琼脂糖凝胶电泳常见问题分析
琼脂糖凝胶电泳常见问题解答
琼脂糖凝胶电泳常见问题解答核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。
琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。
琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。
但操作过程中仍有不少要注意的问题。
1 凝胶制作1．1 凝胶浓度配制凝胶的浓度据实验需要而变，一般在0．8％～2．0％之间，如果一次配制凝胶100 ml，没用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定，补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。
粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值。
以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。
核酸染色剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化的琼脂糖中，终浓度为0．5 t*g ／ml；也可在电泳结束后染色。
1、2 梳板的选用一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样孑L容积较大，用于DNA 片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样孑L容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。
梳板的选择主要是看上样量的多少而定，一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。
另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孑L底层，导致点样后样品渗漏。
当然，点样孑L的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃冰箱中冷却15 min 左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孑L。
琼脂糖凝胶电泳-完整整理
基因组分析
分子诊断
用于分离和鉴定基因组DNA片段，如限制 性片段长度多态性分析、基因突变检测等 。
用于检测和鉴定基因突变、病原微生物DNA 等，如聚合酶链式反应（PCR）产物电泳、 单链构象多态性分析等。
基因克隆
测序
用于分离和纯化目的基模板，如末端测 序、全基因组测序等。
达差异。
04 琼脂糖凝胶电泳实验问题 与解决
常见问题
条带弥散
由于点样量过多或电压过高，导致条带弥散。
条带过宽
由于凝胶浓度不合适或样品浓度过高，导致 条带过宽。
条带拖尾
样品中蛋白质降解或核酸酶污染，导致条带 拖尾。
条带不亮
由于染料浓度过低或曝光时间过短，导致条 带不亮。
问题分析
条带弥散
可能是由于点样量过多或电压过高， 导致DNA在凝胶中扩散。
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目录
CONTENTS
• 琼脂糖凝胶电泳介绍 • 琼脂糖凝胶电泳实验操作 • 琼脂糖凝胶电泳结果分析 • 琼脂糖凝胶电泳实验问题与解决 •凝胶电泳的定义
01
琼脂糖凝胶电泳是指在琼脂糖凝 胶中进行的电泳技术，主要用于 分离、鉴定和纯化DNA片段。
浓度比较
通过条带亮度，比较不同 样品中目标DNA片段的浓 度。
纯度评估
根据条带的亮度与背景噪 音的比例，评估DNA片段 的纯度。
结果应用
基因克隆
01
通过琼脂糖凝胶电泳检测目的基因是否被正确克隆到载体中。
突变分析
02
利用电泳结果判断是否存在基因突变或点突变。
基因表达分析
03
通过比较不同组织或细胞系中目的基因的表达水平，分析其表
01
条带分析
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因
琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和检测DNA分子的方法，但有时候会出现电泳条带不清晰的情况。
这种情况可能由以下几个原因引起。
琼脂糖凝胶的制备和使用过程中可能存在问题。
如果琼脂糖凝胶的浓度不够或者制备过程中出现了气泡，就会导致电泳条带不清晰。
此外，如果琼脂糖凝胶的pH值不正确，也会影响电泳结果。
DNA样品的质量可能不够好。
如果DNA样品的浓度过低或者存在杂质，就会导致电泳条带不清晰。
此外，如果DNA样品没有经过充分的纯化和处理，也会影响电泳结果。
第三，电泳条件可能不够合适。
如果电泳时间过短或者电压过高，就会导致电泳条带不清晰。
此外，如果电泳缓冲液的浓度或pH值不正确，也会影响电泳结果。
操作者的技术水平也会影响电泳结果。
如果操作者没有经过充分的培训和实践，就可能出现操作不当的情况，比如样品加载不均匀、电泳仪设置不正确等，都会导致电泳条带不清晰。
为了避免电泳条带不清晰的情况，我们可以采取以下措施。
首先，制备琼脂糖凝胶时要注意浓度、pH值和气泡等问题。
其次，对DNA样品进行充分的纯化和处理，确保样品质量。
第三，调整电泳条件，包括时间、电压和缓冲液浓度和pH值等。
最后，操作者要
经过充分的培训和实践，确保操作技术水平。
电泳条带不清晰可能由多种原因引起，我们需要仔细分析和排除这些原因，才能得到准确的电泳结果。
