第12章龚雄 转基因动物生物反应器
细胞工程 (3)
优点： 转基因范围广，转移基因大，可达数百kb；且转基因不含任何
病毒基因组片段，绝对安全 。
缺点：整合机制不明确，无规律随机整合，多拷贝整合导致转基因不
表达；整合位点随机会造成转动物基因组的重排、突变、易位
缺失等；需显微操作仪，技术性要求强。
胚胎干细胞方法
胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细 胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的 多能干细胞。
ES细胞的扩增：离散ES细胞
置四孔培养板中培养
ES细胞的常规培养：ES细胞由四孔板转至培养皿进行常规培养
（二）ES细胞的基因组操作
将外源基因移入到ES细胞基因组后，既能高效稳定表达，又不 影响ES细胞的各种功能。
这就要求目的基因必须要定点参入，并且参入整合后，对原有基 因结构及功能没有影响或影响最小。
基因表达；尽管病毒载体被设计为复制缺陷型的，但在包装细胞的
包装过程中，若与整合型辅助表达基因组发生同源重组，就有可能 组装成野生型逆转录病毒颗粒，因此在构建具有商业价值的转基因 动物时，一般使用受到限制。操作繁琐。
习题（11）
名词解释：逆转录病毒载体，包装细胞 显微注射法生产转基因动物的优点和缺 点？ 逆转录病毒感染法生产转基因动物的原 理是什么？有何优缺点？
原核多位于周边部，体积较大，为主要注射对象）。注射针刺入细胞内进行 注射时，如细胞核微微发生膨胀，证明DNA已被注入，反之需重新进行注 射； 注射细胞数量越多越好； （9）用支持吸管把已注射细胞移入另一培养小滴中，使之与未注射细胞分开；
待
注射结束后，把所有细胞均移入培养液中，置入温箱培养30分种；
显微注射法获得转基因鼠的成活率
9讲第1节-转基因动植物生物反应器
上海交通大学医学遗传研究所： （1）1998年中国首头转基因羊。乳汁中表达人凝 血因子IX蛋白。人凝血因子IX是治疗血友病的药物。 （2）1999年，带有人血清白蛋白基因的转基因试 管牛——“滔滔”降生。
关键技术环节
使用合适的乳汁蛋白基因调控元件，构建合理有 效的乳腺组织特异性表达载体。
目前应用于乳腺特异性表达载体构建的乳蛋白基 因及调控序列的主要有：
四 应用举例
piggyBac载体
小结
转基因动物生物反应器
转基因生物反应器
谢谢
已有几十种药用蛋白质或多肽在植物中得到成功 表达
4.优点
生物活性好：能进行有效的翻译后加工，是能够大规模也是 最经济的生产蛋白质的生产系统。 构建容易：植物细胞易再生植株，生长周期短，易于快速筛 选出转基因阳性植株。不仅比构建动物生物反应器节省时间 ，而且技术更成熟，成功率更高。 成本低：外源基因可以通过种子遗传给下一代，扩大种植大 面积提高产量。 使用安全：表达系统中的非目的成分对动物无害，不存在其 他动物病原体污染的可能，对人畜安全。 免疫效果好：植物细胞中的疫苗抗原通过胃内的酸性环境时 可受到细胞壁的保护，直接到达肠内黏膜诱导部位，刺激黏 膜和全身免疫反应。
乳清酸蛋白(WAP）基因及其调控序列。 酪蛋白(Icasein)基因及其调控序列。 β-乳球蛋白(β-lactoglobulin)基因及其调控序
列。
乳白蛋白(α-lactalbumin )基因及其调控序列。
转基因动物的鉴定
目的基因的鉴定：检查动物体内是否有外源基因 的存在，以判明是否是转基因动物。可用聚合酶 链反应(PCR)、斑点杂交(Dotbloting), Southern 印迹分析等多种方法进行检测。 目的蛋白的鉴定：建立动物乳腺生物反应器的最 终目的是得到有活性的外源蛋白，因此，对目的 蛋白的检测非常重要。检测方法主要有： (1) SDS－聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE) (2) 酶联免疫吸附实验(ELISA) (3) Western印迹分析
