TB法制备高效感受态细胞
高效制备感受态
在科研实验中，为了获得纯的重组质粒DNA，需要允许外源DNA分子进入的细胞。
经过一些特殊方法（电击法、CaCl2法）等处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的细胞，即感受态细胞。
基本制备步骤1.从37℃培养16-20 h的平板中挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB或SOB培养基的1L烧瓶中。
于37℃剧烈振摇培养3 h。
一般经验，1 OD600约含有大肠杆菌DH5α 109 个/mL。
2.将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培养物冷却至0℃。
3.于4℃用Sorvall GS3特头（或与之相当的转头）以4 100 r/min离心10 min，以回收细胞。
4.倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
5.每50 ml初始培养液用30 ml预冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重悬每份细胞沉淀。
6.于4℃用Sorvall GS3转头（或与之相当的转头）以41 00 r/min离心10 min，以回收细胞。
7.倒出培养液，将管倒置1 min以使最后的痕量培养液流尽。
8.每50 ml初始培养物用2 ml用冰预冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重悬每份细胞沉淀。
9.此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70℃。
洁净是最重要的~无菌都无所谓，在操作台上可正常操作。
离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。
涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复。
轻轻在平板上带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保存过或在温箱中温浴2小时以上的板。
涂完后建议空气晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。
预冷是必要的。
整个过程的低温也并非特别重要，只要注意就行了，我在去残液时经常在室温倒置1min，对感受态效率提高有帮助，第一次多加一点缓冲液，我经常加至20ml，效果不错。
超级感受态细胞制备方法-化转
Preparation of Highly Efficient Chemical Competent cell Reagents:所有的ddH2O都必须是最高级别纯度的水（18.2M）,容器专用，避免一切活性洗涤剂或者有机溶剂。
1:0.5M PIPES(PH6.7)15.1gPIPES溶于80mlddH2O中，5M KOH调至PH=6.7,定容至100ml，Nalgene（0.22um）过滤除菌，-20度分装保存。
2：Transformation Buffer(TB): For 250mlMnCl2.4H2O 2.72g 55mmol/LCaCl2.2H2O 0.55g 15mmol/LKCl 4.66g 250mmol/LPIPES(0.5M PH6.7) 5ml 10mmol/LH2O 补至250mlNalgene（0.22um）过滤除菌，Store at 4℃3：SOB: For 200ml2%Bactotryptone 4g0.5%Yeast Extract 1g10mM NaCl (5M stock,0.4ml)2.5mM KCl (2M stock, 0.25ml)Mix above four in 198ml of ddH2O,Sterilize by autoclave in a 1Lflask. Prepare 2M Magnesium solution(1M MgSO4+1M MgCl2), Sterilize by autoclave.可以直接用2M MgCl2。
Add 2ml of Mg solution into the autoclaved IL flask containing 198ml of BactoTrytone/Yeast Extract/NaCl/KCL solution. Store at 4℃4：LB agar plates without antibiotics.5: E.coli for competent cells(usually I use DH5αor XL-blue),without any plasmid.ProceduresDay1:1:Streak a favorite strain of E.coli on a LB agar plate without antibiotics. Incubate at 37℃for O/N2: Make TB and SOB.Day2:3:Pick up 1-2 colonies and inoculate them to 200ml of SOB in a 1L