琼脂糖凝胶电泳注意事项
琼脂糖凝胶电泳常见错误及注意事项琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分子生物学实验技术。
在实验过程中，为避免常见错误和提高实验效果，需要注意以下几点：1. 样品制备：在样品制备过程中，需要严格控制样品的来源、处理和质量。
避免污染和杂质的污染，以免影响实验结果。
2. 凝胶制备：在凝胶制备过程中，需要严格按照实验方案的要求制备凝胶。
应避免在制备过程中产生气泡和缺陷，保证凝胶质量的均一性和完整性。
3. 负载样品：样品的负载量也是影响实验结果的一个重要因素。
负载量过多或者过少，都会影响实验结果的准确性。
因此，需要根据实验要求和样品特点调整合适的负载量。
4. 配置电解液：电解液是凝胶电泳实验中的重要组成部分。
配置电解液应按照实验方案的要求进行，不能进行随意变更。
5. 进行电泳实验：在进行电泳实验时需要注意以下几点：（1）电泳时间：电泳时间应根据实验要求和实验人员的经验来调整，以保证样品可以在凝胶中分离出来。
（2）使用电源：电源是电泳实验中的重要设备，需要使用与实验要求相符的电源，避免因电源不适应或使用不当引起实验故障。
（3）电极夹：电极夹应牢固可靠，避免在实验过程中出现松动或断电等情况。
6. 结果解读：琼脂糖凝胶电泳实验结果的解读需要根据实验要求和实验人员的经验进行。
在进行实验结果的解读时需要注意以下几点：（1）确定分离带：分离带越清晰越好，可以通过显微镜来观察分离带是否正常。
（2）确定目标DNA：确定目标DNA时需要考虑实验目的和分离带的特点来确定是否符合要求。
（3）保留样品：需要在实验结果出来后保留样品，以备后续实验需要。
总之，在进行琼脂糖凝胶电泳实验时需要注意以上几点，以达到实验目的并减少实验错误的发生。
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琼脂糖凝胶电泳常见问题分析问题可能原因解决方法DNA Marker 降解核酸酶污染每次吸取时更换灭菌枪头，勿将电泳缓冲液带入管中；用后密闭4°C 保存保存不当4°C 或 -20 °C 保存，避免多次反复冻融；不可加热DNA Marker 无法琼脂糖质量差使用质量可靠的琼脂糖制胶正确分离电泳缓冲液多次使用后失效更换缓冲液条带黯淡核酸浓度过低增加上样量核酸降解使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品DNA 条带被示踪染料掩盖提高上样量；避免使用与目的片段迁移率相同的示踪染料条带模糊或弥散电泳缓冲液多次使用后失效更换缓冲液核酸部分降解使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品核酸样品纯度差，含有DNA 结合蛋酚 /仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质白或高浓度的盐份电压过低，电泳时间过长根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行电泳染色时间过长或拍照前放置过久，电泳结束后及时观察、拍照DNA 条带弥散条带缺失DNA 条带分子量过大使用脉冲凝胶电泳分子量接近的 DNA 条带没有分开选择适当的凝胶浓度进行电泳电泳缓冲液使用不当SD 和 TBE 缓冲液适于分析较小分子量的DNA 片段，大片段分子不能完全分离；TAE缓冲液不适于分离很小的DNA 片段电泳时间过长或电压过高，DNA 走缩短电泳时间，调整电压出凝胶电极插反， DNA 走出凝胶正确连接电极方向条带大小不正确核酸降解或形成聚合物加热处理或重新制备样品λ DNA 酶切 Marker 的 cos 位点复性电泳前65°C加热5分钟，冰上冷却5分钟以后再上样相同分子量的DNA 片段由于结构或判断 DNA 分子是否有特殊结构，如缺口、超序列的差异而有不同的迁移率螺旋、二聚体等；富含AT 碱基的 DNA 迁移率比同分子量富含GC 碱基的 DNA 片段慢梳子变形，点样孔不在同一水平线上使用完好的梳子制胶带型异常不同样本的上样条件不同选用相同的上样缓冲液，上样量尽可能接近上样量过大或过小选择合适大小的上样孔，样品应完全覆盖点样孔底部核酸样品纯度差，含有DNA 结合蛋酚 /仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质白或高浓度的盐份电泳缓冲液未完全浸没凝胶上样和电泳时，确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶电压过高或电泳时间过长致使凝胶根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当过热和 DNA 变性的电压进行电泳凝胶中加入 EB 造成染色不均加入 EB 时充分混匀或电泳结束后再染色凝胶中有气泡或污染物使用纯水和洁净容器制胶；缓慢灌胶，并赶除气泡点样孔质量差待凝胶完全凝聚后再取出梳子小片段扩散 ,条带模糊 , 错误选择了低浓度凝胶, 观察大片段比如观察 100bp 的小片段用 2%凝胶跑电泳粗用低浓度凝胶, 观察小片段要用高浓度琼脂糖质量不好, 质量不好的琼脂糖换用质量好的琼脂糖分离小片段容易扩散 , 即使是使用高浓度凝胶选择了不合适的电泳缓冲液SD 和 TBE 缓冲液适于分析较小分子量的DNA 片段，大片段分子不能完全分离；TAE缓冲液不适于分离很小的DNA 片段DNA 凝胶电泳简介一、实验原理DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。