转基因动植物生物反应器 综述
转基因动植物生物反应器生物技术1002摘要:生物反应器，指以活细胞或酶为生物催化剂进行细胞增殖或生化反应提供适宜环境的设备，它是生物反应过程中的关键设备。
随着转基因技术问世,生物反应器不再局限于传统“冷冰冰”的设备，而是富有生命特性的动植物。
动植物生物反应器指的是通过基因工程途径以常见的农作物或者活体动物，高效表达某种器官或组织，进行工业化生产功能蛋白等生物制剂。
本文为大家阐述了转基因动植物反应器的优缺点，研究进展及其应用。
关键词:转基因动物反应器，转基因植物反应器，优缺点，研究进展，应用一、转基因动植物生物反应器的优缺点1.1转基因动物生物反应器的优点1易养殖，实现大规模制备。
2通过乳腺和血液制备活性物质简单易行。
3可以通过动物细胞培养实现大量制备。
4产量高，转基因动物在每升乳汁中可得几十克产物，而转基因植物，微生物在每升培养液中只能获得几毫克。
5成本低，用细菌、酵母菌或动物细胞生产基因工程药物，反应条件要求严格，而转基因动物只需要正常饲养。
6用于转基因动物制药的受体牛、羊、猪等哺乳动物，与人类亲缘关系比细菌、酵母菌要近的多，所以其产品具有与人体自身产生的蛋白相同的生物学活性川。
7用转基因动物培植活体器官和组织，用于更替人体患病的器官和组织。
1.2转基因动物生物反应器的缺点1细胞培养需要昂贵的培养基和设备。
2转基因动物制备成本昂贵。
3转基因动物易产生一些伦理问题。
4目前转基因动物的研究存在理论基础薄弱、技术不完善等问题"使得转入的基因在受体动物基因组中存在着随机整合、调节失控、遗传不稳定、表达率不高等问题。
为确保转入的基因能得到高效表达并完全整合，关键是基因构建和位点整合。
5转基因表达产物的分离与纯化也存在问题，可能会出现要纯化的产物含量低的现象，还要确保去除引起人类变态反应的非人类蛋白。
6转基因表达产物的结构和生物活性是否与人体蛋白相似#转基因产品必须与人体产生的蛋白高度相似，以免人体对它产生免疫反应。
新课标高中生物人教版选择性必修123册生物世界〖植物细胞生物反应器简介〗
植物细胞生物反应器简介为了大量获得植物产生的次生代谢物，202150年代，科学家尝试将微生物发酵工艺用于植物细胞的悬浮培养，由此发明了植物细胞生物反应器。
[3]目前，植物细胞生物反应器主要包括植物细胞悬浮培养生物反应器和植物细胞固定化生物反应器。
1．植物细胞悬浮培养生物反应器植物细胞悬浮培养生物反应器分为搅拌式和非搅拌式两大类。
搅拌式生物反应器通过机械搅拌使培养的细胞悬浮和通气，优点是搅拌充分，供氧充足，反应器中的温度、H及营养物质浓度易于调节，但搅拌装置有剪切力，对细胞会造成一定影响。
利用搅拌式生物反应器可培养烟草、葡萄、长春花等植物的细胞。
非搅拌式生物反应器结构简单，对细胞的剪切力小，它又分为气升式、鼓泡式和转鼓式等类型。
气升式生物反应器可以通入无菌空气，空气沿着反应器内部的管路流动，带动培养液进行循环，实现供氧和混合的目的。
这种反应器的优点是对植物细胞的伤害小，培养液能不断循环，混合效果好，有利于提高细胞浓度和次生代谢物的产量，可见气升式生物反应器十分适合植物细胞的培养。
[3]鼓泡式生物反应器结构简单，反应器从底部通入无菌气体产生大量气泡，气泡在上升过程中起供氧和混合的作用。
鼓泡式生物反应器的操作更为平缓，但混合效果不好，适合培养对剪切力敏感的细胞，不适合高密度和黏度较大的培养体系。
利用鼓泡式生物反应器可培养人参、藏红花等植物的细胞。
[4]转鼓式生物反应器通常为卧式或略微倾斜，通过转盘或转鼓的旋转实现混合的目的。
转鼓也称为滚筒，它的转动速率很慢。
转鼓式生物反应器具有悬浮系统均一、剪切力弱、供氧效率高等优点，适合高密度植物悬浮细胞的培养，目前已用于培养蔓长春花、紫草、烟草等植物的细胞。
2．植物细胞固定化生物反应器植物细胞的固定化就是将细胞固定在多糖或多聚化合物等载体上，以便在不同类型的反应器中进行培养。