flask.4:Incubate culture at 200-250rpm/min at 18℃.This culturing temperature is critical. If cultured at room temperature, we see about 5 to 10 fold decrease in competency. Never try to culture at 37℃.We usually use a shaker with a cooling system, or put a normal shaking incubator into a cold room to grow cells.Grow cells until OD600 become between 0.4 and 0.8(0.6 is optimal).It takes 24-48hours depending on the number and size of colonies used.Day3:5:Put the flask on ice for 10 min.6:Spin down at 3000rpm,4℃for 10min.7:Resuspend gently in 80ml of ice-cold TB(or 1/3volumc of culture medium),place on ice 5min.8:Spin down again at 3000rpm,4℃for 10min.9:Resuspend cells in 20ml of TB gently on ice.10: Add 1.5ml of DMSO (final 7%vol/vol) dropwise while gently shaking. 11:Incubate on ice for 10min.12:Aliquot cells in 50-100ul into screw-cap tubes.13:Free them by putting in liquid N2.The use of liquid N2 is critical for high transformation efficiency.14:Keep cells in liquid N2.Alternatively the cells can be kept at higher temperature in deep freezer(-135℃or -80℃)although the transformation efficiency will be droping during the storage.通常保存于-80℃，一定注意不要频繁的造成温差，每次拿取尽量迅速，同时注意分装。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理1. 什么是感受态细胞1.1 定义感受态细胞，听起来像是个高大上的名词，其实就是那些“准备好”接受外界信息和刺激的细胞。
想象一下，像个随时待命的服务员，时刻准备接待客人。
细胞的这种状态，通常是在特定的环境下，通过某些方法处理后形成的。
1.2 重要性为什么要制备感受态细胞呢？这可是生物实验中的关键一步！它们能帮助我们进行基因转化、疫苗研究，甚至是药物开发。
就像一个关键的道具，缺了它，很多实验都没法顺利进行。
2. 如何制备感受态细胞2.1 基本步骤制备感受态细胞的过程其实并不复杂，简单来说就是要让细胞放松心情，准备好接受外来的DNA。
首先，我们需要把细胞放在一个低温环境下，这就像给它们一个凉爽的SPA，让它们变得“懒洋洋”的。
接着，添加一些化学试剂，比如氯化钙，这些化学试剂可以帮助细胞的膜变得更容易接受外来的DNA，哇，真是神奇！2.2 处理时间然后，细胞要在这个特殊的环境中待一段时间，让它们完全“感受”这个过程。
通常，我们会让它们静置一小时左右，这段时间就像让一个小孩在游乐场里玩耍，兴奋而又期待。
当时间到了，嘿！细胞已经准备好迎接挑战了。
3. 实际应用3.1 科研领域在科研领域，感受态细胞的应用真是无处不在。
比如，科学家们可以将新的基因片段导入这些细胞中，看看它们会发生什么样的变化。
就像给一个平凡的角色增加超能力，结果往往出乎意料，有时候能发现新的疾病机制，有时候能找到新的治疗方法，简直就是科研的“黑科技”！3.2 工业应用当然，感受态细胞的应用不仅限于实验室，它们在工业上也大显身手。
比如，利用这些细胞生产蛋白质，甚至是药物，提升生产效率，降低成本，简直是企业的“秘密武器”。
有了它，企业就能在竞争中抢占先机，像个抢眼的明星一样脱颖而出。
总之，感受态细胞的制备虽然听起来复杂，但只要掌握了窍门，便能游刃有余。
它不仅是生物学研究的基础，更是现代科技进步的重要推动力。
就像一首动听的乐曲，细胞的“感受态”是其中不可或缺的音符。
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞制备(三种方法)
感受态细胞的制备是一项非常重要的实验技术，可应用于许多研究领域，如分子生物学、农药毒理学、农业植物保护等。
一般来说，将培养细胞转化为感受态细胞，可以有三种方法：
1、皮下注射引起的感受态细胞制备。
由于它是一种经典的制备方法，大多数细胞都可以使用。
