综合考虑很多因素，如细胞类型（原代细胞 / 细胞系），细胞来源（体内 / 体外 / 离体），外源基因负载量，转染效率，安全性，成本，时间等。
表 1. 常用转染方法及其特点概述（部分）转染的影响因素转染过程中许多因素会影响转染效率：如细胞种类、细胞密度；质粒大小、质粒纯度；血清；抗生素；转染试剂等。
转染实验中，以下几个因素需多加注意。
1. 转染前的细胞状态和密度转染时细胞密度以70~90%（贴壁细胞）或2×106~4×106细胞/ mL（悬浮细胞）为宜，细胞密度过高会严重影响细胞状态（周期进程阻滞，凋亡增加等）。
进行转染实验时需要注意的因素
转染——让克隆的核酸进入真核细胞中，已经成为研究和控制真核细胞基因表达的重要手段。
比如表达纯化特定的蛋白；鉴定一个基因的生物学特性；突变分析；研究基因表达对细胞生长的影响，研究基因表达的调控机制等等，等等。
如今广义的转染不单包括了DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。
很多因素会影响转染效率，细胞株本身啦，细胞培养环境啦，转染的DNA、RNA或者蛋白的质量和特性啦，转染方法啦，等等。
每个转染高手也必然有自己的独门心经，只可惜大家都为实验或者生活而疲于奔命，没有几个人愿意静下心情来仔细总结经验汇集成文字——那些曾经用无数失败的痛苦烦恼换回来的宝贵经验，那些曾经以为会永远铭刻于脑海的教训，随时间的流逝而终于渐渐褪色，到模糊。
即使偶尔有珠玉掩埋于浩瀚的口水中，也难以汇串成珠。
试剂盒的盛行，让实验更快，更简单，也更机械化，相信更多人更愿意先抓起Protocol 123地往下做，直到碰壁再苦思原因。
其实等碰得遍体鳞伤回头一看就会醒悟，很多坑，只要事前注意了就不会陷进去的。
DNA转染后，转入基因的表达可以在1－4天内检测到——仅有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并最终输出mRNA到细胞质进行蛋白合成。
几天内，大部分外源DNA 会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了。
因此转染也可以分为瞬时转染和稳定转染。
瞬时转染（transient transfection）指的是转染的核酸不整合到染色体上，结果是短暂的高水平表达，可在24—96小时内检测表达效果，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。
瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少，但因为DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，不长久也不稳定。
超螺旋质粒转染更倾向于瞬时表达。
瞬时表达适合研究启动子等调控元件——不过，诱导型的启动子除外。
稳定转染，就是转染的质粒DNA整合到染色体上，或者相当于附加子（episome）可持续存在，使得转染的细胞可长期表达。
(完整word版)电转染标准步骤
电转染标准步骤
1.清洗电转杯，将电转杯置于75%酒精中浸泡2小时，然后在紫外灯下照射后即可使用。
2.电穿孔前一天，以合适密度传代细胞，使细胞在转染前出于对数生长期。
对于原代培养细胞，一般培养2-3天后，细胞单层融合度可以达到70-80%，即可开始试验。
3.PBS洗细胞2次后，胰酶消化细胞2min，待细胞变圆后，用完全培养基终止消化。
4.轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1200rpm室温离心5min。
5.完全弃去上清，根据细胞数量，加入适量的电转缓冲液重悬细胞（一般为0.5-0.6ml左右），并上下吹打均匀。
6.加入适量相应浓度的待转染核酸至相应的终浓度（质粒为20ug/ml，SiRNA的终浓度为100nM），上下吹打均匀。
若以0.5ml计算，所需质粒为0.5×20=10ug。
7.将含有相应浓度核酸的细胞悬液转移入相应规格的电转杯中，按照预定条件设置参数，进行电击操作。
（不同细胞电转前，需要进行预试验摸索电转的最佳条件，既要保证较高的转染效率，又要保证较高的细胞存活率。
经过实践摸索后得出，相应的最佳参数为：质粒：250V，10ms，1（最多2），0，4mm cuvette；SiRNA: 250V，5ms，1（最多2），0，4mm cuvette。
8.电击完成后，将电转杯置于恒温培养箱中8-12min，以使核酸充分进入细胞。