琼脂糖凝胶电泳常见问题
不规则DNA带迁移
电泳条件不合适
电泳时电压不应超过20V/CM，温度＜30℃，巨大DNA链电泳，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换
DNA变性
电泳前勿加热，用20mM Nacl缓冲液稀释DNA
DNA上样量过多
减少凝胶中DNA上样量
DNA含盐过高
电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分
有蛋白污染
电泳前酚抽提去除蛋白
DNA变性
电泳前勿加热，用20mM Nacl缓冲液稀释DNA
出现片状拖带或涂抹带
PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。
分子大小相近的DNA带不易分辨
增加电泳时间，核准正确凝胶浓度
DNA变性
电泳前勿加热，用20mM Nacl缓冲液稀释DNA
DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适
在脉冲凝胶电泳上分析
电泳时Ladder扭曲
配胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配置
同时配置，电泳缓冲液高出液面1-2mm即可
电泳ห้องสมุดไป่ตู้电压过高
电泳时电压不应超过20V/CM
带弱或无DNA带
DNA上样量不够
增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低
DNA降解
实验过程避免核酸酶污染
DNA跑出凝胶
缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
EB染色的DNA，所用光源不合适
应用短波长（254nm）的紫外光源
DNA带缺失
电泳常见问题
Marker参考见解：marker有时会出现这样的问题,应该是时间久了。
新买时跑胶在点样孔没有,过一段时间就会在点样孔出现亮点。
也可能是蛋白，有时DNA提的不纯含有蛋白时就会出现上样孔有条带的现象琼脂糖凝胶电泳检测DNA时,跑出的带后面出现拖尾现象,什么原因造成的?参考见解：DNA带模糊??：1、DNA降解??避免核酸酶污染。
2、DNA上样量过多??减少凝胶中DNA上样量。
3、所用电泳条件不合适??电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
4、DNA样含盐过高??电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
5、有蛋白污染??电泳前酚抽提去除蛋白。
6、DNA变性，?电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
将从组织提取的DNA进琼行脂糖凝胶电泳，用的1.5%的胶加了EB，80V跑1小时，溴酚蓝已经跑到头了，在紫外灯观察什么带也没有，只见孔里面有橘红色的亮光。
好象没跑出来，是怎么回事？参考见解：1、根据目的条带长度来调整凝胶浓度，一般1.5％左右，也不一定。
2、紫外灯下没见带，不一定没有出孔，而是量少看不到，可以测一下浓度看一下，或直接试跑一下PCR。
3、最好加一个marker孔，尤其你第一次跑胶时。
4、电泳时间可能过长，一般75v×30min左右，但是具体看溴酚蓝的离孔距离和目的条带离孔距离。
怎样根据目测条带亮度来判断DNA浓度？参考见解：1、跑胶时候marker 可以加成定量marker，如1kb、100bp等marker，按说明书的量上样电泳，如加500ng量的DNA marker，电泳完毕后，就可将目的DNA条带和MARKER 条带的亮度做个大致的比较，找出两者最接近亮度的条带。
因为marker的各条带都已知所含的DNA浓度（说明书中详细注明），因此根据条带的亮度、大小大致就可推测目的DNA的浓度。
2、在通过目测DNA浓度的时候，最好要把加样量设一个梯度，比如从0。
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分析和分离生物大分子的方法。
然而，有时候在进行琼脂糖凝胶电泳实验时，我们可能会遇到条带不清晰的问题，这给结果的解读和分析带来了困扰。
下面我将介绍一些可能导致琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因。
1. DNA样品质量不佳琼脂糖凝胶电泳的前提是获得高质量的DNA样品。
如果DNA样品质量不佳，比如存在脏带、降解或者污染，都会导致条带不清晰。
因此，在进行实验之前，我们需要对DNA样品进行质控，确保其质量符合要求。
2. 样品预处理不当在进行琼脂糖凝胶电泳之前，我们通常需要对DNA样品进行一些预处理，比如酶切、PCR扩增或者纯化等。
如果预处理过程中存在问题，比如酶切反应时间过长、PCR扩增过程中出现非特异性扩增等，都会导致条带不清晰。
3. 聚丙烯酰胺凝胶浓度选择不当琼脂糖凝胶电泳中，聚丙烯酰胺凝胶的浓度是影响条带清晰度的重要因素之一。
一般来说，较低浓度的凝胶适用于较大的DNA片段分离，而较高浓度的凝胶适用于较小的DNA片段分离。
如果选择的凝胶浓度不合适，就会导致条带模糊不清。
4. 电泳条件设置不当电泳条件的设置也是影响琼脂糖凝胶电泳结果的重要因素。
比如，电泳电压、电泳时间和电泳缓冲液的配制等都会影响条带的清晰度。
如果电压过高或者电泳时间过长，都会导致条带模糊不清。
此外，如果电泳缓冲液的配制不正确，比如pH值不稳定或者离子浓度不合适，也会影响条带的清晰度。
