HLA抗原分子与抗体检测

HLA抗原分子与抗体检测
(一) HLA抗原分型方法及其原理HLA分型分为两个方面：HLA抗原或HLA基因分型，检测目的是检测个体具有何种类型的抗原或决定抗原编码的DNA结构；HLA抗体，裣测目的是检测个体具有针对何种类型的抗原的抗体。

1. HLA抗原分型主要有微量淋巴细胞毒实验，以及在此基础上改良的抗人球蛋白-微量淋巴细胞毒实验，利用补体依赖性细胞毒的作用原理，让具有某种HLA抗原的淋巴细胞结合上对应的抗体后，在补体的作用下，形成攻膜复合物，在淋巴细胞上出现小孔，细胞外的液体可流入细胞内，进而细胞发生肿胀、死亡；如果细胞没有碰到对应的抗体，则不会死亡。

在相差倒置显微镜或荧光相差倒置显微镜下，利用合适的染料，可以清楚区别出死亡和存活细胞。

抗人球蛋白-微量淋巴细胞毒实验与传统的微量淋巴细胞毒实验的差别在于：在抗原抗体结合后，再结合抗人球蛋白，可增加微量淋巴细胞毒实验的检测敏感性，在国际上已成为移植前后交叉配型的基本方法。

HLA- I类抗原一般用T细胞或总淋巴细胞作为检测细胞，HLA-Ⅱ类抗原用B细胞作为检测细胞。

由于抗原分型等实验需要使用细胞、抗体，而抗体起始来源是血清，一般把抗体抗原相关的实验称为血清学实验，包括抗原分型、抗体筛选和«配型实验等。

2. HLA基因分型；检测的靶物质是人体细胞核内的DNA中HLA基因区域，一般利用夕卜周血中总白细胞DNA，检测方法多数是以PCR为基础的系列方法，包括PCR-SSP，PCR-.SSO，反向PCR-SSO，PCR-测序，PCR-RFLP等，这些方法可明确了解编码HLA抗原的基因的序列的组成。

如果分型方法的结果只能推测出抗原的特异性，这种分型方法称为低分辨率，如果分型方法的结果可基本了解该HLA基因中某等位基因的所有外含子序列，一般只能通过PCR-测序所得，则该分型方法称为高分辨率；介于两者之间的，称为中分辨率。

器官移植的HL先分型一般只要求低或中分辨率，而造血干细胞移植需要中至高分辨率的HLA分型。

另外还有一些不经常使用的方法，如PCR-RSCA、PCR-SSCP、PCR-指纹法等，可用于了解不同样品之间HLA型别是否相同，而具体是什么型别，需要有参考样品作比较，才能得出结论，所以可用于新等位基因的发现。

基因分型也称为分子生物学分型，目前常用方法的原理和优缺点陈述如下：
(1)PCR-SSP：根据HLA基因中不同等位基因的不同序列，设计不同PCR引物，分别针対这些部位，进行扩增，如引物与被测标本一致，则可以被扩增，通过一组不同引物分别是否被扩增出，就可以推断出标本属于何种HLA等位基因。

优点：实验步骤简单，结果判断明确，适合小批量；缺点：不能检测基因背景不清楚的等位基因，扩增体系、电泳步骤需较多人工，不适合大批量，有些基因序列部位不能设计有效的PCR引物。

(2)PCR-SSO：根据HLA基因中不同等位基因的不同序列，设计不同DNA探针，分别与待测样品包含等位基因外显子所有高变区域的PCR扩增产物进行杂交，如待测样品序列与探针序列一致，则出现阳性杂交信号，分析一组探针的不同杂交信号，推断出标本属于何种HLA等位基因。

优点：适合大批量标本检测，探针设计受序列限制较小，可随时增加探针数量或进行更新；缺点：实验步骤烦琐，杂交信号判断受主观影响较大，对工作人员的经验、技术要求较高，不能检测基因背景不清楚的等位基因。

（3)反向PCR-SSO：在PCR-SS◦基础上发展起来，预先把一组探针包被在固体介质上，尼龙膜、玻璃片或磁珠上，与待测样品包含等位基因外显子所有高变区域的PCR扩增产物进行杂交，根据杂交信号，判断实验结果。

