实验方案_低温乙醇法从人血清中提取免疫球蛋白

低温乙醇法从人血清中提取免疫球蛋白

一、实验目的

利用低温乙醇法从人血清中分离出免疫球蛋白（Ig），并获得副产物血清白蛋白。

二、实验原理

（1）低温乙醇法Cohn6法：美国哈佛大学Ｅ·Ｊ·COHN教授研究组，在短短两年建立了低温乙醇分段提取法。

方法原理：往蛋白水溶液中加入中溶性有机溶剂，如乙醇、丙酮等，主要是降低水分子的活度，降低溶液的介电常数，从蛋白分子周围排斥水分子，使蛋白分子之间通过极性基团的相互作用，在范德华力作用下，发生凝聚。不过由于有机溶剂存在，降低了蛋白分子表面憎水基团的作用，因而引起蛋白分子聚集的主要极性基团的相互电荷之间的引力。（文献20）

分离过程中，二法通过五个因素的变动(五变系统)，使很多血浆蛋白质得以分离。这五个因素及其各自的作用是；①乙醇：使蛋白质分子“脱水”；⑦pH值；蛋白质在等电点时易于沉淀；②电解质浓度：在低离子浓度下，对蛋白质溶解度有较大影响；④蛋白质浓度：浓度越低，其沉淀作用越小；⑥温度：在低温下，可避免乙醇对蛋白质的变性作用。同时，蛋白质溶解为吸热反应，溶解度随温度上升而增高。

经实验得知，利用低温乙醇法能将血清蛋白分成六个组分（Ⅰ~Ⅵ），其中免疫球蛋白IgG主要存在于Ⅱ+Ⅲ中，白蛋白Alb主要存在于Ⅴ中。

(2) Cohn氏9法；该法对Cohn氏6法的组分Ⅱ+Ⅲ作进一步分离和提纯，可获得组分Ⅱ—l，2，3(Y—G)，组分Ⅲ一1(同种凝集素)，组分Ⅲ—2(凝血酶原)，组分Ⅲ—3(血浆酶原)等产品。其工艺流程见图:

乙醇法生产中所用的乙醇是通过予冷、慢速搅拌滴入的。其体积可按下式计算：

式中V＝所需乙醇体积；V

0＝原来溶液体积；C

1

＝原来溶液乙醇浓度；C

2

＝

所需达到乙醇浓度；C

3

＝加入乙醇的浓度。

三、材料和试剂

3.1 血清：100 mL

3.2 相关试剂：95%乙醇，pH

4. 0醋酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液Ⅰ，磷酸盐缓

冲液Ⅱ，3 mol/L NaCl溶液，1 mol/L NaHCO

3

，生理氯化钠溶液，麦芽糖，

3.3 实验仪器：

四、方法与步骤

基本思路：

血清的初处理——利用Cohn6法得到组分Ⅱ+Ⅲ——利用Cohn9法得到IgG——IgG沉淀的保存（浓缩蛋白液或冻干品）——Ig物理性状及生化检定（蛋白含量、纯度、免疫活性、稳定性）

4.1 血清的初处理（文献[4]，名词.txt中关于血清的部分）

（1）将血清从冷冻箱（-5C至-20℃）取出后，先置于2-8℃冰箱使之溶解（2）在室温下使之全溶。以上操作注意随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

（3）热灭活（目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质，通常因为高温处理影响了血清的质量，故省略）。

4.2 低温乙醇法提取Ig及副产物Alb（生物制品基础摘录4~5，文献4、17）

（1）量取血清体积100 mL，搅拌降温至0~4℃，将血清调pH 7.2，调节NaCl 浓度至0.14 mol/L，加乙醇至8%，加入乙醇的时间控制在60~90 min；从加乙醇开始起为反应体系降温，保持反应温度在-2~-4℃；加完乙醇后取样测pH值，调节pH值为7.2；继续搅拌1 h，静置30 min；3000 r/min离心10 min，去除上清，收集沉淀并称取质量。

（2）沉淀中加入0~4℃的注射用水，加水量为沉淀质量的7倍，持续搅拌直至成为均匀的蛋白浆；取样测pH值，蛋白浆中加磷酸盐缓冲液Ⅰ在-5℃，调pH 6.9~7.1，加0.05 mol/LNaCl，加乙醇至25%，从加乙醇开始起为反应体系降温，保持反应温度在-5℃；加完乙醇后取样测pH值，调节pH值为6.9~7.1；继续搅拌1 h，静置30 min；3000 r/min离心10 min，去除上清，收集沉淀并称取质量，沉淀即为免疫球蛋白。

（3）将上述操作所得清夜在-5℃，调节pH至4.8，加乙醇至40%，加后反应30 min，搅拌1 h，进行离心，离心速度小于8000 r/min，取沉淀干燥，即为粗提取的副产物Alb。

4.3 Ig沉淀的保存

（1）蛋白液的浓缩方法

用0~4℃生理氯化钠溶液溶解沉淀，加量为沉淀质量的10倍，搅拌至完全溶解；取样测pH值，蛋白溶液中加入1 mol/L HCl，调节pH值为3. 60~4. 40。

将聚乙二醇(PEG，即car—bowax4000W )用pH 值7.2~7.4、0.01 mol／L 的PBS配成30％溶液，将装有蛋白液的透析袋浸入，在冰箱内浓缩5~12 h，一

般可浓缩至原体积的1/3～1/20。用过的PEG在蒸发除去水分后可以重复利用。

（2）冷冻真空干燥

4.4 Ig物理性状及生化检定（文献22）

（1）蛋白含量的测定：紫外吸收法（生物制品基础摘录8，文献25）

将PEG 浓缩后的待测蛋白质溶液稀释10倍，使其光密度在0．2-2．0之间，在波长280 nm 和260 nm处以0．0175 mol/L、pH 值6.7的磷酸缓冲溶液作空白对照，分别测得待测样品的光密度值(OD280 和OD260)。应用280 nm 和260 nm 的吸收差法经验公式直接计算出蛋白质浓度。计算公式为

蛋白质浓度=(1．45 OD

280-0.74 OD

260

)x稀释倍数

（2）Ig纯度分析：SDS-PAGE电泳（生物制品基础摘录9~11，文献25）

在厚度为1 mm 的垂直电泳板上进行不连续电泳，样品的加样量为5μL。电泳过程中，浓缩胶部分保持电流15 mA，进入分离胶后，电流为25 mA 。电泳结束后，将胶片用含有33％甲醇和12％三氯乙酸的固定液固定4 h，然后用考马斯亮蓝(CBB)G-250染色液(含有1.05 mmol/L的CBBG-250，1.0 mol/L 硫酸，10 mol/L 的NaOH ，12%的TcA)染色3 h。染色结束后，用蒸馏水对胶片进行洗脱，直至底色基本脱去为止。采用表1所示标准蛋白质：

（3）Ig各组分含量测定：SephadexG-200凝胶柱层析法（文献22）

（4）Ig免疫活性的测定：？

（5）Ig的稳定性检验：

IgG制品置57±0.5℃水浴保温4 h后,无凝胶化和絮状物（文献22）

（6）Ig固体总量测定：用以计算纯度或某一成分的单位含量。干烤恒重法（生物制品基础摘录14）