固定化培养可以降低剪切力，固液特定界面的接触也比较多，有利于次生代谢物的积累。
固定化培养适合进行连续培养或生物转化等，目前已用于培养辣椒、毛地黄、雷公藤、胡萝卜等植物的细胞。
生物学转基因动物与动物生物反应器
基 因 打 靶 流 程 图
• 基因打靶的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和 同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技 术的进一步发展。
• 基因打靶的研究进展迅速，给现代生物学和医学 研究带来了革命性的变化，并直接引发了现代生 物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展， 成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效 的方法之一。
缺点：
转入的外源基因的大小受到限制, 一般在10kb 以下。
获得纯合体的转基因动物的机会少。 病毒载体构建复杂。 可能出现病毒自身基因的复制表达问题等。
3 胚胎干细胞（ES细胞）法
将外源基因导入体外培养的ES细胞。 可以通过逆转录病毒感染、脂质体介导、电穿
孔、磷酸钙共沉淀等方法将外源基因导入ES细 胞。 将携带有外源基因的ES细胞注入到动物的早期 胚胎内，可产生嵌合体及转基因动物。
转基因动物的应用
（1）基因表达与调控的研究 将转基因导入动物受体细胞内,研究该基因在体
内的表达调控特征及其相应的生物学效应,这是转 基因动物的一种应用途径。 当转基因动物的外源目的基因插入某一内源基因 后, 可能会破坏该内源基因的功能,造成某一基因 功能的缺失。通过这种基因剔除的方法可阐明某 一特定基因在发育过程中的功能。
得纯系转基因动物。
Injection of ES cells into
blastocysts
优点：
外源基因整合情况的可控性高。 可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定
位、表达的水平及插入的稳定性。
外源基因导入ES细胞的方法Fra bibliotek样，细胞鉴定及
筛选方便。 该方法遗传修饰能力强且十分精确,基因
目前, 已经培育出了动脉粥样硬化、镰刀形红细胞 贫血症、痴呆症、自身免疫病、淋巴系统病、真 皮炎及前列腺癌等多种疾病的模型动物,为这类疾 病的研究提供了方便。
《动物生物反应器》教学大纲
《动物生物反应器》教学大纲课程名称：动物生物反应器课程编号：课程类别：专业方向课/必修课学时/学分：32/2开设学期：第五学期说明一、课程性质与说明1.课程性质专业方向课/必修课2.课程说明动物生物反应器是利用转基因活体动物，高效表达某种外源蛋白的器官，进行工业化生产功能蛋白质的技术。
目前随着人们对转基因技术的熟练应用和蛋白质基因表达调控认识的不断深入以及当前市场需求，人们利用动物生物反应器生产各种具有生物活性的产品，是当前生物技术的尖端和前沿研究项目，并向商业化阶段转变，显示了广阔的应用前景。
二、教学目标1.使学生熟悉动物生物反应器的基本原理，理解转基因动物的相关理论；2.拓展学生知识面，使学生对生物技术前沿有明确的认识，初步培养学生科研思维能力。
三、学时分配表章序章题讲授学时1绪论42动物生物反应器类型 43转基因动物的主要技术步骤74建立动物生物反应器模型的方法与技术85动物生物反应器应用实例76动物生物反应器存在的问题及发展前景2合计32 四、教学教法建议以讲授为主，课堂讨论与自学相结合，并辅以多媒体手段进行教学，在有限的学时数内，较为全面地介绍学科的基本理论和学科发展的前沿进展。
五、课程考核及要求1.考核方式：考试（√）2.成绩评定：记分制：百分制（√）成绩构成：总成绩=平时考核（30%）+ 期末考核（70%）。
本文第一章绪论教学目标使学生识记动物生物反应器的基本概念；知道生物反应器发展简史及其研究内容。
