流式及分子诊断进展(崔巍)

2016 WHO 髓系肿瘤新分类
2016 WHO 髓系肿瘤新分类
2016 WHO 髓系肿瘤新分类
MDS: Report requirements and tips
Report: • Must still count morphologic blast % in blood and BM and include actual % in report • Provide % dysplasia (any unique features) • Flow cytometry “ok” as ancillary tool, but not required • Flow blast % should not replace morphologic % • Cytogenetics required on all cases (del 5q, other) • Molecular testing has utility (e.g. SF3B1 (if rings), NPM1 (if approaches AML), TP53 (prognosis) )
正常造血过程中： 原始细胞向单核细胞分化：CD45增强（绿色箭头） 原始细胞向粒细胞分化：先是颗粒增多/SSC增强，早幼粒时SSC达到顶峰，后颗粒减少， CD45增强（橙色箭头） MDS时：粒细胞颗粒度减低/SSC减小，“Blast hole”被趋于成熟的粒细胞占据，单用 CD45/SSC射门时可能导致原始细胞计数不准确
MDS患者幼稚单核细胞 (CD36+CD14-)增多 或成熟单核细胞CD14表 达减弱/缺失
MDS患者单核细胞 异常表达CD56
Leukemia (2012) 26, 1730 - 1741
MDS病态造血表现——红系组分
MDS患者红系组分CD71/CD235a表达模式改变
Leukemia (2012) 26, 1730 - 1741
粒细胞/ 巴细胞 SSC 峰值比 得分≥2 时即为符合 MDS
Ogata流式评分系统
P4
Della Porta MG, et al. Haematologica. 2012;97(8):1209–17.
MDS分子诊断进展
90%MDS存在重现性基因突变
Rafael Bejar, and David P. Steensma Blood 2014;124:27932803
500,000 细胞/管 上机检测
PBS+ 0.5%PFA
室温放置 ＜24小时
室温 10分钟
＜300g
室温，避光 15分钟
抗体选择
粒细胞成熟过程中核心标志物表达水平的变化趋势
原始 早幼 中幼 晚幼、杆状核 分叶核
Leuk. Res. 2008;32(1):5–17.
MDS病态造血表现
正常对照 MDS
诊断——SF3B1突变
SF3B1: Splicing Factor 3B Subunit 1 (剪接因子3B亚基1) 其编码蛋白是剪切体中U2小核核糖核蛋白（U2snRNP）的核心成分,在RNA剪接 过程中发挥重要作用。 SF3B1基因突变引起的异常剪接与多种恶性血液病有关。
Yoshida K, et al. Nature 2011; 478: 64-69.
Leuk. Res. 2008;32(1):5–17.
MDS病态造血表现——粒细胞
粒细胞CD13/CD16表达模式 正常对照 MDS
MDS患者未成熟粒细胞CD13表达缺失
Leuk. Res. 2008;32(1):5–17.
MDS病态造血表现——粒细胞
MDS患者中性粒细 胞颗粒度减少
粒细胞CD13/CD16 表达模式异常
SF3B1突变见于75.3%的RARS/RCMD-RS
Yoshida K, et al. Nature 2011; 478: 64-69.
K700E为SF3B1最常见突变位点
Papaemmanuil E, et al. N Engl J Med 2011; 365: 1384-1395.
SF3B1突变MDS表型特征
骨髓增生异常综合征诊断与治疗中国专家共识（2014 年版）
诊断方法
MDS免疫分型
Ø Ø Ø Ø
操作流程的规范化 抗体选择 分析方案的选择 流式积分系统
操作流程
抗凝剂： 首选肝素 (备选EDTA) 骨髓标本 裂解红细胞
氯化铵 红细胞裂解液 (不含固定剂） 离心 洗涤 染色
PBS+ 0.5%BSA/HSA 洗涤 固定
MDS流式评分系统
MDS流式评分系统
Ogata流式评分系统
流
表 Ogata 参数 CD34+髓系原始细胞百分比(%) CD34+B 系祖细胞百分比(%) 淋
式评分系统 cut-off 值 ≥2 ≤5 ≤4 或≥7.5 ≤6 得分 1 1 1 1
巴细胞/髓系原始细胞 CD45 平均荧光强度比值 淋
Leukemia (2012) 26, 1730 - 1741
MDS病态造血表现——单核细胞
单核细胞/粒细胞 CD11b/HLA-DR表达模式
正常对照 MDS
MDS患者单核细胞 增多，且HLA-DR弱 表达部分显著增多
粒细胞正常
Leuk. Res. 2008;32(1):5–17.
wk.baidu.com
MDS病态造血表现——单核细胞
骨髓增生异常综合征诊断与治疗中国专家共识（2014 年版）
诊断标准
当患者符合必要条件、未达确定标准、临床表现高度疑似 MDS 时，应进
行MDS辅助诊断标准指标的检测 辅助标准： ① 流式细胞术检查结果显示骨髓细胞表型异常，提示红细胞系和（或） 髓系存在单克隆细胞群； ② 遗传学分析提示存在明确的单克隆细胞群； ③ 骨髓和（或）外周血中祖细胞的 CFU（±集簇）形成显著和持久减少。 符合者基本为伴有骨髓功能衰竭的克隆性髓系疾病，此类患者诊断为高度 疑似 MDS。
MDS免疫表型及分子诊断进展
崔巍 中国医学科学院肿瘤医院
背景 MDS诊断进展
细胞表面分子
流式细胞术免疫分型
单纯形态学 1976年FAB分型
细胞内部遗传物质
染色体核型 + 基因分子生物学
诊断标准
MDS 诊断需满足两个必要条件和一个确定标准 (⑴)必要条件： ① 持续一系或多系血细胞减少：红细胞 (HGB<110 g/L)、中性粒细胞 [中性粒细胞绝对计数 (ANC)<1.5×109/L]、血小板 (PLT<100×109/L)； ② 排除其他可以导致血细胞减少和发育异常的造血及非造血系统疾患 (2) 确定标准： ① 发育异常：骨髓涂片中红细胞系、粒细胞系、巨核细胞系中发育异 常细胞的比例≥10%； ② 环状铁粒幼红细胞占有核红细胞比例≥15%； ③ 原始细胞：骨髓涂片中达 5%～19%； ④ MDS 常见染色体异常。
• 白细胞计数更高 • 血小板计数更高 • 无进展生存期更长
Papaemmanuil E, et al. N Engl J Med 2011; 365: 1384-1395.
SF3B1突变有望成为独立亚型纳入MDS诊断标准
Malcovati L, et al. Blood. 2014;124(9):1513–21.