5. 负载样品量过多或过少在进行琼脂糖凝胶电泳时，负载样品量的选择也是非常关键的。
如果负载样品量过多，会导致条带扩散，模糊不清；如果负载样品量过少，条带可能会变得非常弱或者根本看不到。
因此，在进行负载样品时，需要根据实验的需要选择适当的样品量。
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因可能是多方面的，包括DNA样品质量不佳、样品预处理不当、聚丙烯酰胺凝胶浓度选择不当、电泳条件设置不当以及负载样品量过多或过少等。
在进行琼脂糖凝胶电泳实验时，我们需要仔细检查每一个步骤，确保实验条件的准确性和合理性，从而获得清晰可靠的结果。
琼脂糖凝胶电泳
DNA琼脂糖凝胶电泳跑胶即走电泳，是DNA 和protein 最基本的定性定量方法。
一般是琼脂糖胶或page 胶，琼脂糖胶一般是检测DNA的，可以检验一下你到底提到dna没过确定你提dna分子量的大小：page胶一般是检测蛋白特性的，通过page胶里marker的分子量大小来确定你需要的目的蛋白分子量大小，如果有杂带那就可以判断那条带是你需要的目的条带，如果想知道蛋白浓度，还可以在page胶里带上一条定量marker，通过条带粗细，来判断你需要蛋白的浓度。
二者原理一致，小分子量用大浓度的胶，大分子量用小浓度的胶，特别小的DNA 用丙烯酰胺凝胶。
一、基本原理当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。
F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。
由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。
此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。
当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。
根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη, γ为颗粒半径，η为介质粘度。
该公式指球形颗粒所受的阻力。
代入F＝E×q得到: v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。
带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示：m＝μ/E=d*l/V*td为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。
在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。
它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化性质。
影响泳动度的因子有颗粒的性质、电场强度、溶液的性质等。
琼脂糖凝胶电泳分离纯化DNA步骤和问题分析
琼脂糖凝胶电泳分离纯化DNA步骤和问题分析琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。
对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。
但由于其孔径相比于蛋白质太大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。
DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动，一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb~50kb范围内的DNA片段，三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：超螺旋DNA＞线型DNA＞开环DNA.琼脂糖预制胶一、选择适合的电泳缓冲液：1、较高浓度的胶有利于提高小分子量核酸的分辨率，常规一般使用TBE缓冲液。
（即Tris 硼酸盐溶液）2、电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。
注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。
二、选择适合的Marker：DNA电泳一定要使用DNA marker或已知大小的正对照DNA来估计DNA片段大小。
Marker的选择要适中，Marker应该选择在目标片段大小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。
如果marker太大就可能跑不开，挤到一起，起不到marker的作用。
三、设备和耗材：移液器、电泳仪电源、水平式凝胶电泳槽、凝胶成像系统、样品、枪头。
琼脂糖凝胶电泳论坛问答整理
要跑琼脂糖凝胶电泳，5ng 就能很清楚的跑出来是这样吗？能够照相的清楚的条带，至少需要多少量呢？参考见解：5ng 已经可以了，但是或许20ng50ng-200ng效果好，在此范围内呈线性。
把210bp的pcr产物进行酶切,得到190+20bp的两个片段,请问能用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果吗?用多大浓度的胶和多大的电压呢?参考见解：可以用琼脂糖凝胶电泳分开,电压不变,可用1.5%到2%的胶,20bp得片断不一定能看得到,所以应用未酶切的PCR片断作对照. 琼脂糖浓度（W/V）大小范围（bp）0.6% 1000-230000.8% 800-100001.0% 400-80001.2% 300-70001.5% 200-40002% 100-3000丙烯酰胺凝胶电泳更适合于分离纯化小分子量核酸（5-500bp）并且分辨率高，可以达到1个bp。