教学时数4学时教学内容一、动物生物反应器的基本概念二、生物反应器发展简史三、动物生物反应器主要研究内容教法建议讲授法考核要求识记动物生物反应器的概念；明确动物生物反应器的研究内容；了解动物生物反应器的简史。
第二章动物生物反应器类型教学目标使学生列举出动物生物反应器类型教学时数4学时教学内容第一节动物乳腺生物反应器第二节动物血液生物反应器第三节动物膀胱生物反应器第四节动物精液生物反应器第五节家禽生物反应器教法建议多媒体课件，讲授为主。
家畜育种学课件第十二章西北农林科技大学(共64张PPT)
(6) 把引入后的受精卵移植到子宫，完成胚胎发育； (7) 检测幼畜是否整合外源基因、外源基因的表达情况以及外源基因在其后代
中的传递情况。部分后代细胞携带有转入的外源基因，利用这些动物培育 新的品系。
三、导入基因的方法
(一) 显微注射法 (二) 精子载体法 (三) 胚胎干细胞(ES)介导法
替代人奶，或增加牛奶中某些蛋白质的浓度，改变牛奶加工处
理的性能等，目前分离出改变奶成份的有关基因。
(3) 利用家畜生产药物蛋白的研究
htPA (人组织型纤溶酶原激活剂)
五、转基因动物的应用前景
应该看到，今天人类在转基因动物方面所取得的成果还仅 仅处在起步阶段。随着生命科学各个领域的不断发展，新的 突破会不断产生，一些在实验室中获得的结果可以不断地运 用到生产实践中去。例如，澳大利亚、新西兰、南非、英国 等主要产羊毛国家目前正在致力于开发一种可以生产彩色羊 毛的高产的转基因羊。类似的设想还很多，相信在未来，人 们可以创造出更多有良好经济效益的物种，使地球的生物圈 变得更加丰富多彩。转基因技术的诞生、成熟和推广正在给
▪ 胚胎干细胞(embryonic stem cell)是指当受精卵分裂发育成囊胚时内 细胞团的细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特
性。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为机体几乎所 有的细胞类型。胚胎干细胞注入寄主胚泡后，参与胚胎形成，进入嵌 合体动物的生殖系统。
▪ 用DNA转染法或反转录病毒介导法可将基因导入胚胎干细胞，选出带有目的 基因的细胞克隆，然后导入受体胚胎。由此法生成的后代都是嵌合体，若由 这些嵌合体胚胎中再分离出干细胞，用核移植技术将其细胞核植入无核卵 细胞，这样可以提高转基因的效率。
转基因动物生物反应器研究进展
制 的周 期来 算 ， 主要取 决 于动物 的泌 乳周 期 。 其 中
转 基 因猪 １ ２个 月 ， 转 基 因绵羊 ｌ ８个 月 ， 转基 因奶
牛 １ ５ ～２ ９个 月。
心 的新 型制 药公 司 ，在世 界 范 围 内掀 起 了一 个前
１ 转基 因动物 生物 反 应器 生 产 医用 蛋 白 药 物 的 优 越 性
与传统 的 生物反 应器 相 比 ，转 基 因动 物 生物 反应器 有着 不可 比拟 的优 越性 。一是转 基 因动 物
可 以不断繁 殖扩 群 ， 而 一个 动物 就像 一 个“ 天然 药 物 工厂 ” ， 从 而可 以大 规模 地生 产 出无 免疫 原性 且
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ３ － ０ ６ — １ １
： 通讯作者 基金项 目 ： 国家青年 自 然科学基金项 目（ ３ １ １ ０ １ ６ ８ ９ ） ； 广东 省科技计 划项 目（ ２ ０ １ Ｉ Ａ ０ ２ ０ ９ ０ １ ０ ０ １ ； ２ ０ １ ｉ Ａ ０ ２ ０ １ Ｏ ２ ０ Ｏ ３ ）
成本， 而 转基 因动物 生 物 反应 器 只需 ０ ． ０ ２ ～０ ． ５ ０ 美元， 这 样大 大 降低 了投 资的风 险 。 三 是研 发周 期
公 司为 代表 的几 十家 利用 转基 因动 物 生物 反 应器 生产 贵 重 医用蛋 白药 物 的公 司 ， 已生 产 出一 百 多 种 珍贵 的医 用 蛋 白药物 ， 有些 如 人 ｈ Ｆ ｖ ｍ 、 ｈ ａ卜Ａ Ｔ
