质粒转染的注意事项
重组质粒的转化及阳性克隆的筛选
(二)阳性克隆的鉴定与筛选
将目的基因与载体进行连接形成重组子并转化后, 在连接产物中既有载体和目的基因的连接,也有载体 的自连和目的基因的自连,更多的是未发生连接反应 的载体和目的DNA片断.这就需要我们对阳性克隆进 行鉴定和筛选,将含有外源DNA的宿主细胞和不含外 源DNA的宿主细胞分开,将含有正确重组子的宿主细 胞和含有其他外源DNA的宿主细胞分开.
阳性克隆的筛选与鉴定可以从DNA, RNA和蛋白质三个不同的层次水平进行.可以 利用载体本身的一些特性,如抗生素抗性基因, 包装容量等对重组子筛选.可以直接分析重组 子中的质粒DNA,分析其插入片段的有无,大 小和酶切图谱,也可直接通过测序分析重组子 中的插入片断.有时可以通过间接分析和目的 基因相连的基因或蛋白的表达来检测目的基因 的表达,比如将目的基因和报告基因同时整合 到宿主中,如果报告基因表达,则说明目的基 因也可能正确表达.
四,操作步骤
(一)重组质粒的转化 1,从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其 解冻,解冻后立即置冰上. 2, 加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超 过10μl),轻轻摇匀,冰上放置30分钟后. 3,42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速 置于冰上冷却3-5分钟. 4,向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后 37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质 粒编码的抗生素抗性基因(Ampr ). 5,将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平 板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后 倒置培养皿,37℃培养16-24小时.
五,注意事项
1,麦康凯选择性琼脂组成的平板,在含有适当抗生素 时,携有载体DNA的转化子为淡红色菌落,而携有带 插入片段的重组质粒转化子为白色菌落.该产品筛选 效果同蓝白斑筛选,且价格低廉.但需及时挑取白色 菌落,当培养时间延长,白色菌落会逐渐变成微红色, 影响挑选. 2,X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖以半乳糖苷酶 水解后生成的吲哚衍生物显蓝色.IPTG是异丙基硫代 半乳糖苷为非生理性的诱导物,它可以诱导lacZ的表 达. 3,在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上,携带载体 DNA的转化子为蓝色菌落,而携带插入片段的重组质 粒转化子为白色菌落,平板如在37℃培养后放于冰箱 3-4小时可使显色反应充分,蓝色菌落明显.
转染详细步骤大攻略
转染详细步骤大攻略范例----真核重组表达质粒pDsRed-N1-NS1在A549细胞中表达按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，测得质粒浓度为410.32ng/µl。
将培养的A549细胞铺板，待细胞密度长到90%左右时，按lipo2000说明书转染A549细胞，36h后于荧光显微镜下观察DsRed-NS1融合蛋白的表达情况。
具体操作步骤如下：1）质粒准备按上海索莱宝生物科技有限公司去内毒素质粒小提试剂盒说明书方法进行质粒抽提，具体步骤如下：(1) 取1-5ml细菌培养物，12000rpm离心1 min,尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
(2) 向留有菌体沉淀的离心管中加入200µl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA）,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。
（注：如果菌块未彻底混匀，会影响裂解导致质粒提取量和纯度偏低）(3)向离心管中加入200µl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。
（注：混匀一定要温和，以免污染基因组DNA，此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏）(4)向离心管中加入250µl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
12000rpm 离心10min，用移液器小心地将上清转移到另一个干净的离心管中，尽量不要吸出沉淀。
（注：溶液P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。
如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清）(5)加入1/5体积冰预冷的去内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min 至溶液变清亮。
(6)37℃水浴5 min，不时振荡，溶液又变浑浊。
12000rpm室温离心5min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。
(7)将质粒DNA上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相，重复抽提三次，即重复步骤5-7三次。
质粒转化、细胞转染步骤
转化：将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性。
转染（transfection）:将含有目的gene的载体转到真核cell内
转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程。
有时也指在真核cell之间通过逆转录病毒转移和获得cellDNA的过程。
1.质粒转染（transfection）
6-well-plate 每well 60-70%时transfection
接种时×105个/ml/well
质粒DNA 转染液优化培养基opti-MEM
步骤：质粒DNA + 200ul opti-MEM + 6ul转染液混匀室温静置15min 待转染cell换优化培养基，切记要轻轻加培养基，勿冲起cell 把transfection complex(200ul)轻轻均匀滴入cell培养基中，十字形摇晃plate,混匀
37℃，CO2培养箱培养
2.