其核心步骤是将小量液体注入传感源头(如病毒、菌株、多糖、细菌等)皮下。
这种技术可以帮助人们制备特定种类的感受态细胞，并且可以控制病毒的感染率。
2、利用细胞克隆引起的感受态细胞制备。
这种方法涉及到使用不同种类的细菌或病毒及其克隆进行感染。
一旦细胞受感染，感受态细胞就会形成。
此外，通过诱变基因表达等方式，也可以制备出不同感受源的感受态细胞。
3、利用小分子引起的感受态细胞制备。
小分子技术中的最新研究主要集中在核酸抑制剂、蛋白质结合蛋白、信号转导调节剂等。
这些小分子可以直接结合到感受细胞的特定分子，从而影响其功能，抑制或促进感受细胞的形成。
以上是三种感受态细胞制备的方法，它们均可用于解析某一特定基因或基因产物在细胞功能中的作用。
此外，这些技术还可用于识别及检测特定感受源，并评价其对细胞株功能的影响程度。
另外，它们还可用于发现新型抗病毒剂，以提高植物抗病能力。
因此，感受态细胞的制备实验在诸多方面都具有重要的意义，值得继续探索。
TransEasy TM 超高效感受态细胞制备试剂 说明书
使用说明书TransEasy TM超高效感受态细胞制备试剂盒产品套装编号：U0201A / U0201B / U0201C产品成分包装规格储存条件Solution A1×1ml-20ºC保存。
1×10ml1×50mlSolution B1×1ml-20ºC保存。
1×10ml1×50mlpUC19(10 pg/μl) 1×50μl-20ºC保存。
产品概述本试剂盒是在制备高效感受态细胞的标准方法上结合了一步法制备感受态细胞的方法，既可以一步制备超高效的感受态细胞，又可把常态细胞（包括新鲜培养的菌液,新鲜的或4ºC放置数月的培养基菌落,甘油菌种保存液等）快速制备成感受态细胞。
产品特点一步超高效感受态细胞制备方法快速感受态细胞制备方法(细胞转化液)1. 转化率高：所制备的感受态细胞转化率可达109cfu/µgpUC19 DNA（转化效率根据大肠杆菌细胞系及转化用DNA不同稍有差异）。
2. 操作简单：只需离心一次即可完成感受态细胞的制备。
3. 产率高：制备的感受态细胞数量比普通方法多一倍。
4. 稳定性好：所制细胞在-80ºC保存一年以上，其转化率几乎不会降低。
1. 转化率适中：使用10ng质粒转化一般能得到上万个转化子，效率在105到107cfu/μg质粒之间。
2. 操作简单快捷：不需专门制备感受态细胞，可直接使用常态细胞进行质粒转化，随用随配，整个操作过程在一个1.5ml离心管中即可完成。
3. 设备要求低：无需冷冻离心机和恒温摇床，菌种无需过夜培养，最短只需1小时培养时间。
用户需准备的试剂（相关配置见附录）S.O.B培养基（含有20mM Mg2+）液氮或者乙醇干冰S.O.C培养基LB平板（含有抗生素）用户需准备的设备温控摇床离心机（大量制备需冷冻离心机）超净工作台水浴锅分光光度计（可见光）感受态细胞制备操作流程方法一：一步超高效感受态制备方法1.接种从-80ºC冰箱中取出冻存的甘油菌，直接挑取部分菌液（无需解冻）接种于含100ml S.O.B培养基（含相应抗生素）的500ml三角瓶中，也可挑取已经划线纯化的新鲜单菌落接种于S.O.B培养基中，或者将已隔夜摇好的母液按照1:100比例接种于S.O.B培养基中，以上三种接种方法可以根据需要自主选择（直接从冻存的细菌原种接种培养的细菌，所得到的转化效率高于使用连续传代、4ºC或室温贮存的培养物）。
感受态细胞的制备的实验步骤
感受态细胞的制备的实验步骤CaCl2感受态细胞的制备的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜（约16小时）；2．取1ml过夜培养物转接于100ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养约2.5-3小时（250-300rpm）；3．将0.1M CaCl2溶液置于冰上预冷；以下步骤需在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮，在冰放置20分钟；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟；8．弃去上清，加入100μl预冷0.1M CaCl2溶液，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存备用（－70℃）。
·电转化法制备大肠杆菌感受态细胞的实验步骤1．前夜接种受体菌（DH5α或DH10B），挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培养过夜；2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养至OD600=0.6（约2.5-3小时）；3．将菌液迅速置于冰上。
以下步骤务必在超净工作台和冰上操作4．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管中，在冰上冷却10分钟；5．4℃下3000g冷冻离心5分钟；6．弃去上清，加入1500μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；7．4℃下3000g冷冻离心5分钟8．弃去上清，加入750μl冰冷的10%甘油，用移液枪轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；9．4℃下3000g冷冻离心5分钟10．加入20μl冰冷10%的甘油，用移液器轻轻上下吸动打匀，使细胞重新悬浮；11．立即使用或迅速置于-70℃超低温保存。