等 正处 于 临床 试 验阶 段 ，有些 已经 进 入Ｉ Ｉ Ｉ 期 临床 阶 段 。２ ０ ０ ６年 和 ２ ０ ０ ９年 美 国 Ｇ Ｔ Ｃ公司 用 山羊 乳
第12章龚雄转基因动物生物反应器
精子与外源DNA结合的机理
• Smdrdora(1998) 的研究结果表明。只有附 睾精子和经洗涤去精清的精子才能有效地 携带外源DNA，这说明精浆中某种因子强烈 抑制外源DNA的结合。这些因子可能直接作 用于DNA分子，也可能竞争结合在精子表面 的结合部位而间接起作用。
三 转基因动物的应用
• 1.基因改良动物； • 2.转基因动物生物反应器； • 3.建立人类疾病的动物模型； • 4.生产可移植用的动物器官； • 5.基因治疗(动物模型)； • 6.基因打靶;
1 基因改良动物
抗病育种 提高生长速度
提高羊毛产量和性能 抗冻品种培育
美培育转基因鳟鱼：腹肌有6块,肉多15%
2 转基因动物生物反应器
如荷兰的GenPharm公 司用转基因牛生产乳铁 蛋白，预计每年从牛奶 生产出来营养奶粉的销 售额是50亿美元。
携带人血清白蛋白基因的转基因 试管牛“滔滔”
受精卵
显
微
注
显微注射
射
法
操
胚胎移植
作
流
程
后定检测
显微注射法的优缺点：
优点： a、转移率较高、整合效率达20%； b、外源基因长度可达数百Kb； c、可得纯系动物； d、周期相对较短。
缺点： a、有时会导致转基因动物的基因 组的重排、易位、缺失或定点突变。
2 胚胎干细胞法
胚胎干细胞（ES）是一种含正常二倍染色体的具有 发育全能性的细胞， 因此只要将外源DNA导入胚胎 干细胞就可以实现基因的转移。
获得功能基因 构建基因打靶载体 转染胚胎干细胞获得基因剔除细胞系
制备嵌合体 筛选进入生殖系小鼠 转基因小鼠（F1）表型分析 选择单系同胞交配产生（F2）代 筛选纯合子的转基因小鼠
转基因动物生物反应器的基因构建与表达
转基因动物生物反应器的基因构建与表达摘要近年来，生物学和分子生物学研究领域的成就促进了转基因动物生物反应器的蓬勃发展。
用转基因动物生物反应器生产药用蛋白是生物技术领域里的又一次革命，它以一个全新生产珍贵药用蛋白的模式区别于传统药物的生产。
本文着重介绍转基因动物生物反应器的基因构建以及转基因动物组织特异性表达的最新进展。
以合理的费用获取大量在人体内原本稀少的血浆蛋白在不久前还只是幻想。
然而，近年来生物学和分子生物学取得的显著进展终于使这种幻想成为现实。
其中，将外源DVA用显微技术注入生殖细胞的原核，将重组DVA转入小鼠胚胎细胞和将DVA整合入宿主染色体和种系传递等重要发现，使用转基因（Tg）动物生产药用蛋白成为可能。
此外，生物学技术的发展，如对卵细胞的获得、操作以及再植入和重组DNA等技术进步都为转基因动物生物反应器的成功提供了保证。
转基因动物生物反应器生产药用蛋白一般有两种技术路线。
第一种是将目的基因在同源组织中表达蛋白质；第二种是将目的基因构建成杂合基因，转入动物胚胎，通过转基因动物的分泌器官收集并提纯药用蛋白。
转基因动物分泌的蛋白经过后加工酷如人体天然蛋白的结构，也有完全相似的生物活性。
同源组织中表达蛋白质目前，在同源组织中表达蛋白质最典型的例子是在动物的红细胞中表达人的血红蛋白。
在人的血红蛋白基因编码序列里启动子有2个CACCC盒，而对应的猪的启动子里只有一个，另一个靠近它的是CGCCC盒。
Sharma等[1]将猪的β-启动子与人的β编码基因融合，并将人的β-基因座调控区（β-LCR）和α、ε基因与融合基因的β基因连接在一起构成载体，转入猪胚胎细胞，从转基因猪分泌乳汁中得到的重组人血红蛋白含量高达32g/L。
在转基因动物的分泌器官中生产蛋白转基因动物表达重组蛋白多以乳腺、唾液腺和膀胱为靶位。
在这些表达器官中，通过构建合适的载体，选择适当的启动子和调控序列可产生比正常水平高得多的重组蛋白。