转化：外源DNA(质粒作为载体)导入受体细胞（大肠杆菌感受态cell）步骤：
50ul感受态cell（一管）加入12ul质粒DNA→轻柔混合
↓
冰浴30min
↓
42℃热激90s
↓
迅速冰浴2min
↓
向管中加入培养基，混匀后37℃震荡培养（﹤225rpm）1h,使细菌恢复正常生长状态
↓
涂板正培1h后，倒培过夜。
瞬时转染实验步骤
瞬时转染实验步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：瞬时转染实验是一种常用的基因转染技术，可用于将外源DNA或RNA导入到目标细胞中，以研究基因表达和功能。
本文将介绍瞬时转染实验的步骤及注意事项。
一、实验前准备1.1 制备转染试剂：根据所需的转染试剂种类，准备相应的试剂。
常用的转染试剂包括有机溶剂转染试剂（如Lipofectamine 2000）、阳离子聚合物转染试剂（如Polyethylenimine，简称PEI）等。
1.2 制备转染质粒：准备含有目标基因的转染质粒。
转染质粒应进行质粒提取、纯化并测序确认。
1.3 培养细胞：细胞应在培养皿中充分培养至70%～90%的浓度，以保证转染效率。
1.4 预热培养基：将足够的培养基提前预热至37℃，以用于细胞培养和转染。
二、转染操作步骤2.1 向细胞培养皿中加入转染试剂：按照转染试剂的使用说明书，向培养皿中加入适量的转染试剂，并在无血清培养基中混合均匀。
2.2 加入转染质粒：将准备好的转染质粒溶液滴加入培养皿中，注意避免空气泡。
2.3 孵育细胞：将培养皿放置在37℃的培养箱中孵育一定时间，通常为4～6小时。
2.4 更换培养基：在转染后适当时间内更换含有血清的培养基，以保证细胞正常生长。
2.5 收获样品：根据实验设计和研究目的，选择合适的时间点收获转染后的细胞样品。
三、注意事项3.1 转染试剂浓度：转染试剂的浓度应根据实验目的和细胞类型进行优化，以达到最佳的转染效果。
3.2 转染时间和转染效率：转染时间过长或过短都可能影响转染效果，应根据实际情况进行调整。
3.3 质粒浓度和纯度：转染质粒应具有足够的纯度和浓度，以确保转染效果。
3.4 细胞密度和状态：细胞应在良好的状态下进行转染，过高或过低的细胞密度都会影响转染效果。
3.5 实验控制组：应设置适当的对照组，以进行比较和验证实验结果的可靠性。
总结：瞬时转染实验是一种常用的基因转染技术，通过适当的实验操作步骤和注意事项，可获得可靠的实验结果。
质粒转染技术
质粒转染技术质粒转染技术是现代生命科学研究中常用的实验手段之一，广泛应用于基因工程、细胞生物学、分子生物学等领域。
本文将从质粒转染技术的原理、方法和应用等方面进行介绍。
一、质粒转染技术的原理质粒转染技术是指将外源质粒DNA导入到细胞内的一种方法。
质粒是一种环状DNA分子，具有自主复制和表达基因的能力。
质粒转染技术通过将质粒DNA导入到细胞内，使其在细胞内复制和表达，从而实现对目标基因的研究和应用。
1. 化学法转染：化学法转染是最常用的质粒转染方法之一。
其基本原理是利用化学物质（如聚合物、脂质体等）与质粒DNA结合，形成复合物后与细胞膜发生相互作用，使质粒DNA进入细胞内。
这种方法操作简单、成本低廉，适用于大多数细胞类型。
2. 电穿孔法转染：电穿孔法利用高压电脉冲的作用，瞬时破坏细胞膜，使质粒DNA能够进入细胞内。
这种方法适用于多种细胞类型，转染效率较高，但操作较为复杂。
3. 粒子轰击法转染：粒子轰击法利用高速粒子（如金属微粒）的撞击作用，将质粒DNA导入细胞内。
这种方法适用于质粒DNA较大、难以通过其他转染方法的细胞。
三、质粒转染技术的应用1. 基因表达研究：质粒转染技术可用于将外源基因导入细胞，使其在细胞内表达，从而研究基因的结构、功能和调控机制。
2. 基因敲除研究：质粒转染技术结合CRISPR/Cas9等基因编辑技术，可以实现对特定基因的敲除，从而研究该基因的功能。
3. 基因治疗：质粒转染技术可用于将治疗基因导入患者的细胞，修复或替代异常基因，实现基因治疗的目的。
4. 细胞药物递送：质粒转染技术可用于将药物敏感基因导入细胞，使其在细胞内表达，从而增强对药物的敏感性，提高治疗效果。
四、质粒转染技术的进展与挑战随着生命科学研究的不断发展，质粒转染技术也在不断改进和完善。