所以建议进行丙烯酰胺凝胶电泳试试。
Marker做琼脂糖凝胶电泳，发现Marker在加样孔有一个明显的亮带，什么原因？参考见解：marker有时会出现这样的问题,应该是时间久了。
新买时跑胶在点样孔没有,过一段时间就会在点样孔出现亮点。
也可能是蛋白，有时DNA提的不纯含有蛋白时就会出现上样孔有条带的现象。
琼脂糖凝胶电泳检测DNA时,跑出的带后面出现拖尾现象,什么原因造成的?参考见解：DNA带模糊??：1、DNA降解??避免核酸酶污染。
2、DNA上样量过多??减少凝胶中DNA上样量。
3、所用电泳条件不合适??电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
4、DNA样含盐过高??电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
5、有蛋白污染??电泳前酚抽提去除蛋白。
6、DNA变性，?电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
将从组织提取的DNA进琼行脂糖凝胶电泳，用的1.5%的胶加了EB，80V跑1小时，溴酚蓝已经跑到头了，在紫外灯观察什么带也没有，只见孔里面有橘红色的亮光。
琼脂糖凝胶电泳回收试剂原理、步骤、问题大全
什么是凝胶电泳？凝胶电泳是根据大小分析和分离DNA片段的可靠方法。
电泳分离后，可以将特定的条带切出琼脂糖凝胶基质，然后进一步处理以纯化DNA。
对于许多工作流程，凝胶电泳仍然是分离特定大小的DNA的最佳方法（尤其是对于大于1kb的片段）。
许多下一代测序（NGS）文库制备仍需要在测序前使用琼脂糖凝胶分离出片段来分离样品。
但是，由于许多研究人员都在努力从原始输入中回收超过50％的产率，因此从凝胶切除物中回收DNA可能具有挑战性。
通过特别注意几个关键点，DNA的产量和质量可以大大提高。
凝胶电泳步骤：从套装开始为了回收尽可能多的DNA，甚至需要在凝胶凝固之前进行考虑。
确认试剂盒的规格以确定其是否与凝胶兼容非常重要。
此外，我们建议选择能产生最小孔的梳子，以解决要溶解的DNA溶液的体积。
这最终将使条带的尺寸保持在更集中的空间，从而使凝胶切除片变小。
快速工作重要的是要记住凝胶暴露在紫外线下的时间。
样品在灯上保存的时间越长，DNA在此过程中受损的风险就越大。
因此，强烈建议在对凝胶成像并切割带子时快速有效地工作。
注意百分比通常，琼脂糖凝胶百分比由DNA片段大小决定。
较小的碎片需要更紧密的矩阵以分隔条带并获得清晰的可视化效果。
这种更紧密的基质需要更高百分比的琼脂糖才能分离出小的DNA片段。
通常，低于2％的琼脂糖凝胶很容易加工。
但是，如果凝胶的琼脂糖含量超过2％，则建议使用额外体积的琼脂糖溶解缓冲液，以确保在进一步处理之前将凝胶完全溶解。
切近DNA条带优化样品输入对于任何实验方案都是至关重要的，从凝胶切除中回收DNA也不例外。
在这种情况下，确保将切片切成尽可能接近所需的DNA条带极为重要。
这样做减少了需要溶解的琼脂糖的量。
我们建议称重切下的凝胶切片，以确保其不超过400毫克。
如果确实超过该数量，则需要扩大反应规模。
确保凝胶切片已溶解在结合到色谱柱上之前，确保琼脂糖完全溶解至关重要。
如果存在任何部分未溶解的琼脂糖痕迹，则可能会将盐浸入基质中，从而与DNA共纯化。
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因
琼脂糖凝胶电泳是一种常见的分离DNA、RNA和蛋白质的方法，但有时会出现条带不清晰的情况，这可能由以下原因造成：
1. 样品制备不当：样品制备是影响琼脂糖凝胶电泳结果的关键因素之一。
如果样品处理不当，如DNA或RNA未能完全溶解或含有杂质，会导致条带模糊或消失。
因此，在进行琼脂糖凝胶电泳前，应该仔细处理样品。
2. 带电物质浓度过高：如果DNA、RNA或蛋白质的浓度过高，会导致它们在凝胶中聚集在一起形成模糊的条带。
因此，在进行琼脂糖凝胶电泳时应该注意调整样品浓度。
3. 凝胶制备不当：凝胶制备也是影响结果的重要因素之一。
如果凝胶制备不当，如pH值、离子强度或聚合物浓度等参数没有正确控制，会导致凝胶结构不稳定或缺陷，并且影响分离效果。
4. 电泳条件设置错误：电泳条件也是影响结果的关键因素之一。
如果电场强度过高或时间过长，会导致条带扩散或聚集在一起，从而影响分离效果。
因此，在进行琼脂糖凝胶电泳时应该注意设置合适的电泳条件。
5. 染色不充分：染色是观察条带的关键步骤之一。
如果染色不充分或时间过短，会导致条带颜色暗淡或消失，从而难以观察。
综上所述，琼脂糖凝胶电泳条带不清晰可能由样品制备不当、带电物质浓度过高、凝胶制备不当、电泳条件设置错误或染色不充分等多种原因造成。
为了得到清晰的结果，需要仔细处理样品、调整浓度、正确制备凝胶、设置合适的电泳条件和充分染色。
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因
琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因介绍琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和鉴定DNA、RNA和蛋白质的技术。
然而，在执行琼脂糖凝胶电泳实验时，有时会发现条带不清晰的情况。