感受态细胞的制备步骤和原理
感受态细胞的制备步骤和原理实验目的为了获得大量的质粒作为克隆载体，我们需要将购买来的质粒通过转化的方法导入细菌的细胞内。
制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。
本次实验的目的就是增加质粒的数量。
同时，我们能掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的基本原理和实验技术方法。
实验原理及过程实验步骤1挑取一个JM109单菌落于3ml LB（无抗生素）培养基中，37℃，180rpm 培养过夜。
[ 让菌复苏，进入对数期的早中期。
此时更容易制得感受态细胞。
]2取0.4mL过夜培养物加入到40mL LB（无抗生素）培养基中，37℃250rpm大约2.5 小时。
[ 减少达到所需亮的均所需繁殖的世代数，以减少菌的变异。
]3 取培养物置于40mL的灭菌离心管中，冰浴10min，4000rpm 4℃离心10min，弃上清。
（将所有上清倒光，可以将离心管倒过来）[ 使细菌的生长停止，代谢减慢。
因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢效率，则有大量细菌死亡。
]4 菌体重悬于10mL 100mmol/L 冰冷CaCl2 中，轻吹，4℃ 30min ，4000rpm 离心5min 弃上清。
[ 细菌处于0 度，CaCl2 低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物黏附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA），经短时间420C 热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。
（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]5 菌体重悬于1mL 100mmol/L 冰冷的CaCl2 中，轻吹，用于转化。
[ 除去所有的LB 以及细胞破损后释放出来的细胞内含物。
防止细胞分裂，以致大量细胞死亡。
（一定要轻吹，这时细胞壁打开，十分脆弱）]6 取感受态细胞100uL，加入2uLpET-21a 质粒，冰浴30 min 受体菌：感受态细胞100uL ，加入 2 uL 无菌双蒸水阴性对照：0.1mol/LCaCl2 溶液100uL，加入 2 uL 阴性对照[ 第一个阴性对照是为了验证LB中的抗生素有活性；第二个阴性对照是为了验证CaCl2 溶液和pET-21a 质粒未被污染。
感受态细胞常用的制备方法
感受态细胞常用的制备方法常态的细胞不能摄入外部溶液中的DNA，，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。
受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化，是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。
进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
?α-互补现象：因为许多载体都带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补（α-互补）。
当这种载体转入可编码?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-?-D 硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。
所以称这种现象为α-互补现象。
由互补产生的α－半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA时，会造成LacZ(α)基因的失活，破坏α-互补作用，就不能产生具有活性的酶。
所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。
杆菌电转化感受态细胞制备经验过程实验步骤：1、将适合菌株（如XL1-Blue, DH5α）置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养。
2、高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）。
准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备重悬浮细胞用。
感受态细胞制备
感受态细胞制备
感受态细胞制备是一种技术，用于制备仅有一种特定细胞类型的
细胞株。
常用于生物医学研究中，其中包括肿瘤学、免疫学研究等等。
细胞的感受态是指把转录因子的活性形式改变，使其响应环境刺激，
以调节其生化活性或特性。
感受态细胞制备的基本步骤是，首先收集需要制备的细胞株。