目前，研究人员正在努力提高转染效率、降低细胞毒性和改善转染的特异性等方面。
同时，也面临着一些挑战，如如何选择合适的转染方法、如何提高质粒的稳定性等问题。
细胞的脂质体转染法和电穿孔法
细胞的脂质体转染法和电穿孔转染法（一）脂质体转染一、实验试剂及器材Lipofectamine® 3000 Transfection Reagent，质粒DNA(0.5-5 μg/μL储液)，Opti-MEM®减血清培养基，培养板，酒精灯，离心机，微量移液器，离心管等。
二、实验步骤1. 接种细胞至70－90%汇合度时转染；2. 使用Opti-MEM®减血清培养基稀释Lipofectamine® 3000试剂（2管），充分混匀（6孔板Opti-MEM®培养基为125 μL× 2，Lipofectamine® 3000为3.75和7.5 μL）；3. 在每管已稀释的Lipofectamine® 3000试剂中加入稀释的DNA（用P3000TM试剂稀释）（1:1比例）；4. 室温孵育5分钟；5. 加入DNA－脂质体复合物至细胞中；6. 37°C(PK-15在39°C下培养)孵育细胞2–4天，然后分析转染细胞。
三、注意事项1. 在无血清培养基（如Opti-MEM®减血清培养基）中制备DNA－Lipofectamine® 3000脂质体复合物，直接将其加入含细胞培养基的细胞中（在血清／抗生素存在或不存在时均可）；2. 转染后无需去除转染复合物或者更换／添加培养基；3. Lipofectamine® 3000试剂用量各有不同，测试推荐的两种浓度的Lipofectamine® 3000试剂，以确定最佳用量，开始新的转染；4. Lipofectamine® 3000试剂应放在4℃储存（切勿冷冻）。
附上Lipofectamine 3000 REagent Protocol：（二）电穿孔转染法一、实验试剂及器材BTX ECM2001®2001细胞电融合仪，细胞，胰蛋白酶，电转液，DMEM，培养板，离心机等。
CHO-S细胞蛋白表达操作规程
CHO-S细胞转染操作规程ExpiCHO™ Expression Medium不会抑制转染，因此转染时无需更换培养基。
一、实验材料：1、ExpiCHO-S™ cells cultured in ExpiCHO™ Expression Medium。
2、无菌、无苯酚、无氯化钠，主要是超螺旋结构的含目的基因的质粒。
N0te：推荐使用《PureLink™ HiPure Plasmid Ki t 》试剂盒抽提质粒。
为了保证无菌，可以使用0.22um的过滤器过滤质粒。
3、抗体表达阳性对照质粒（100 µL of the 1 mg/mL，由试剂盒提供）4、ExpiFectamine™ CHO Reagent（4℃冷藏使用，使用前无需预热）5、OptiPRO™ SFM complexation medium（4℃冷藏使用，使用前无需预热）6、ExpiCHO™ Expression Medium（使用前预热至37℃）Note:转染过程中不能添加抗生素，否则会影响转染效率。
7、Polycarbonate, disposable, sterile Erlenmeyer flasks。
8、37℃，8%CO2，可空气加湿的摇床。
9、测定活细胞密度和百分比的试剂和仪器。
（牛鲍计数板、台盼蓝染液）二、转染注意事项：1、新复苏的细胞在转染之前至少要传2代以上。
2、所有针对细胞的操作要严格无菌、动作轻柔，避免剧烈的震荡或移液，细胞的健康状态对最大程度的提高转染效率至关重要。
3、如果不使用ExpiFectamine™ CHO Reagent转染高密度的ExpiCHO-S™ 细胞，转染效率将会大幅度降低。
4、ExpiFectamine™ CHO Reagent使用之前柔和颠倒4-5次，确保试剂充分混匀。
5、质粒DNA与ExpiFectamine™ CHO Reagent的混合可在室温下进行，使用4℃冷藏试剂。
6、一旦ExpiFectamine™ CHO/DNA复合物形成，应立刻将该复合物加到细胞悬液中，5分钟之内不影响转染效率，但不能超过10分钟。
质粒DNA细胞转染(Entranster)应注意的事项
1，质粒的构建：启动子的选择
启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的。