本文将深入探讨琼脂糖凝胶电泳条带不清晰的原因，并提出相应的解决方案。
二级标题1：样品质量差在分离和凝胶电泳之前，合理选择、处理和保存样品是确保条带清晰的关键之一。
三级标题1.1：DNA/RNA质量差1.确保使用高质量的DNA/RNA提取试剂盒，遵循厂家提供的操作指南。
2.在提取DNA/RNA的过程中，注意样品的污染问题，如DNA污染、RNA降解等。
3.波长为260 nm和280 nm的比值是衡量DNA/RNA纯度的指标，确保该比值在1.8至2.0之间。
4.使用凝胶电泳仪器前，对DNA/RNA样品进行定量，确保加载足够的样品。
三级标题1.2：蛋白质质量差1.使用高纯度的蛋白质提取试剂盒提取样品。
2.注意蛋白质样品的保存温度和时间，避免蛋白质降解。
3.使用SDS-PAGE等技术进行蛋白质分离，确保负载均衡。
二级标题2：电泳条件不当电泳条件的设置对于琼脂糖凝胶电泳的条带清晰度具有重要影响。
三级标题2.1：电泳缓冲液配制问题1.确保电泳缓冲液的pH值和离子浓度符合实验要求。
2.避免电泳缓冲液的变质和二次污染。
三级标题2.2：凝胶浓度和孔隙度不合适1.根据DNA/RNA或蛋白质的分子大小选择适当的琼脂糖凝胶浓度，以充分分离目标分子。
2.考虑使用不同孔隙度的琼脂糖凝胶，以适应不同大小的DNA/RNA或蛋白质。
三级标题2.3：电泳电压和时间错误1.根据实验要求，设置合适的电泳电压和时间。
2.避免电泳时间过长，以免造成DNA/RNA或蛋白质的扩散和模糊化。
三级标题2.4：电泳缓冲液温度过高1.调整电泳室的冷却系统，控制电泳缓冲液温度在合适的范围内。
2.避免电泳缓冲液温度过高导致琼脂糖溶解和扩散。
二级标题3：样品加载问题样品的加载方式和负载量也会影响琼脂糖凝胶电泳的结果。
凝胶电泳常见问题分析
凝胶电泳常见问题分析2008-09-15 21:43要跑琼脂糖凝胶电泳， 5ng 就能很清楚的跑出来是这样吗？能够照相的清楚的条带，至少需要多少量呢？参考见解：5ng 已经可以了，但是或许20ng50ng-200ng效果好，在此范围内呈线性。
把210bp的pcr产物进行酶切,得到190+20bp的两个片段,请问能用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果吗?用多大浓度的胶和多大的电压呢?参考见解：可以用琼脂糖凝胶电泳分开,电压不变,可用1.5%到2%的胶,20bp得片断不一定能看得到,所以应用未酶切的PCR片断作对照.琼脂糖浓度（W/V）大小范围（bp）0.6%1000-230000.8%800-100001.0%400-80001.2%300-70001.5%200-40002%100-3000丙烯酰胺凝胶电泳更适合于分离纯化小分子量核酸（5-500bp）并且分辨率高，可以达到1个bp。
所以建议进行丙烯酰胺凝胶电泳试试。
Marker做琼脂糖凝胶电泳，发现Marker在加样孔有一个明显的亮带，什么原因？参考见解：marker有时会出现这样的问题,应该是时间久了。
新买时跑胶在点样孔没有,过一段时间就会在点样孔出现亮点。
也可能是蛋白，有时DNA提的不纯含有蛋白时就会出现上样孔有条带的现象。
琼脂糖凝胶电泳检测DNA时,跑出的带后面出现拖尾现象,什么原因造成的?参考见解： DNA带模糊??：1、 DNA降解??避免核酸酶污染。
2、 DNA上样量过多??减少凝胶中DNA上样量。
3、所用电泳条件不合适??电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA 链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
4、 DNA样含盐过高??电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
5、有蛋白污染??电泳前酚抽提去除蛋白。
6、 DNA变性，?电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
将从组织提取的DNA进琼行脂糖凝胶电泳，用的1.5%的胶加了EB，80V跑1小时，溴酚蓝已经跑到头了，在紫外灯观察什么带也没有，只见孔里面有橘红色的亮光。
琼脂糖凝胶电泳失败的原因
琼脂糖凝胶电泳失败的三大原因及解决方法琼脂糖凝胶电泳是常用分离DNA或RNA等生物大分子的方法之一。
但是，在进行琼脂糖凝胶电泳时，经常会出现失败的情况，影响实验
结果。
下面介绍三种常见的琼脂糖凝胶电泳失败原因及解决方法。
一、凝胶制备不当
凝胶制备不当是琼脂糖凝胶电泳失败的常见原因之一。
凝胶的浓
度和 pH 值的不准确，会导致样品在凝胶上的迁移速度不同，分离效
果差。
解决方法：
1、准确称量琼脂糖的用量，按标准比例配制凝胶；
2、保持 pH 值适当，通常为 7.5-8.0；
3、使用新鲜的试剂，防止污染。
二、电泳条件不正确
电泳条件对于琼脂糖凝胶电泳的成功与否有很大的影响，如果电
泳时间不够或者电场强度不够，样品可能没有分离开来。
解决方法：
1、选择正确的电泳缓冲液；
2、根据样品的大小和特性来制定合适的电泳时间和电场强度；
3、定期更换电泳缓冲液，防止污染。
三、样品制备不当
样品制备不良，也是琼脂糖凝胶电泳失败的原因之一。
不同的组织、细胞、DNA或RNA等样品，对样品的制备条件有不同的要求。
解决方法：
1、严格按照标准或常规操作制备样品；
2、根据样品的大小和性质，选择合适的溶解方法；
3、尽可能地去除污染物或者其他干扰物。
综上所述，准备好琼脂糖凝胶，选择合适的电泳条件，以及正确地制备样品，是避免琼脂糖凝胶电泳失败的关键。
琼脂糖凝胶电泳常见问题分析