不过，生产系统应尽可能与循环系统隔离，以减少表达产物对宿主动物的影响。
十二转基因生物反应器
2、转基因动物的技术（方法）
培育转基因动物的关键技术包括：外源 目的基因的制备，外源目的基因的有效 导入，胚胎培养与移植，外源目的基因 表达的检测等。 核心技术是如何成功地把目的基因转入
1）目的基因的制备(分为二步) 的导入(核心技术)
（1）原核期胚胎基因显微注射法：通过显 微操作仪将外源基因直接注入受精卵
基本步骤 目的基因的制备与纯化 卵供体动物和假孕动物的准备 超排卵、受精与取卵 基因显微注射:将纯化的目的基因注射到受 精卵的雄性原核内 受精卵移植 目的基因的表达整合鉴定和检测
特点：用显微注射方法制备转基因动物， 操作技术性很强，即使是受过严格训练 的专业人员，发育成转基因动物的受精 卵也只占注射卵的5%； 导致基因组的重排、易位、缺失等。
4.培育方法 例子：西红柿疫苗
优点：
生物活性好：能进行有效的翻译后加工，是能够大规 模也是最经济的生产蛋白质的生产系统。 构建容易：植物细胞易再生植株，生长周期短，易于 快速筛选出转基因阳性植株。不仅比构建动物生物反 应器节省时间，而且技术更成熟，成功率更高。 成本低：外源基因可以通过种子遗传给下一代，扩大 种植大面积提高产量。 使用安全：表达系统中的非目的成分对动物无害，不 存在其他动物病原体污染的可能，对人畜安全。
（二）转基因动物鉴定技术
用PCR、Southern bolt(DNA印迹)、荧光原 位杂交等方法在染色体及基因水平上进 行整合鉴定 用RT-PCR、Northern blot(RNA印迹)和 Western blot（蛋白质印迹）等方法在 转录及蛋白质水平上进行表达检测。
三、转基因动物技术的意义
12.2 转基因动物细胞生物反应器
动物转基因与生物反应器思考题甄选.
动物转基因与生物反应器思考题(优.选）动物转基因与生物反应器思考题1．转基因动物的概念、主要研究内容以及现状和前景。
（找不到前景）概念：将外源基因导入动物的受精卵或早期胚胎细胞，使之整合到动物的基因组并获得表达，由此外源基因能随着细胞的分裂而增殖，并能稳定地遗传给下一代的动物称为转基因动物。
主要研究内容：提高动物品种的抗性；提高生长速度；改良动物的适应性；改良动物的生产性状；动物反应器现状：同基因重组微生物和转基因植物相比，转基因动物的技术效率很低，费用高，消耗多，产生有用结果耗时长。
概括如下：①生产转基因动物需要高水平DNA操作1.到目前为止，真正了解其全部表达调控元件的动物基因只有少数几个。
2.对大多数基因来讲，我们还只能分离它近5′端的启动子，及近5′端和近3′端的增强子。
3.转基因动物的载体已变得相当大，加上目的基因序列，表达结构的总长度一般都在10kb以上，长的可以达到20-30kb。
4.表达仍需受基因插入位点附近染色体环境的影响，产生所谓的基因表达“位置效应”。
②动物转基因技术效率低下显微注射仍旧是最常用的动物转基因技术。
显微注射DNA不仅需要昂贵的设备和训练有素的操作人员，而且效率低下（按照注射和移植的胚胎数来计算，每生产一只转基因绵羊、山羊或猪，大体需要注射100个单细胞胚胎。
生产转基因牛的效率更低)生产转基因动物方法，还有精子介导、逆转录病毒载体转染和ES细胞途径等。
2．为什么要研究和应用转基因动物，为什么不能用离体培养的动物细胞取代转基因动物呢？1.应当认识动物细胞不等同于自由生活的细菌和酵母菌，它是复杂的动物体的基本单元。
因此，当动物细胞离体培养时，它们的许多特性迅速消失。
2.在离体状况下，要维持细胞在体内相同甚至相近的环境条件，也是不可能的。
3.有些基因转入动物细胞系中后，与把它们转入转基因动物中的行为有很大差别。
离体培养的细胞中缺少某些能够通过结合到内含子上而刺激基因表达的组织特异性因子。
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转基因花菜棉羊
鸡冠花公鸡头变异