此外，设计环境因子，使细胞可以被富集于细胞培养液中，比如添加一
定量的表观遗传因子。
然后，将细胞培养液中的收集细胞用多种组合
方法，如离心法、细胞膜滤过法提纯细胞，最终得到所需的细胞株。
最后，移植所筛选出来的细胞株到环境中，使其进入感受态。
模
拟能够调节受体活性的外界刺激，对其进行诱导，使其进化到更加完
美的感受态细胞。
当准备好后，可以用于临床诊断、研究以及各种免
疫应答的研究等。
无论是医学上的准备，还是科学研究的准备，感受态细胞的制备
都是非常重要的。
人们可以通过改变细胞生长环境，调节外源基因活性，来改变细胞表达，以及形态和功能等，从而有效地控制细胞的生
长和发育。
感受态细胞制备
感受态实验SOB溶液的配制(1000 ml用量):蛋白胨20 g酵母抽提物 5 gNaCl 0.585 gKCl 0.186 gH2O 加至1000 ml用之前向培养基中加入2M的Mg2+(1M MgSO4.7H2O + 1 M MgCl2·6H2O)，可在高压后直接加入或过滤除菌，1000 ml培养基中加入2 M的Mg2+ 10 ml.灭菌：SOB高压；Mg2+高压；滤膜高压。
无氨卞，干净LB固体培养基用于菌株划线。
LB液体培养基，用于预培养。
1.5ml离心管高压用于装感受态，约160个。
50ml 离心管高压,约4个。
TB滤膜过滤。
步骤:(1) 保存的JM109永久菌平板划线，37℃过夜。
(实验中用的是DH5α，培养约20h。
)(2)预培养：挑取单菌落，接种到5ml无氨卞LB试管液体培养基。
约16h, 使单菌落快速大量繁殖。
(3)取1ml接种于盛有100 ml SOB的250 ml小三角瓶中，37℃振动培养,约4h，使OD=0.4(600nm, ddH2O对照)，冰上放置10 min。
(4) 2500 rpm，4℃离心15 min(5) 用1/3体积冰冷TB溶液悬浮沉淀10 min。
(6) 2500，4℃离心15 min(7) 重复(5)，(6)步骤一次。
(8) 1/12.5体积冰冷TB溶液悬浮(50ml SOB加4mlTB。
)加DMSO至终浓度7%，约300μl ，轻轻吹打，冰上放置10 min。
(使DMSO进入细菌)。
(9) 用1.5 ml离心管分装成100 µl/管，液氮速冻，-80℃保存。
制备感受态细胞的原理
制备感受态细胞的原理
感受态细胞的制备原理是通过刺激细胞或组织，使其产生特定的感受态反应。
下面将介绍两种常见的制备感受态细胞的方法：
1. 免疫刺激法：免疫刺激是一种常见的制备感受态细胞的方法。
它通过注射外源性抗原或感兴趣的抗原到实验动物体内，刺激其免疫系统产生针对该抗原的免疫应答。
随后，从动物体内获得淋巴细胞或单个免疫细胞，并进行分离和培养。
在适当的刺激条件下，这些细胞会分化为感受态细胞，表达特定的受体和效应分子。
2. 细胞诱导法：细胞诱导法是一种将一种细胞类型转化为另一种感受态细胞的方法。
通过适当的生理或外部信号，诱导细胞发生转变，从而获得感受态细胞。
例如，通过改变细胞培养基的成分和配比，或添加特定的生长因子和信号分子，可以使一些细胞从一种特定状态转变为特定的感受态细胞。
而在实现这些方法时，需要注意实验条件的细节，确保刺激物的浓度和持续时间、培养基的组分和条件等都符合特定的要求。
此外，在实验过程中需要使用适当的实验技术和方法对细胞进行监测和鉴定，确保制备得到的是目标感受态细胞。
感受态细胞的制备及转化
感受态细胞的制备及转化实验五感受态细胞的制备及转化一、目的掌握感受态细胞制备和转化的基本方法。
二、原理所谓感受态细胞是通过一定的试剂处理细胞，使细胞处于易于接受外源DNA的生理状态。
通常用0.1mol/L CaCl2处理细胞，就可得到感受态细胞。
细胞原本所处的生理状态制备对感受态细胞的制备很关键。
将重组DNA导入细胞的方法有多种，入热休克法，电击法等。
通过这些方法可以使细胞膜出现暂时的松弛，导致外源DNA进入细胞。
三、试剂与仪器（一）试剂1．0.1mol/L CaCl2称取无水氯化钙56g，加重蒸水至500ml，于高压锅灭菌20分钟。
2．LB液体培养基（见实验一）3．LB固体培养基（见实验一）4．氨苄青霉素（100mg/ml）（二）仪器1．冷冻离心机2．平衡天平3．无菌操作台4．微量移液器5．高压灭菌锅四、操作步骤（一）感受态细胞的制备(0.1mol/L CaCl2方法)1．从深冻菌株中划单克隆（LB、建议用不加抗生素和加抗生素的两种培养基，检查有无污染）。
2．挑单克隆于5ml LB中(不加抗生素)，37℃摇菌培养12~16小时(300rpm)(可过夜培养)。
3．取1ml菌液（接种）到50 ml LB中(37℃，预热), 扩大培养。
应准备两个培养物。
4．约2小时开始，用一个培养测OD600值（此培养只做测量OD600值用，OD600值指示细胞密度，这里用于判断培养物是否处于对数生长期）。
OD600值在0.4 - 0.5时( 注意此时培养物处于对数生长期，细胞数应在20分钟内加倍。
所以建议OD600值应控制在0.4为佳)，立即把另一个培养物放置在冰浴里10分钟，让细胞停止分裂。
5．把培养物分装到两个50毫升聚丙烯管(灭菌并预冷)，4℃离心4000rpm, 10分钟。
6．弃上清, 加入10ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀，4℃离心4000rpm，10 分钟。