9.将电击杯从恒温培养箱中取出，接种细胞悬液于预热的培养基中，上下吹打均匀后，置于培养箱中正常培养。
10.正常培养4h，待细胞贴壁后，给细胞换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞。
11.培养24h后，即可进行细胞转染效率的检测或是进行细胞的实验处理。
原代细胞电转染
原代细胞电转染
原代细胞电转染是一种常用的转染方法，具有转染效率高、毒性低、方法简单、省时省力等优点。
但需要注意的是，原代细胞转染难度较大，因为不同类别的真核细胞具有不同的生长状态、细胞大小和细胞膜结构，所以转染参数以及可获得的最大转染率也不尽相同。
电穿孔转染不同的细胞需进行个别优化选择，获得的最优转染参数也显著不同。
以下是原代细胞电转染的一般步骤：
1. 细胞接种：在转染前一天接种细胞，使细胞在转染时密度在30%\~50%。
2. 准备转染溶液：将目的基因和载体用无血清培养基稀释。
3. 混合：将目的基因和载体混合，室温孵育5\~10分钟。
4. 电穿孔：将混合物加入培养的细胞内，进行电穿孔。
5. 培养：将电穿孔后的细胞放入培养箱中培养，检测基因表达效果。
需要注意的是，电穿孔转染需要使用特定的仪器和试剂，操作时应遵循厂家提供的操作说明。
此外，不同的细胞类型和目的基因可能需要不同的电穿孔参数和培养条件，需要进行适当的调整和优化。
293t细胞电转染条件
293t细胞电转染条件293T细胞是一类广泛用于在生物医学研究中表达重组蛋白质的细胞，其具有易于转染的优点，可以通过电转染等方法实现高效率的转染。
以下是293T细胞电转染的一些常见条件及注意事项。
1.细胞密度：293T细胞在转染前应达到80%的密度，这可以提高转染效率。
密度过高或过低均会影响转染效果。
2.质粒DNA：选用高质量的质粒DNA，应避免污染。
DNA质量不好、含盐离子等污染物质均会导致转染效率下降。
3.转染试剂：电转染试剂通常由DNA、细胞和电转染缓冲液组成，不同品牌的转染试剂组成可能不同。
4. 电穿孔仪：目前广泛采用的电穿孔仪为AMAXA品牌的Nucleofector®，根据细胞类型及目的有不同的穿孔条件，可以在AMAXA公司官网中查询。
5.转染时间：对电转染的转染时间尚无统一标准，需要结合实验室条件和试验要求等因素，进行参数优化。
6.电压和电容量：电压和电容量是影响转染效率的重要因素。
要根据细胞类型、质粒DNA和穿透液等试剂的要求进行调整。
7. 转染缓冲液：转染缓冲液是电转染的关键因素之一、目前常用的缓冲液有DMEM、Opti-MEM、PBS等。
应根据质粒DNA的要求选择合适的缓冲液。
8.孵育条件：在电转染后需要对细胞进行适当的孵育，以促进质粒DNA的表达。
9.转染后处理：电转染后需根据需要添加适当的选择抗生素，以筛选包含肿瘤抗原基因的细胞。
综上所述，293T细胞电转染具有高效、简单、经济且可重复的优点，成为目前最为常用的转染方法之一、在实验设计和参数优化时，需要注意选择合适的试剂和仪器，优化电压和电容等参数，合理选择转染后的处理及分析方法，以获得准确、可靠的实验数据。
Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤 注意事项
Invitrogen阳离子转染试剂Lipofectamine 2000细胞转染实验步骤注意事项2010-07-10 16:16Invitrogen的细胞转染试剂：Lipofectamine 2000Lipofectamine 2000是最为人熟知的转染产品之一。
已知可为517种细胞（见下面连接地址）提供高转染效率（表达转基因细胞的百分数）和活性（细胞抽提物中转入基因的酶产物活性）。
特点两个关键性特点使得Lipofectamine 2000试剂的转染步骤快速简便：（1）DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中，有血清也不怕（2）转染后不需要除去Lipofectamine 2000试剂，无需换培养基操作流程事实上Lipofectamine系列产品操作流程都是又快又简单：稀释DNA 以及Lipofectamine 2000，混合2种稀释液保温20分钟，加入培养细胞中孵育24－96小时检测结果。
下面是Invitrogen提供的详细流程和注意事项。
转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90%。