四 转基因动物存在的问题
• 1.外源基因表达效率低和遗传丢失； • 2.转基因技术尚不成熟；
• 3.转基因动物成活率低及其后遗症；
• 4.转基因动物及其产品的安全性问题；
转基因离我们有多远？
富含维他命A 的黄金大米
餐桌上的转基因鱼
转基因大米养殖出的猪肉
1 基因改良动物
抗病育种
提高生长速度
提高羊毛产量和性能
抗冻品种培育
美培育转基因鳟鱼：腹肌有6块,肉多15%
2 转基因动物生物反应器
如荷兰的GenPharm公
司用转基因牛生产乳铁
蛋白，预计每年从牛奶
生产出来营养奶粉的销
售额是50亿美元。
携带人血清白蛋白基因的转基因 试管牛“滔滔”
1974年，Jaenish和Mintz把SV40病毒注射到小鼠胚胎， 获得了SV40 DNA转基因小鼠；
1980年，Gordon等人首先育成带有人胸苷激酶基因的
转基因小鼠； 1983年,Palmiter等人将大鼠生长激素基因导入小鼠受 精卵的雄原核中获得了转基因“硕鼠”（supermouse）
二 转基因动物的制备方法
唐氏综合症
卡氏肉瘤 成骨不全症 自毁容貌症
显微注射
反转录病毒转染 显微注射 ES细胞同源重组
Cu/Zn-SOD酶基因
HIV tat基因 突变的α1胶原蛋白前体基因 突变HGPRT基因
_____________________________________________
4 生产可移植用的动物器官
精子与外源DNA结合的机理
• Smdrdora(1998) 的研究结果表明。只有附 睾精子和经洗涤去精清的精子才能有效地 携带外源DNA，这说明精浆中某种因子强烈 抑制外源DNA的结合。这些因子可能直接作 用于DNA分子，也可能竞争结合在精子表面 的结合部位而间接起作用。
三 转基因动物的应用
• • • • • • 1.基因改良动物； 2.转基因动物生物反应器； 3.建立人类疾病的动物模型； 4.生产可移植用的动物器官； 5.基因治疗(动物模型)； 6.基因打靶;
3 精子载体导入法
• 精子载体导入法是一种直接用精子作为外 源DNA载体的转移方法。 • 基本方法是：精子直接与外源DNA混合培养， 外源基因可以进入精子头部，受精后就可 以发育成转基因动物。
1989 年, Lavitrano等将质粒与小鼠的附睾精子，在 等渗溶液中共育30 min 后进行体外受精和移植产生 转基因阳性小鼠并能遗传给后代。 Rottman 等对上述精子载体法进行了改进，其将外源 DNA 用脂质体包埋，再与鸡精子共同孵育，然后人工 受精取得成功。 Anthony等尝试了一种新的方法， 预先将小鼠的精子 进行破膜处理，再与外源基因共孵育1 min ，然后将 精子头部显微注射入M Ⅱ期的小鼠卵母细胞，获得成 功。该项研究揭示，精子膜破损后外源DNA 穿过外膜 吸附于内膜,更有利于转基因动物的产生。
人们对于转基因的担忧
伦理问题
未来登上《时代》周刊的全球 三大杰出女性
结语
转基因动物已经离我们很近了，其
表达产物中可能存在引起人类不良反
应的非人类蛋白，但是目前还无法确 定其安全性。为此，只能依靠科学家 们的不懈努力来给出我们肯定的答案。
• 著名科学家谈家桢院士（左）、著名老中医徐蔚霖教授与 曾溢滔院士在转基因牛“滔滔”模型前留影
• 曾溢滔院士与世界克隆羊“多利”之父威尔穆特博 士进行学术交流
3 建立人类疾病的动物模型
已建立的部分人类疾病的转基因动物模型
_____________________________________________
基因敲入(gene knockin)：定向替代
基因打靶的研究意义
基因功能研究 人类疾病动物模型的研制 经济动物遗传物质的改良
肌肉生长抑制素基因 Myostatin基因敲除
• Myostatin基因是一种特异性骨骼肌生长发 育的抑制因子。该基因与动物骨骼肌总量的 调节有关，其序列在进化过程中高度保守， 所有哺乳动物和鸟类均有很高的同源性。 Myostatin基因在功能上也是非常保守的， 其功能的缺失会造成可导致肌肉异常肥大。