7．弃上清, 加2ml 0.1M CaCl2 (灭菌并预冷) 悬浮沉淀。
感受态细胞制备流程
感受态细胞制备流程感受态细胞制备流程，这是一个非常复杂和精确的过程，涉及到许多实验室技术和设备。
感受态细胞是指在特定的刺激下，可以触发细胞产生反应的细胞状态。
感受态细胞的制备可以用于研究许多生物学过程，如细胞信号传导、疾病机制等。
下面是一个常见的感受态细胞制备的流程：1.细胞培养首先，需要准备细胞培养基和细胞培养器皿。
细胞培养基是提供营养物质和条件来维持细胞生长和增殖的液体。
培养器皿选择取决于所使用的细胞类型和实验的要求。
然后，将细胞接种到培养器皿中，并在恒定的温度和湿度下进行培养。
2.细胞处理一旦细胞生长到足够数量，可以开始进行细胞处理。
这可以包括刺激细胞，例如添加化学物质、压力或温度变化。
刺激过程需要精确控制，以确保得到一致的结果。
3.细胞取样在细胞处理后，需要进行细胞取样。
这可以通过用吸管或毛细管吸取细胞悬浮液来实现。
取样过程需要快速和准确，以确保细胞状态的准确性。
4.细胞固定取样后，细胞需要固定以保持其形态和结构。
常用的细胞固定方法包括用甲醛或乙醛等化合物进行固定。
细胞固定可以帮助保留细胞结构和细胞内分子，以便后续的染色或分析。
5.染色和标记对固定的细胞进行染色或标记是感受态细胞制备的关键步骤。
染色和标记可以使用各种荧光染料或抗体来实现。
这可以通过将染料或抗体直接添加到细胞上，或使用转染技术将其引入细胞内。
6.显微镜观察完成染色和标记后，可以使用显微镜来观察细胞。
显微镜观察可以提供关于细胞形态和结构的信息，并且可以检测到染色或标记物的荧光。
这可以帮助研究人员获得有关感受态细胞的更多信息。
7.数据分析和解读最后，需要对得到的数据进行分析和解读。
这可能涉及到图像处理、统计学方法和生物学解释等。
数据分析和解读的目的是从实验结果中提取有意义的信息，并为后续的研究和应用做出贡献。
感受态细胞制备的流程是一个需要仔细和精确操作的过程。
任何一个步骤的错误或偏差都可能导致不准确的结果。
因此，研究人员需要具备高度的实验技能和实验室安全意识。
超级感受态细胞的制备方法
超级感受态细胞的制备方法什么是感受态细胞野生型E.coli并不容易转化，这是由于细菌产生一种酶能迅速降解进入的外源DNA。
经过多年的努力，科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA的效率。
那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。
这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。
这种方法已经成为基因工程的常规技术，它对于我们利用体外DNA重组技术来了解真核和原核生物的基因功能特别重要。
细菌的转化有两种类型：一种是自然转化（natural transformation），在自然转化中细菌可以自由地吸收DNA，通过它来进行遗传转化；另一种是工程转化（engineered transformation），在这种转化中，细菌发生改变使得它们能摄入并转化外源DNA。
枯草杆菌中的转化属于自然转化，E.coli转化就属于工程转化。
DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。
E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。
可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株Transformation "Ultra-Competent" E. coli (Inoue Method)Inoue法制备大肠杆菌超级感受态细胞Inoue, H., H. Nojima, and H. Okayama. 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene96:23-28. Citation AbstractProcedure步骤1. Inoculate from an overnight grown in LB.从培养过夜的LB 平板上挑取单菌落2. Grow in 250 ml "SOB" at 18C until OD600 = 0.6. (0.3) 接种于250mL SOB，18度培养至OD＝0.62. On ice for 10 minutes. 菌液置冰上10分钟3. Spin at 2500 x g (5000 rpm in a Sorvall GSA or 3000 rpmin a Beckman J-6B centrifuge) for 10 min. at 4C. 4度2500g离心10分钟4. Resuspend cells gently in 80 ml of ice cold "TB".小心用80mL预冷TB重悬细胞5. On ice for 10 minutes. (30min) 菌液置冰上10分钟6. Spin at 2500 x g (5000 rpm in a Sorvall GSA, 5500 rpm ina Sorvall SS-34, or 3000 rpm in a Beckman J-6B centrifuge) for 10 min. at 4C. 4度2500g离心10分钟7. Resuspend cells gently in 20 ml of ice cold "TB".