细胞铺板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。
对于每孔细胞，使用50μl无血清培养基（如OPTI-MEMⅠ培养基）稀释0.8μg-1.0μg DNA。
对于每孔细胞，使用50μl OPTI-MEMⅠ培养基稀释1μl-3μl LIPOFECTAMINE 2000试剂。
Lipofectamine 2000稀释后保温5分钟（在30分钟内同稀释的DNA 混合。
保温时间过长会降低活性。
）注意：即使Lipofectamine 2000使用OPTI-MEMⅠ稀释，细胞也可以使用D-MEM培养。
如果D-MEM做为Lipofectamine 2000的稀释液，必须在5分钟内同稀释的DNA混合。
混合稀释的DNA（第2步）和稀释的Lipofectamine 2000（第3步）。
在室温保温20分钟。
293细胞转染操作方法
每孔加入 DNA 的量 * 每孔 DNA 稀释液体 积 每孔 Entranster TM H 用量 * Entranster TM -H 稀释液体 积 每孔培养 基总量 96-well 0.25 μμ l 0.25 μ l 5 μ l 214 μ l 25 μ l- 500 μ l 12 well 2 μ g 25 μ l 2 μ l 25 -μwelll1/3m5l-6mm3μ g 50 μ l 3 μ l 50 μ l 2ml 60 mm/T25 flask8 μ g 125μ l 8 μ l 125 μ l 5ml 100 mm/T75 flask μμμμ 注意 :如用于同时共转染多种质粒 , DNA 的用量指每种质粒用量的总和 ,这时如 需得到较高转染 效率 ,建议将 DNA 的用量和转染试剂的用量同步提高 2-4 倍。 四 优化 由于 DNA 和转染试剂的用量比值是决定转染效率的重要因素 , 同时由于各实 验室质粒 的定量误差 ,质粒纯化程度不同以及细胞状态不同 ,造成不同细胞和实验室
第 3页 共 3页 稀释用溶液含血清或蛋白 建议采用 OPTI-MEM 或无血清 DMEM 稀释。
质粒表达系统毒性大 建议采用其他可靠质粒做阳性对照 ,比较转染结果 细胞密度太大 建议减少细胞数量 DNA 与转染试剂比例不佳 建议预实验优化 细胞毒性 细胞污染 建议彻底清洁所有细胞培养相关用品 六 储存与安全 本品常温运输 ,储存于 4℃,有效期 12 个月。 本品使用安全 ,未发现任何生物、化学毒性。如不慎沾染 ,用清水冲洗即可。 七 其他相关试剂 Entranster TM -D :将 DNA 高效低毒转染入动物细胞。 Entranster TM -R :将小片断 RNA(siRNA 、 miRNA 、 mimic 、 inhibitor 等 转 染入动物细胞。 Entranster TM -in vivo:RNA 和 DNA 的动物体内转染。 Envirus TM : 病毒感染增强系列试剂 ,可增强慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和逆 转录病 毒等的感染效率。 Enlight TM : 超稳定、高灵敏 ECL 发光试剂。 八 质量保证 北京英格恩生物科技有限公司对 Entranster TM -H 转染试剂的每批产品实行严 格质量检 验,并进行转染验证 ,以确保产品质量。请用户使用前务必认真阅读本手 册。 九 使用限制
电转细胞实验转染细胞方法
电转细胞实验转染细胞方法
电转细胞实验转染细胞方法
1) 细胞铺板，使细胞在电转当天有70~90% 汇合率；
2) 配置RNP 反应体系
3) 20 分钟之内，用胰酶消化细胞，并洗去迹量的胰酶（胰酶残留
会造成其对Cas9 蛋白的降解），重悬细胞到10 mL 培养基中，并计数；
4) 取5 倍于0.2~1×10 6 细胞量到新的EP 管中，500×g 离心5 分钟收集细胞，并用PBS 清洗一次细胞，重新离心；
5) 使用5 倍于30 μL 电转液重悬细胞；
6) 准备预先在24 孔（0.5 mL）或6 孔（2 mL）板中加入适量培养基，用于后期电转细胞培养；
7) 将30 μL 电转液重悬细胞加入到各RNP 反应EP 管中，并轻轻混合；
8) 取60 μL RNP 和细胞混合液到吉玛电转仪（96 孔电转），使用300V，电击6 次；
9) 立即将电转后细胞转移到培养板中，在细胞培养箱中培养48~72小时。
细胞电转方法
细胞电转⽅法⼀、引⾔细胞电转，⼜称电穿孔法或电融合法，是⼀种将外源物质导⼊细胞内的技术。