优点：可大批量检测，也可小批量检测，在生产时已经完成对不同探针的优化步骤，结果判断比正向杂交方便，不同介质具有相应的优点，在使用磁珠作为介质时，可随时增加探针数量或进行更新(但一个位点探针数量不得超过99，否则需增加实验次数)，满足分辨率等实验要求，与流式细胞仪结合使用(目前多数使用LUMINEX机器)，杂交步骤简单，结
果检测具有较高的敏感性和良好的重复性。

缺点：不能检测基因背景不清楚的等位基因，使用磁珠作为介质时，需要专用的LUMINEX流式细胞仪。

(4)PCR-测序：PCR扩增待测样品，得到等位基因相关外显子的PCR产物，使用测序引物，进行单链扩增后，用测序仪分析该产物的核苷酸组成，与HLA序列数据库比对，判断待测样品具体属于何种等位基因。

优点：可得到分辨能力最高的实验结果，包括基因背景不清楚的等位基因大部分实验过程可实行自动化，减少人为主观判断的误差，结合克隆制备等其他实验，可解决所有疑难分型；缺点：需要专门的测序仪等仪器，试剂费用较高，数据分析人员需要较高的技术能力的培训；电流不稳定时，可以出现无法察觉的错误萸光信号，导致序列分析差错。

(5)PCR-RFLP：PCR扩增待测样品，得到等位基因相关外显子的PCR产物，利用高变区域存在
的1~2个限制性内切酶位点，用内切酶消化后，处理后的PCR产物经电泳分析，观察是否有对应的不同的Il切片段，判断等位基因的型别。

优点：结果直观，观察、判断简便，适合小批量检测；缺点：不适合没有限制性内切酶位点或具有2个以上的酶切片段的等位基因；限制性内切酶活力容易受外界因素影响。

(二）HLA抗体检测
HLA抗体检测一般可分为3种情况：交叉配型只要了解供受者有无对应的淋巴细胞相关抗体存在，无需知道是哪一种抗体；实验方法一般采用微量淋巴细胞毒实验及抗人球蛋白-微量淋巴细
胞毒实验，采用供者的T、B淋巴细胞加上患者的血浆进行检测，也可加用患者的T、B淋巴细胞加上供者的血浆进行双向检测，移植前一般都应该进行该检测，检测到的抗体不局限于HLA
抗体，也有可能是抗白细胞上的其他抗原的。

所以一般可以用2种温度进行，常温(22℃)、37℃。

如22℃时的反应强度大于37℃时，所检出的抗体有可能是冷抗体，也可以用4℃重复以上实验，确认冷抗体的存在。

冷抗体一般不影响移植，所以临床意义较小。

而检测到其他抗体，则意味着具有该抗体的供者不适合该患者。

对于长期接受药物治疗或血透的患者，体内往往具有药物抗体或不明原因的反应性增强，一般不影响该供者的选择，除非有较强的反应出现，提示可能有未知抗体。

PRA(panel reaction antibodies，群体反应性抗体谱)检测用一组包含大部分HLA抗原的细胞板或
抗原板，其中常见抗原数量占多，少见的抗原数量略少，检测是否有对应的抗体存在，计算阳性的结果占总反应的比例。

由于比例受细胞板或抗原板中不同抗原放置数量、人种差异以及抗原的交叉反应抗原影响，对实验结果需要综合考虑，才能有效地选择合适供者。

实验方法用微量淋巴细胞毒实验或抗人球微量淋巴细胞毒实验(主要试剂为细胞板，已包被活的已知型别的淋巴细胞）、EL记A方法(主要试剂为抗原板，已包被已知型别的抗原)。

流式细胞仪检测抗体具有较高的灵
敏性。

但利用流式细胞仪检测出有相应的HLA抗体，并不是供者选择的绝对反指针，需要排除冷抗体、IgM、药物交叉抗体等情况。

所以该方法一般不单独用于HLA抗体筛选。

FLOW-PRA
是用流式细胞仪检测PRA。

另外还有种较新的方法：免疫荧光试验(immunofluorescence test，IFT)，该方法根据抗原抗体反
应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体(或抗原)作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。

在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

该方法可检测抗原也可检测抗体。

也可以用于检测粒细胞抗体等。