SDS-PAGE电泳常见问题

SDS-PAGE电泳问题总结

蛋白质条带为什么走到下面逐渐变宽发散？

回答:多数情况是因为小分子在胶里的运动不规律，这种情况常发生在高浓度胶或凝固不一致的胶里，你可以加大阴极的缓冲液浓度，可能会有点改善

胶凝的快慢不在于TEMED多少，在于APS的量，APS提供自由基，TEMED帮助自由基作用，

是催化剂，对凝固速度影响不是太大，可以试试加大APS的量

丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的分辨范围

15 ％ 15～45 kDa

12.5％ 15～60 kDa

10 ％ 18～75 kDa

7.5％ 30～120kDa

5 ％ 60～212kDa

来源于《蛋白质技术手册》汪家政

每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质，而是指在这个区

间内，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家

尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。

下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电，用普通TRIS缓冲液做阳极缓冲液，一样跑得好，阴极就不一样了，需要提供离子强度和SDS环境，而在电泳过程中，阴极缓冲液的一些离子损失，而且与样品接触，不适合再次使用
至于有些时候跑太大浓度的胶，因

为药品，BUFFER配制过程的一些问题，导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方，胶跑得难看情况比较多，一般来说，15%的胶已经能够跑出大约15KDa左右的蛋白，对于普通

SDS-PAGE已经几乎到了极限，还跑不出来的MARK带，就不必去追究商品的问题了

SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大，随着温度的升高，凝结速度越来越快，温度降低则反之。所以，夏天时胶凝结的比较快，而冬天脚的凝结速度则变慢，甚至不能凝结，解决此类问题较可行的方法是：冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量，可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。

做SDS-PAGE的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽，方便后面的比较，特别是WB。做法就是拿1X的上样缓冲补全要加的样做到体积一致，否则跑出来会有的宽有的窄，特别是上样体积相差较大的

加入染色液后，先放入微波炉里加热5-10秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久，

否则冰醋酸就挥发了）。然后放水平摇床上摇20分钟，最多半小时就染好了。脱色也很

简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不

如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不

着含甲醇和冰醋酸的脱色液）。方便快捷！放心，反复煮胶不会把胶煮坏的。

在做蛋白表达的时候，包涵体的出现常常令大家头疼不已，现在给大家推荐盐离子染SDS-PAGE的方法，这种方法简单快速还干净，适合于切胶免疫的同学，具体操作就是把配好的0.5M的氯化钾放在冰箱预冷，然后加在胶上慢慢晃动，大约5分钟就可以看见你

的蛋白条带，切胶回收后直接乳化免疫，不会有什么影响。如果无法识别，还可以再用

实验室传统的方法染色！

拍胶时的“黑十字”聚焦法！

很多人用相机的微距聚焦都无法使识别框变绿，

其实你只需要在胶所在的平面划一个黑十字就可以很好的聚焦，

尤其是western blot的图，直接在膜的边上划就可以聚焦

SDSPAGE的话可以找个颜色深东西放在胶的边上就可以了，把镜头对准它

SDS-PAGE [Laemmli法]

这种方法帖出来，大家是不是感觉非常的陌生呢？其实这种发方法很普遍，现在大

部分的实验室都是用Laemmli法跑电泳的。

如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于Laemmli于1970年发表在nature上的一篇文

章中的方法,这篇文章很特别,不仅被引用的次数较多,而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳

方法上的提出和改进问题,而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳

分析方法而已,所以阐述如何操作的文字只有那么一小段(但相当经典),这是SDS-PAGE(不

连续系统)的首次成功应用。

现在我们在实验室进行的SDS-PAGE试剂的配方仍然是沿用了它的数据,许多论文在描

述其SDS-PAGE时引用Laemmli方法,目前常用的具有浓缩胶和分离胶的不连续SDS-PAGE 的基

础的确来自Laemmli方法,但也略有差别例如一些缓冲液的具体组成。

你也许会恍然大悟：原来我们用的就是Laemmli！

借鉴Tricine-SDS-PAGE中添加甘油或者尿素来提高分辨率的成功经验，在普通的SDS-PAGE 中加入约13%的甘油，同样可以提高分辨率，有效防止小分子量蛋白的弥散。只要把原来配方中的水换成60%的甘油，就可以了。

在分离胶中加尿素和甘油都可以，加上尿素和甘油改变胶的孔径！特别是对分离糖蛋白

的时候很有用处！一方面可以把条带压窄，减少拖尾现象的产生,另一方面对分离小分子

量的蛋白有好处!一般加的量在0.5－3g尿素/12ml分离胶！自己可以跑来实验一下你跑9KD 分子量的蛋白，建议用tricine-sds-page电泳来跑！也可以在分离胶中加尿素！自我经

验来看，加尿素会好于甘油！

Q：SDS－PAGE电泳的基本原理？

A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在