对于转染过程本身虽然无甚影响，但是对转染结果却有着微妙的影响。
2，质粒的大小和质量
线性化还是超螺旋会影响转染结果：超螺旋质粒的转染效率比线性DNA高得多，特别是瞬时转染。
而线性化DNA转染的整合几率高。
质粒太大了转染会困难一些。
毕竟，相对致密、较小的外源异物被细胞内吞的几率要大一些。
如果你的质粒正好比较大，又没有经验，选择特别注明可以转大质粒的转染试剂成功几率会高一些。
有的转染试剂还会提供一些促进DNA凝聚的成分，使得DNA形成转染复合物时更致密一些，更容易转染一些。
纯化质粒的质量也会影响转染效率，一定要选择高质量的质粒。
3，质粒DNA的浓度和量
既然质粒纯化已经不成问题，初学者通常都不会在乎甚至愿意多加点DNA，但是要注意的是，DNA量过少固然转染效率不高，DNA量过多同样会降低转染效率。
所以预实验需要按照说明书的要求，按一定比例混合适量的质粒DNA和转染试剂。
有的转染试剂要求DNA的量多些，有的转染试剂效率高只要很少DNA。
4，转染试剂的选择
在确定了质粒的质量之后，就要考虑转染试剂的选择了。
目前大多数用的是脂质体类的转染试剂，但这类试剂的毒性较大，转染效率低，最好选择非脂质体的转染试剂，如Entranster试剂。
转染注意事项经验之谈有血清时的转染血清一度曾被认为会降低转
转染注意事项（经验之谈）有血清时的转染血清一度曾被认为会降低转染效率，但只要在DNA-阳离子脂质体复合物形成时不含血清，在转染过程中是可以使用血清的。
转染过程在两步中需要使用培养基做为稀释液：在DNA-阳离子脂质体复合物准备过程以及复合物同细胞接触过程。
在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基，因为血清会影响复合物的形成。
但在复合物形成后，在加入细胞中前可以加入血清。
阳离子脂质体和DNA的最佳量在使用血清时会有所不同，因此如果你想在转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。
大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康。
对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用OPTI-MEMⅠ培养基，一种营养丰富的无血清培养基，或者在转染培养基中使用血清。
对于对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。
培养基中的抗生素抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。
这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。
这降低了细胞的活性，导致转染效率低。
所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。
这样，在转染前也不必润洗细胞。
对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。
另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。
细胞维护和培养的演变可以通过常规的次培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。
每周传代一到两次，稀释程度使得下次传代前细胞几乎融合。
不要使细胞保持融合超过24小时。
大多数已建立的细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物。
细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。
这会导致和转染相关的细胞行为的变化。
如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。
质粒瞬时转染
一、质粒瞬时转染
用脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000 (Invitrogen，CA)对细胞系进行转染，转染荧光素酶报告基因质粒（含不同等位基因）及化学合成的miRNA mimics。
共转染目的质粒及pRL-SV40 (海肾荧光素酶，作为内参照)，具体操作如下：(1) 将细胞接种于24孔培养板中，使用含有10%胎牛血清不含抗生素的培养基培养24 h；
(2) 待细胞长到80-90%，将质粒0.8 μg DNA与miRNA mimics/NC(20 pmol) 溶于无抗生素无血清的培养基50 μl中，混匀；将1 μl Lipofectamine 2000溶于无抗生素无血清的培养液50 μl中，混匀后室温静置5 min；将上述二者混合均匀后，室温孵育30 min 后加入细胞培养孔；
(3) 将细胞继续放入细胞培养箱中培养，于转染48 h后，检测细胞抽提物中荧光素酶基因活性；每个实验质粒每次实验设置3个平行孔，重复转染3次。
二、荧光素酶活性检测(参照Promega报告基因检测试剂盒)
转染24h后，取出细胞培养板，去除培养基→ 加入1 ×PBS 清洗细胞，去除脱落的细胞及剩余的培养基→ 去除PBS 后，加入裂解液→将培养板置于振荡摇床上，室温低速振荡30min →收集细胞裂解液上清20 μl移入干净的仪器检测板→利用化学发光仪检测双荧光素酶活性。
质粒提取和纯化及质粒转染所需试剂及操作规范
二、质粒的提取和纯化所需1. 液体LB培养基（1）配方蛋白胨（TRYPONE）1%(g/ml)NaCl1%酵母粉（YEAST EXTRACT）0.5%加蒸馏水定容（2）将配好的培养基高压后，恢复室温后置于4度保存备用，使用时恢复室温（3）配液体LB培养基时，一般不加抗生素（高温会使抗生素失活，也不宜4度保存），因此若要在此培养基中加抗生素，应该在使用时根据比例添加2. 固体LB培养基（1）配方蛋白胨（TRYPONE）1%(g/ml)NaCl1%酵母粉（YEAST EXTRACT）0.5%加蒸馏水定容时（装到可以高压的瓶中），由于加入的琼脂粉有一定的体积，因此定容时，注意略微少加点水，根据要加入的琼脂粉而定（琼脂粉只有在高压后溶解）（2）直接向以上配好的LB中加入加琼脂粉1.5%，以配成固体培养基（3）高压：高压完注意保温，温度过低培养基会凝固，因此从高压锅里取出后应立即铺板（4）铺板此操作在细胞室安全柜中无菌操作，铺板前应提前开紫外灯照台子15min，点燃酒精灯。
若铺的是无抗生素的阴性平板，则在铺板时直接铺板；若铺的是含有抗生素的平板，则在铺板时，应等到高压后的培养基温度降到不烫手时（高温会使抗生素失效），根据比例加入抗生素后在铺板。
培养基铺到平板上，每个平板约25ml，注意保温，一定要在培养基凝固成固体前铺到平板上，铺板时还应不时的摇匀培养基以防止瓶底的培养基因温度过低而凝固，铺好后敞开平板的盖子，待培养基凝成固体后再盖上（约15min）（5）待LB培养基在平板中凝固后，盖上平板的盖子，并用封口膜封好后放到4℃保存备用3. 配置含有抗生素的LB培养基Amp配制时一般为100μg/μl,使用时稀释1000倍Kana配制时一般为50mg/ml，使用时稀释1000倍二、质粒转染真核细胞1、lipo2000（以6孔板转染为例，其他用量请参考说明书）（1）将覆盖率为90-95%的细胞提前用only饥饿3h，转染前换新鲜培养液。
转染实验技巧DNA体外转染试剂如何准备转染所需的质粒DNA转染
转染实验技巧DNA体外转染试剂如何准备转染所需的质粒DNA转染效率受到诸多因素的影响，除了细胞、培养基和载体等影响因素外，另外一项非常重要的因素便是DNA的质量。
为了比较不同厂家的转染效率，我们分别从三家不同的供应商购买了质粒制备试剂盒来制备pEGFP-N3质粒DNA，并通过不同的方法将制备的pEGFP-N3质粒转运至NIH-3T3细胞。
pEGFP-N3质粒分别通过Endofree Maxi Piasmid Kit(Qiagen),PerfectPrep Endofree Piasmid Maxi Kit(5 PRIME,inc)及NucleoBond DNA Maxi Kit(MACHEREY-NAGEL GmbH&Co.KG)制备，我们测定了230,260,280及320nm的吸光值检测DNA的质量。
通过上述三种方法制备的DNA质量如下：MACHEREY-NAGEL ＞5Prime＞Qiagen。