琼脂糖凝胶电泳常见问题分析DNA凝胶电泳简介一、实验原理DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。
根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：1、聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。
2、琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。
电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。
由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。
二、琼脂糖凝胶琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104～105的长链。
琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。
表1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。
表1不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围胶的再溶化，象NaClO4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。
随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4）适用于DNA大片段的分离。
（5）其它类型。
各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。
三、DNA电泳影响因素DNA为碱性物质，在电泳（缓冲液pH=8）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。
常见琼脂糖凝胶电泳错误
部分：向DNA样本说再见——常见琼脂糖凝胶电泳错误1. 使用水代替凝胶缓冲液或电泳缓冲液琼脂糖凝胶配制和电泳通常使用TAE或TBE缓冲液进行。
如果您使用水进行凝胶配制和跑电泳，您的凝胶将在电泳时很快融化。
TAE、TBE和水都是透明的溶液；因此，在配制时请检查容器的标签。
2. 使用了错误浓度的琼脂糖DNA凝胶电泳所需的标准琼脂糖浓度为1.0%。
浓度越高，小条带的分辨率越高；反之，琼脂糖浓度越低，大分子量条带的分辨率和分离程度越高。
如果使用了错误浓度的琼脂糖凝胶，就很难确定DNA 条带的可靠性。
当使用低百分比浓度琼脂糖凝胶时要小心；它们往往较软，更容易破损。
3. 颠倒了电泳槽与电源连接线的方向这是很容易犯的错误，但是如果你不小心颠倒了电泳槽与电源连接线的方向，结果将会非常令人沮丧。
因为样本会向相反方向移动，而且由于上样孔与凝胶的末端很近，您会丢失所有的样本。
开始您的电泳后确保DNA样本以正确的方向进入凝胶；如果您看到您的条带向错误的方向移动，请颠倒电源线的方向。
II部分：琼脂糖凝胶中实现更高分辨率的5种方法1. 什么是适合于您的琼脂糖凝胶电泳的正确缓冲液？进行DNA琼脂糖凝胶电泳所需的缓冲液类型，主要取决于DNA片段大小和电泳后的应用。
进行琼脂糖凝胶电泳最常见的两种缓冲液是Tris-乙酸EDTA缓冲液（TAE）和Tris-硼酸EDTA缓冲液（TBE）。
因为两种缓冲液的pH值都接近中性，所以缓冲液中的DNA都带净负电荷并向凝胶装置正极(+)方向移动。
对于小片段DNA (<1000 bp)，如果没有计划从凝胶中回收DNA，那么推荐使用1x TBE缓冲液。
TBE 溶液具有高离子强度和缓冲能力。
TAE缓冲液，结合低电场强度（1–2 V/cm），最适于分离大DNA （12–15 kb）。
TAE缓冲液与琼脂糖相互作用，相比较TBE缓冲液中的琼脂糖凝胶，会产生更低的电渗透，更大的表面孔经，和更低的电场强度，可降低大DNA的smear现象。
琼脂糖凝胶电泳没有条带的原因
琼脂糖凝胶电泳没有条带的原因
琼脂糖电泳没有条带的原因
如果琼脂糖能正常凝固，那变质可能性不大。
如果连marker都看不见
1.如果不要求回收而只是看带，TBE可以不用灭菌，但是PH值要调，这影响DNA的迁移率。
很有可能你的marker 都没跑开。
2.可能是荧光染料过期了或者用量不够，可以考虑在合适范围类适当加大用量或者用EB试试，EB毒性大，但是染色能力比低毒染料强。
3.检查marker的保质期，单独跑一次marker，可能这个marker不行了。
4.点样没点好或者制孔没制好，marker孔破洞了。
可以考虑把胶浓度适度配高点，胶稍稍做厚点，孔底和胶底的距离适当拉高点，这样制孔的时候比较难破洞，点样的时候即使新手也难戳穿。
等你marker能跑出带后，确定没问题再跑PCR产物，如果PCR产物在无操作失误的情况下没有带，就是PCR条件和引物设计的问题了。
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琼脂糖凝胶电泳常见问题分析
DNA凝胶电泳简介
一、实验原理
DNA电泳是基因工程中最基本的技术，DNA制备及浓度测定、目的DNA片段的分离，重组子的酶切鉴定等均需要电泳完成。
根据分离的DNA大小及类型的不同，DNA电泳主要分两类：
1、聚丙烯酰胺凝胶电泳适合分离1kb以下的片段，最高分辨率可达1bp，也用于分离寡核苷酸，在引物的纯化中也常用此中凝胶进行纯化，也称PAGE纯化。