小心用20mL预冷TB重悬细胞8. Add DMSO to a final concentration of 7%. 加入DMSO至终浓度7％9. Place on ice for 10 minutes. 置冰上10分钟10. Aliquot into 1-2 ml and freeze in liquid nitrogen.分装，液氮速冻11. Store in liquid nitrogen. 冻存SOB Medium and TB (Transformation Buffer)SOB2% (w/v) bacto tryptoneTB0.5% (w/v) yeast extract10 mM Pipes10 mM NaCl55 mM MnCl22.5 mM KCl15 mM CaCl210 mM MgCl2250 mM KCl10 mM MgSO4在加入MnCl2之前先用5N KOH调pH值到6.7，adjust pH to 6.7 with 5N KOH prior toadding the MnCl2thanks to Markus Schneemann for the tip!pH 6.7 - 7.0JM108感受态细胞的制备刚开始做实验时，是向TAKARA购买的，一支30元，定了10支。
制备感受态细胞的方法
制备感受态细胞的方法嘿，朋友们！今天咱就来聊聊制备感受态细胞的那些事儿。
感受态细胞啊，就像是细胞世界里的小乖乖，等着我们去把它们变得特别，好让它们能接受外来的基因。
那怎么制备呢？别急，听我慢慢道来。
首先得有好的细胞，就像做饭得有好食材一样。
咱得选那种生长状态良好的细胞，这可是基础哦。
然后呢，就像给细胞洗个舒服的澡，把它们好好地培养起来。
接下来，就是关键的一步啦！得让细胞们感受到点“压力”，这可不是折磨它们哦，而是通过一些特殊的处理，让它们打开接纳的大门。
这就好像一个人在经历了一些困难后，会更懂得珍惜和接纳新的东西。
比如说，可以用低温来刺激它们。
想象一下，大冬天的，细胞们也会冷得瑟瑟发抖，这时候它们就会变得更容易接受外来的基因啦。
还有啊，化学处理也是个常用的办法。
就像是给细胞喂了点特别的“调料”，让它们变得不一样。
在这个过程中，可千万得细心，就跟照顾小婴儿似的。
温度不能太高也不能太低，处理的时间也得恰到好处。
要是不小心弄错了，那可就前功尽弃啦，这多让人郁闷呐！而且，制备感受态细胞可不能马马虎虎，得像艺术家创作一样精心。
每一个步骤都要做到位，这样才能得到高质量的感受态细胞。
等制备好了感受态细胞，就好像是打造出了一把神奇的钥匙，可以打开基因的大门啦。
然后就可以把我们想要的基因送进去，让细胞变得更有特色。
总之，制备感受态细胞可不是一件简单的事儿，但只要我们用心去做，就一定能成功。
这就像是爬山，虽然过程有点累，但当我们爬到山顶，看到那美丽的风景时，一切都值啦！所以，大家加油吧，让我们一起在这个神奇的细胞世界里畅游！。
tb溶液制备感受态
tb溶液制备感受态
1. 挑取适当菌株的 E.coli 单菌落接种于 2mlSOB培养液中，37℃摇床过夜。
2. 取 0.5-1ml 过夜培养的菌液转种到 50ml SOB 中，18℃剧烈震荡，直到 A600达到 0.6。
3. 将培养物转移到 50ml离心管中，4℃ 4,000rpm/min离心
10min。
同时在冰浴上配置 TB 溶液。
4. 弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。
5. 取 1ml 刚配的 TB 溶液打散菌体沉淀，再加入 15mlTB（1/3 体积的起始培养液），冰浴10-15min，4℃ 4,000rpm/min离心
10min。
6. 弃上清，沉淀重悬于 4mlTB（1/12.5 体积的起始培养液），冰浴10min。
7. 加入 280μl DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴 10min。
8. 将菌液分装于 EP 管中，- 80℃或液氮冻存。
9. 取两管感受态细胞分别加入 1μl 无菌 ddH2O（阴性对照）和1μl 纯质粒（阳性对照）进行转化（见后），以检测感受态的质量阴。
性对照平板上应该无菌落生长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。
SOB 的配制：
100×Mg++溶液：
TB 溶液的配制：
0.1M K -Pipes(pH=6.7)的配制：
称取 3.02g Pipes粉末溶于 80mldd H2O 中，此时粉末不能完
全溶解，用 10N KOH 或 KOH 固体调节 PH 值，只有当 PH 接近 6.7 时粉末才能完全溶解，此时当小心少量地加入 KOH 直至达到所需PH 。
感受态细胞的制备
感受态细胞的制备感受态细胞是研究多种生物学和行为学反应的必不可少的细胞模型，由于生物反应的复杂性和敏感性，感受态细胞的制备是令人头疼的问题。