pEGFP-N3由PolyJetDNA转染试剂运至NIH-3T3细胞。
转染效率的高低与DNA的质量相符，由MACHEREY-NAGEL纯化DNA对应的转染效率最高，而由Qiagen纯化DNA对应的转染效率最低。
因此，MACHEREY-NAGEL GmbH & Co.KG的质粒制备试剂盒被认为是制备转染级别DNA的最佳选择。
How to prepare transfection grade plasmid DNATransfection efficiencies are affected by a variety of different parameters. Besides factor such as cell culture, medium and vectors, one of most critical parameters is DNA quality. We prepared pEGF-N3 plasmid DNA by large plasmid preparation kits from three different vendors and tested transfection efficiencies by delivering pEGFP-N3 DNAs prepared by different methods to NIH-3T3 cells.We prepared pEGFP-N3 plasmid with Endofree Maxi Plasmid Kit (Qiagen), PerfectPrep Endofree Plasmid Maxi Kit (5 PRIME, Inc.) and NucleoBond DNA Maxi Kit (MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG). The DNA quality was determined by measuring absorbance at 230, 260, 280 and 320 nm by spectrometry.The purity of DNA prepared by the three methods is as follows: MACHEREY-NAGEL > 5 Prime > Qiagen.Then pEGFP DNA was delivered with PolyJet™ (Cat # SL100688) DNA transfection reagent to NIH-3T3 cells per manufacturer’s protocol. In accordance with DNA purity results, we found that DNA from MACHEREY-NAGEL gave the best transfection efficiency while Qiagen DNA gave the worst efficiency. Therefore plasmid preparation kit from MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG is confirmed to be the best choice to prepare tansfection grade DNA.表皮细胞的转染表皮细胞广泛遍布于身体，正常的表皮细胞较难转染，尤其是使用基于脂质体技术的转染试剂。
质粒DNA转染注意事项
[精华]质粒DNA转染注意事项：聚焦转染专辑终结篇(中)【字体：大中小】 时间：2005年08月19日来源：生物通------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------·一、质粒的构建：启动子的选择启动子的选择对于转染基因的有效表达是非常重要的。
对于转染过程本身虽然无甚影响，但是对转染结果却有着微妙的影响。
启动子可分为2大类：诱导型启动子是比较精明的，平时歇着，一旦接到诱导信号指示就马上开工干活儿。
而组成型启动子比较老实的，就是从头到尾不停干活从不闲着的那种——比如我们很熟悉的CMV启动子啊，SV40啊，pMC1啊，PGK启动子啊等等。