2、琼脂糖凝胶电泳可分离的DNA片段大小因胶浓度的不同而异，胶浓度为0.5～0.6%的凝胶可以分离的DNA片段范围为20bp～50kb。
电泳结果用溴化乙锭（EB）染色后可直接在紫外下观察，并且可观察的DNA条带浓度为纳克级，而且整个过程一般1小时即可完成。
由于该方法操作的简便和快速，在基因工程中较常用。
二、琼脂糖凝胶
琼脂糖是从琼脂中分离得到，由1，3连接的吡喃型b-D-半乳糖和1，4连接的3，6脱水吡喃型阿a-L-半乳糖组成，形成相对分子量为104～105的长链。
琼脂糖加热溶解后分子呈随机线团状分布，当温度降低时链间糖分子上的羟基通过氢键作用相连接，形成孔径结构，而随着琼脂糖浓度不同形成不同大小的孔径。
表1给出了不同浓度凝胶对DNA片段的线性分离范围。
表1不同类型琼脂糖分离DNA片段大小的范围
由于琼脂糖凝胶是通过氢键的作用，因此过酸或过碱等破坏氢键形成的方法常用于凝胶的再溶化，象NaClO4能用于凝胶的裂解，一般的凝胶回收试剂盒利用的也是这一原理。
随着实验技术的发展，也针对不同用途开发了各种类型的琼脂糖凝胶：（1）低熔点琼脂糖凝胶，用于DNA片段的回收，且由于该种凝胶中无抑制酶，可在胶中进行酶切、连接等；（2）高熔点凝胶，可分离小于1kb的DNA片段，专用于PCR产物的分析；（3）快速凝胶，电泳速度比普通凝胶中快一倍，可节省实验时间；（4）适用于DNA大片段的分离。
（5）其它类型。
各生产商还开发很多类型的凝胶，可根据实验要求选择不同类型的，选择原则是考虑合适的机械强度和熔点。
三、DNA电泳影响因素
DNA为碱性物质，在电泳（缓冲液pH=8）时带负电荷，在一定的电场力作用下向正极泳动。
而DNA链上的负电荷伴随着DNA分子量的增加而增加，荷质比是一常数，故电泳中DNA的分离类似分子筛效应。
电泳中影响DNA分子泳动的因素很多，主要分两方面：DNA分子特性和电泳条件。
1、DNA分子大小：DNA分子越大在胶中的摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。
2、DNA分子构型：对于质粒DNA分子即使具有相同分子质量，因构型不同也会造成电泳时受到的阻力不同，最终造成泳动速率的不同。
常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状分子次之，开环分子最慢。
3、不同的胶浓度：对于同种DNA分子胶浓度越高，电泳速率越慢。
不同胶浓度对于DNA片段呈线性关系有所区别，浓度较稀的胶线性范围较宽，而浓的胶对小分子DNA 片段呈现较好的线性关系。
所以常规实验中对于小片段DNA分子的分离采用高浓度的胶分离（有时甚至用2％的凝胶），而对于分离大片段则用低浓度的凝胶。
4、电场强度：电泳时为了尽快得到实验结果，所用的电场强度约为5V/cm，这样的场强下虽能得到结果，但分辨率不高。
在精确测定DNA分子大小时，应降低电压至1V/cm。
电场强度偏高时电泳分离的线性范围会变窄，电压过高时也会由于电泳中产生的大量热量导致DNA片段的降解。
实验中要根据需要选择合适电压，如对于DNA大片段的分离可适当选择较低电压进行（在Southern杂交中的DNA电泳），避免托尾现象的产生；而对于小分子DNA，由于其在凝胶中的快速扩散会导致条带模糊，可选用相对较高的电泳以缩短电泳时间。
5、溴化乙锭：简称EB，电泳中的染色剂，具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。
当DNA分子中嵌入的EB分子逐渐增多时，原来为负超螺旋状态的分子开始向共价闭合环状转变，电泳迁移速度由快变慢；当嵌入的EB分子进一步增加时，DNA分子由共价闭合环状向正超螺旋状态转变，这时电泳迁移速率又由慢变快。
这个临界点的游离EB质量浓度为0.1g/ml~0.5g/ml，即电泳时所加的浓度。
因此一般电泳可以忽略此因素，而对于特殊电泳，消除此因素影响可采用电泳后染色。
6、电泳缓冲液：目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳：TAE、TBE和TPE，其组成及特点见表2。
一般常用的DNA电泳选用TAE较多，其电泳时间较快，而且成本比较低，但是其缓冲容量较低，需经常更换电泳液。
表2 常用DNA电泳缓冲液
四、DNA上样缓冲液
电泳中DNA点样前必须加入一定量的上样缓冲液，主要作用如下：
1、螯合Mg2+，防止电泳过程中DNA被降解，一般上样缓冲液中含10mmol/L的EDTA。
2、增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。
而在大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可减少DNA 条带的弯曲和托尾现象。
3、指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与300bp的线状双链DNA相同。
目前厂商提供的限制性内切酶中都有赠送的上样缓冲液，一般为10×上样缓冲液，DNA样品中仅需加入1/10的量即可，加入过多的上样缓冲液会造成电泳轻微的托尾现象。
五、DNA上样量的控制
在分析性电泳中，一般样品投入量达50～100ng/带即可观察到清晰结果，而对于珍贵DNA样品则上样量达电泳的最低分辨率5～10ng/带也可。
而对于一定量的DNA，当电泳时采用较薄的梳子制胶，则电泳时DNA条带相对较窄，观察较清晰；而随着电泳时间的延长，由于DNA分子本身有一定的扩散，电泳条带也会变浅。
对于染色体DNA的酶切片段包含各种大小的条带，上样量即使超过10mg条带也不会托尾，而单一条带（>10kb）当上样量超过200ng就有可能产生托尾现象。