（2）可以进行定向变异和育种，利用同源重组技术对 ES细胞进行遗传操作，通过细胞核移植生产遗传修饰 性动物，有可能创造新的物种；
（3）利用ES细胞技术，可在细胞水平对胚胎进行早期 选择，这样可以提高选择的准确性，缩短育种时间。 近年来的研究表明，利用ES细胞生产转基因动物在动 物生产中发挥着极为重要的作用。
• 我国每年有150万人需要器官移植，但是 仅仅不到1万人能够得到供体。 • 猪的脏器移植给人，会发生超急性排斥反 应。 • 转基因技术生产能降低或掩盖半乳糖基转 移酶活性的转基因猪。
Science (2002). 295, 1089–1092
5 基因治疗
上世纪九十年代初，一位因ADA(腺苷
酸脱氨酶 ) 基因缺陷导致严重免疫缺
第12章 转基因动物
会飞的小狗
进行光合作用的蜻蜓
汇报人：龚雄
生命科学学院1103班
目录
一 转基因动物 二 转基因动物的制备方法 三 转基因动物的应用
四 转基因动物存在的问题
Hale Waihona Puke 一 转基因动物 基因工程技术 胚胎工程技术
转基因动物
• 转基因动物（transgenic animal） 是指借 助基因工程技术将外源基因导入受体动物染 色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞 的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传 给后代的动物。
显微注射
胚胎移植
后定检测
显微注射法的优缺点：
优点： a、转移率较高、整合效率达20%； b、外源基因长度可达数百Kb； c、可得纯系动物； d、周期相对较短。 缺点： a 、有时会导致转基因动物的基因 组的重排、易位、缺失或定点突变。
2 胚胎干细胞法
胚胎干细胞（ES）是一种含正常二倍染色体的具有 发育全能性的细胞， 因此只要将外源DNA导入胚胎 干细胞就可以实现基因的转移。
损的四岁女孩，由美国国立卫生研究 院用 ADA 基因治愈。“基因治疗”研 究热从此波及全世界，起而效颦，为 保障人类健康展现了美好的前景 。
6 基因打靶
• 基因打靶(Gene targeting)是一种在胚胎干 细胞(ES)技术和同源重组技术的基础之上,定 向改变生物活体遗传信息的实验手段。
基因敲除(gene knockout)：定向敲除
获得功能基因
构建基因打靶载体
转染胚胎干细胞获得基因剔除细胞系 制备嵌合体 筛选进入生殖系小鼠 转基因小鼠（F1）表型分析 选择单系同胞交配产生（F2）代 筛选纯合子的转基因小鼠
胚胎干细胞法建立转基因鼠的实验程序
与传统育种方法相比较，ES细胞在生产转基 因动物方面表现其独特的优势：
（1）打破了物种的界限，突破了亲缘关系的限制，加快 了动物群体遗传变异程度；
疾病模型 老年性痴呆征 Ⅱ型糖尿病 β地中海贫血症 镰刀形细胞贫血症 基因转移方法 显微注射 显微注射 显微注射 显微注射 转导的基因 β淀粉样蛋白基因 胰岛淀粉样多肽基因 人β珠蛋白基因 人α和β珠蛋白基因 ______________________________________________________
左图为德国“娃娃超人”未满月时的照片，右图为 他7个月时的照片。白色和黑色的箭头指示着他超凡 的小腿和大腿肌肉
比利时蓝牛肌肉增加表型
皮埃蒙特牛肌肉增加表型
双肌
Myostatin基因敲除“超级鼠”
转基因的其他应用
美国公司研制出可当宠物出售的 转基因荧光鱼
梦幻之畜——转基因动物
•
小老鼠猕猴桃绿色血
1.原核期胚胎显微注射法 2.胚胎干细胞移植法 3.精子载体导入法 4.反转录病毒感染法 5.卵母细胞显微注射法 6.转基因克隆动物
1 原核期胚胎显微注射法
Microinjection into the Pronucleus of a Bovine Zygote
受精卵
显 微 注 射 法 操 作 流 程