获得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。
CMV启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性。
在BHK-21中，CMV 启动子活性比其他启动子如SV40和RSV都要高。
但这三种病毒启动子在T细胞来源的细胞系，如Jurkat中组成表达水平较低。
转染后在培养基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat细胞中CMV启动子，而单PMA就足以激活KG1和K562（人骨髓瘤白细胞）中的CMV启动子。
SV40启动子的表达在含有大T 抗原（存在于COS-1和COS-7）时会提高，因为大T抗原可以刺激染色体外的合成。
一个强悍的高表达组成型启动子是我们做表达所求之不得的，但是对于转染本身来说却不一定好——因为任何持续过高表达外源基因都可能带来某种程度的细胞毒性，影响细胞生长——如果外源基因本身对细胞生长有毒，那更完蛋了，你很可能筛不到转染成功的细胞株，更别提稳定转染了——因为过量表达本身可能已经害死了那个转染了的细胞，没转染的细胞又死于筛选压力。
进行转染实验时需要注意的因素
转染——让克隆的核酸进入真核细胞中，已经成为研究和控制真核细胞基因表达的重要手段。
比如表达纯化特定的蛋白；鉴定一个基因的生物学特性；突变分析；研究基因表达对细胞生长的影响，研究基因表达的调控机制等等，等等。
如今广义的转染不单包括了DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。
很多因素会影响转染效率，细胞株本身啦，细胞培养环境啦，转染的DNA、RNA或者蛋白的质量和特性啦，转染方法啦，等等。
每个转染高手也必然有自己的独门心经，只可惜大家都为实验或者生活而疲于奔命，没有几个人愿意静下心情来仔细总结经验汇集成文字——那些曾经用无数失败的痛苦烦恼换回来的宝贵经验，那些曾经以为会永远铭刻于脑海的教训，随时间的流逝而终于渐渐褪色，到模糊。
即使偶尔有珠玉掩埋于浩瀚的口水中，也难以汇串成珠。
试剂盒的盛行，让实验更快，更简单，也更机械化，相信更多人更愿意先抓起Protocol 123地往下做，直到碰壁再苦思原因。
其实等碰得遍体鳞伤回头一看就会醒悟，很多坑，只要事前注意了就不会陷进去的。
DNA转染后，转入基因的表达可以在1－4天内检测到——仅有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并最终输出mRNA到细胞质进行蛋白合成。
几天内，大部分外源DNA 会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了。
因此转染也可以分为瞬时转染和稳定转染。
瞬时转染（transient transfection）指的是转染的核酸不整合到染色体上，结果是短暂的高水平表达，可在24—96小时内检测表达效果，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。
瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少，但因为DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，不长久也不稳定。
超螺旋质粒转染更倾向于瞬时表达。
瞬时表达适合研究启动子等调控元件——不过，诱导型的启动子除外。
稳定转染，就是转染的质粒DNA整合到染色体上，或者相当于附加子（episome）可持续存在，使得转染的细胞可长期表达。
质粒共转染与单转步骤
质粒共转染与单转步骤质粒共转染（Co-transfection）和单转（Single transfection）是在分子生物学研究中常用的实验技术，用于将外源DNA导入到细胞中。
下面是它们的步骤解释：质粒共转染：1. 准备质粒：首先，准备包含所需基因或DNA片段的质粒。
质粒通常通过经验性选择或特定实验目的来选择。
2. 细胞培养：细胞株需要预先培养到合适的生长状态，以确保细胞处于最佳转染状态。