传统方法中，制备感受态细胞的步骤繁琐复杂，步骤数量多，每个步骤的重复程度高，操作过程耗时，并且受到仪器设备质量的限制，如果仪器设备不足，必须重新安装或更换设备，对软件编程也有一定要求，软件编写错误会影响实验结果，容易导致实验失败，给研究工作带来不必要的损失和延期。
随着现代生物技术的发展，高效的分子转录酶技术已经成为一种有效的制备感受态细胞的方法，它可以以更短的时间内产生有效的感受态细胞，大大缩短制备和实验步骤，消除了传统方法中耗费宝贵时间的步骤，减少了多次重复操作带来的不必要的误差，并且克服了仪器设备质量受限，软件编程也不再是问题，大大提高了实验效率，减少了实验损失和时间损耗。
分子转录酶制备感受态细胞的步骤不复杂，大致可以分为以下几个步骤：1.在细胞培养基中添加分子转录酶，离心收集细胞并置于转染培养箱中；2.将基因构建的DNA粘膜转染到感受态细胞上；3.在细胞中表达感受态基因，加入选择水平，细胞进行增殖；4.从细胞培养基中收集感受态细胞，离心洗涤，收集感受态细胞；5.用荧光显微镜观察感受态细胞的荧光变化，以确定制备过程是否成功。
分子转录酶技术可以有效降低制备感受态细胞的成本，减少实验流程，同时，实验过程可以得到更高的标准化要求，确保实验数据的可比性和可信性，有效提高实验的准确性和可重复性，进一步发挥分子转录酶技术在制备感受态细胞方面的优势，从而获得更有效的研究结果。
不过，由于分子转录酶技术在感受态细胞制备中存在着一定的不足，如培养环境的选择、基因识别性和转染效率等，都会影响分子转染的有效性和灵敏度，因此，应在设计实验中加以考虑，并进行相应的改进，以获得更好的结果。
总之，分子转录酶技术为制备感受态细胞提供了一种快速、高效、可行的方法，大大提高了实验成功率，减少了实验损失率和时间损耗，是研究生物学和行为学反应的一个有效且有价值的细胞模型。
高效转化及感受态细胞的制备
关于感受态细胞及转化克隆/建库/表达专用超级高效感受态细胞国外的同学说一般他们克隆都是直接购买感受态细胞转化，实验效率很高的。
我总是以为如果是一般的克隆实验，自己做感受态好像够用了－－如果是建库，购买现成的感受态细胞就是非常必要的首选，因为转化效率确实比实际手工制备的高2－3个数量级以上，特别是建库，能实实在在地提高实验的效率。
实际上，除了建库以外，Stratagene为更好的表达蛋白、以及转化效率较低的巨无霸质粒，而特别优化了一些感受态细胞，做表达的人其实可以参考一下，有点用处的。
生物通在这里借用Merck公司提供的资料供大家参考。
Stratagene的XL10-Gold®几乎算得上是高效转化的代名词了，研究者一旦要克隆大质粒、连接DNA和建库，克隆甲基化DNA，进行蓝白斑筛选等，首选的就是XL10-Gold®和其衍生菌。
XL10-Gold®用途包括：--克隆大DNA：包括表达质粒，基因组DNA克隆--构建质粒文库：减少DNA大小偏倚性，使全长cDNA克隆、双杂交质粒等各种大小的质粒转化效率更接近，提高文库代表性（比DH10B高25倍）。
Hte 基因型Hte（高效转化）基因型是Stratagene开发的特异性提高大质粒、连接DNA的宿主菌基因型，并使细胞生长加快（当天获得菌落），已经成功应用于25kb超螺旋DNA和8kb连接DNA的克隆。
XL10-Gold®，BL21-Gold，BL21-CodonPlus®，SoloPack® Gold 和96Pack® Gold等系列细胞都带有这个新的性状。
超级感受态细胞Stratagene提供多种>5 x109转化子/μg 超螺旋DNA转化效率的化学法超级感受态细胞正是克隆获得大质粒、连接DNA克隆和建库时最值得推荐的。
电转化感受态细胞Stratagene的电转化感受态细胞特别耐受电击处理，方便好用，在DNA材料极珍贵、量少时，或构建有代表性文库时，建议采用电转化感受态细胞。
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2.11 大肠杆菌感受态细胞的制备
1．划线接种保存于液氮中的菌种于LB培养平板，37℃培养以活化菌种；
2．接种经活化的大肠杆菌单菌落于SOC液体培养基中，18℃，200~250rpm培养；
3．当OD600 = 0.5~0.8时，取出培养物并以冰预冷的50ml离心管收集，于4℃，2500g离心10min，收集菌体；
4．以冰预冷的TB buffer重悬菌体，4℃，2500rpm离心10min，去上清；
5．重复步骤4一次；
6．以8ml 预冷的TB buffer重悬菌体，并逐滴加入DMSO至终浓度为7%；
7．冰浴10min后，分装保存于液氮中。
附：
1、SOC培养基：0.5% Yeast extract，2% Tryptone，10mmol/L NaCl，2.5mmol/L KCl，
10mmol/L MgCl2，20mmol/L MgSO4，20mmol/L Glucose，
121℃灭菌20分钟
2、TB buffer：10mmol/l Pipes, 55mmol/l MnCl2, 15mmol/l CaCl2, 250mmol/l KCl , pH6.7 （膜过滤除菌）
3、LB培养基（液体）：1% Tryptone，0.5% Yeast extract，1% NaCl，pH7.0，
121℃灭菌20分钟
4、LB(固)：1% Tryptone，0.5% Yeast extract，1% NaCl，pH7.0，1.5% Agar，
121℃灭菌20分钟。