⾃20世纪70年代以来，随着⽣物技术的⻜速发展，细胞电转技术在⽣物学、医学及⽣物⼯程等领域得到了⼴泛应⽤。
本⽂将详细介绍细胞电转的原理、步骤、影响因素、常⻅问题及其解决⽅法，以及细胞电转在各个领域的应⽤。
⼆、细胞电转原理细胞电转的原理是利⽤短暂的⾼强度电场在细胞膜上形成临时性孔洞，从⽽使外源物质如DNA、RNA、蛋⽩质等通过孔洞进⼊细胞内。
当电场消失后，这些孔洞会⾃动修复，⽽进⼊细胞内的外源物质则可以在细胞内发挥作⽤。
三、细胞电转步骤1.细胞准备：选择适当的细胞类型，如贴壁细胞或悬浮细胞，进⾏传代培养。
在电转前，需要将细胞进⾏洗涤，去除培养基中的⾎清和抗⽣素等成分，以减少电转过程中可能的⼲扰。
2.外源物质准备：根据实验需求，制备适量的外源物质，如质粒DNA、mRNA等。
3.电转液配制：选择适当的电转液，如PBS、Opti-MEM等，按照⼀定⽐例稀释外源物质。
4.细胞与电转液混合：将细胞与电转液混合，确保细胞充分悬浮在电转液中。
5.电转操作：将细胞与电转液混合物转移⾄电转杯中，选择合适的电转参数（如电压、电容、电阻等）进⾏电转。
6.电转后处理：电转结束后，将细胞转移⾄新鲜培养基中，进⾏培养。
根据实验需求，可以在不同时间点对细胞进⾏观察和检测。
四、影响细胞电转效率的因素1.细胞类型：不同细胞类型对电转的敏感性不同，因此需要根据实验需求选择合适的细胞类型。
2.电转参数：电转电压、电容、电阻等参数对电转效率有重要影响。
需要根据细胞类型和外源物质的性质进⾏优化。
3.电转液成分：电转液的成分和浓度对电转效率也有⼀定影响。
需要选择合适的电转液，并根据实验需求进⾏调整。
4.温度：电转过程中的温度也会影响细胞电转效率。
通常需要在室温下进⾏电转操作。
五、常⻅问题及其解决⽅法1.细胞死亡率过⾼：可能是由于电转参数设置不当或电转液成分不合适导致的。
电转化注意事项
电转化注意事项作者: 发布: 2020-10-20一、制备感受态的菌液搜集时刻：1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。
1）为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD 值是否呈线性关系）。
每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！2） OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0. 95g/10ml。
高密度发酵时菌体湿重将相应下降。
2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml sorbitol才可溶解为糊状。
正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。
可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。
3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好二、制备感受态的菌液量如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。
用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。
整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。
山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。
三、感受态的保存感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。
如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP管分装，-70 或 -80 摄氏度保存。
另附：酵母GS115点种分离纯化接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡留宿，涂布 YPD平板，30℃培育48 小时，用 YNB大体培育基和含His的补充培育基作点种分离纯化，挑选在补充培育基生上生长而在大体培育基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保留。