通常，细胞会在培养皿中培养至适当的浓度和状态。
3. 转染混合物制备：将所需质粒与适当的转染试剂（例如，转染剂或离子磷脂体）混合，形成转染混合物。
转染试剂有助于促进质粒与细胞之间的相互作用，从而实现转染。
4. 转染：将转染混合物添加到细胞培养皿中。
转染过程中，质粒会进入目标细胞，并在细胞内进行表达或进一步操作。
5. 培养和筛选：将转染后的细胞继续培养，并根据实验需求选择适当的培养基或添加筛选物质（例如抗生素）来选择和筛选转染成功的细胞。
单转：1. 准备质粒：同样，首先准备包含所需基因或DNA片段的质粒。
2. 细胞培养：细胞株需要预先培养到适当的生长状态。
3. 转染混合物制备：将所需质粒与适当的转染试剂混合，形成转染混合物。
4. 转染：将转染混合物添加到细胞培养皿中，与共转染步骤相同。
5. 培养和筛选：与共转染步骤相同，将转染后的细胞继续培养并选择筛选。
区别：- 共转染是将两个或多个不同的质粒同时转染到细胞中，而单转是只转染一个质粒。
- 共转染可以用于研究多个基因的相互作用或共同表达，而单转通常用于研究单个基因的功能。
- 共转染可能需要更多的优化和控制，以确保每个质粒在细胞中的比例适当。
- 单转一般比共转染更简单和直接，因为只涉及一个质粒。
无论是质粒共转染还是单转，都需要根据具体的实验目的和细胞类型进行优化和控制，以确保转染效率和所需结果的实现。
质粒转染细胞对质粒内毒素的要求
质粒转染细胞对质粒内毒素的要求一、概述质粒转染是生物技术领域的常用技术之一，在基因工程、细胞治疗等领域有着广泛的应用。
质粒转染细胞是指将外源质粒引入目标细胞内，使其表达特定的基因或调控目标基因表达。
在进行质粒转染的过程中，质粒内毒素的要求是至关重要的。
质粒内毒素是指质粒本身所携带的具有毒性的基因或序列。
在进行细胞转染实验时，质粒内毒素的存在会对细胞生长、转染效率等产生影响，因此对质粒内毒素的要求成为了质粒转染细胞研究中的重要议题。
本文将就对质粒转染细胞对质粒内毒素的要求进行探讨。
二、对质粒内毒素的要求1. 低毒性质粒内毒素的毒性是质粒转染研究中需要重点考虑的因素之一。
毒性高的质粒内毒素会对细胞的生长和代谢产生不良影响，甚至导致细胞逝去。
对质粒内毒素的要求之一是要求其毒性尽可能低。
2. 无毒性除了要求低毒性外，质粒内毒素最好是无毒性的。
这样可以避免质粒转染对细胞生理功能产生不可逆的影响，保证细胞的正常生长和代谢。
3. 不干扰目标基因表达质粒内毒素还要求不干扰目标基因的表达。
一些质粒内毒素对细胞内的基因表达产生干扰，导致转染效率降低或目标基因表达异常，这种情况是需要避免的。
4. 与细胞相容性好质粒内毒素应与细胞具有很好的相容性，不会对细胞膜、细胞器等产生影响。
否则会影响细胞内质粒的稳定性和表达效果，降低转染效率。
三、选用合适的质粒为满足对质粒内毒素的要求，研究人员可以根据实验需要选择合适的质粒。
一般来说，可以选择不携带毒性基因的质粒，并且质粒本身不会对细胞产生毒性影响。
在进行质粒转染实验前，还可以通过进行毒性测试，筛选出合适的质粒，以达到更好的转染效果。
四、克服质粒内毒素对质粒转染实验的影响在进行质粒转染实验时，可以采取一些措施克服质粒内毒素对实验的影响。
如降低质粒浓度、优化细胞培养条件、使用合适的转染试剂等手段，以减轻质粒内毒素对转染实验带来的不利影响。
五、结论质粒转染细胞对质粒内毒素的要求是确保质粒转染实验能够顺利进行，保证转染效果的关键之一。
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质粒转染的注意事项
1. 质粒的纯度：质粒转染的前提是质粒需要高纯度，否则可能会产生不必要的背景信号，影响实验结果。
2. 质粒的浓度：质粒浓度的选取直接影响到转染效率，通常建议使用1-2μg/mL 的质粒。
3. 细胞密度：转染前需注意细胞密度的选取，通常细胞密度不宜过于密集，否则会影响转染效果。
4. 转染剂：选择适当的转染剂可以提高转染效率，目前常用的转染剂有Lipofectamine、JetPrime、PEI等。
5. 转染时间：不同种类的细胞对转染时间有不同的要求，一般来说转染时间不宜过长或过短。
6. 转染后细胞处理：转染后需要对细胞进行适当的处理，如改变培养基、加入药物等，以促进目的基因的表达或抑制。