蛋白质双向电泳
《双向电泳技术》课件
高通量
该技术可以同时分离大量蛋白质，提高了实 验的通量。
高稳定性
该技术具有较高的稳定性，实验结果重复性 好。
缺点
实验周期长
双向电泳技术的实验周期较长 ，需要耗费较多的时间和人力
。
对样品要求高
该技术需要大量的起始样品， 并且对样品的纯度要求较高。
对实验条件要求严格
双向电泳技术的实验条件较为 苛刻，需要精确控制实验参数 。
在药物研发中的应用
总结词
双向电泳技术为药物研发提供了高通量和高效率的蛋白质分离手段，有助于发现潜在的药物靶点和筛 选候选药物。
详细描述
在药物研发过程中，双向电泳技术可用于分析药物对蛋白质表达谱的影响，从而发现药物作用的靶点 。此外，通过比较不同物种或组织的蛋白质表达谱，可以发现潜在的药物靶点，为新药研发提供思路 和候选药物。
应用领域的拓展
疾病诊断与治疗
利用双向电泳技术分析疾病相关蛋白质，为疾病诊断 和治疗提供依据。
药物研发
通过双向电泳技术筛选药物作用靶点，加速新药研发 进程。
生物工程与农业
在生物工程和农业领域中应用双向电泳技术，优化生 物过程和育种。
未来发展方向与挑战
标准化与规范化
建立双向电泳技术的标准化操作流程和质量控制体系，提高实验 结果的可靠性和可比性。
CHAPTER 02
双向电泳技术的实验流程
样本制备
01
02
03
样本选择与处理
选择适当的组织或细胞样 本，进行适当的处理以提 取蛋白质。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和试剂 ，从样本中提取蛋白质。
蛋白定量
使用蛋白质定量方法，确 定蛋白质的浓度。
蛋白质提取
溶解蛋白质
蛋白质组学研究的有效工具——双向电泳鉴定技术
进行二 次 电泳 的过程 ． 首先在 第 一 向电泳 中根 据
蛋 白质所 带 电荷 的性质 进 行 等点 聚 焦 （Ｅ ） 等 ＩＦ ，
２ 双 向 电泳 的 主 要技 术 步 骤
２ １ 样 品制备 ．
点聚焦 时 由于各 种蛋 白等 电点 的不 同 ， 高 电压 在 场 的作用 下 ， 白质 在 ｐ 梯 度 胶 中移 动 ， 到 蛋 Ｈ 直
３ 攀 枝 花市 食 品与 药 品 监督 管 理 局 ，四 川 攀 枝 花 ．
［ 摘
要 ］ 当今 生命科 学研 究的热 门领域 蛋 白质 组 学研 究 中 ， 向电泳技 术是 分 离检 测 细胞 、 在 双
细胞 系、 器官和组织的 总蛋 白质组 的最有 效的方法． 双向 电泳技术是根据蛋 白质等 电点和分子 量 两个相互独立 的参数 ， 在相互垂直 的两个方 向进行 二 次 电泳 的过 程 ， 主要 步骤 包括 样品 制备 、 其
质． 目前 ＩＧ—Ｄ Ｌ Ｐ Ａ Ｔ已 经取 代 其 他 两 者 成 为 等
点聚焦 的主要 手段 ． 的优势 在 于 ：Ｈ 梯度 稳 它 ｐ
定， 聚焦 准确 ， 度高 ； 阴极 漂移 及碱 性 蛋 白丢 精 无 失的现象 ； 白上 样 量 大 ， 以提 高低 丰 度 成分 蛋 可
蛋 白几乎是 不 可 能 的． 根据 实验 要 求 的 不 同 ， 可 按各 种属性 将蛋 白分别 提取 ， 比如 Ｍｏ ｏ ｌｙ等 用 ｌ ３种 分别 适 合 溶 解 高 、 、 亲 水 性 蛋 白质 的裂 中 低
［ 收稿 日期 ］０ ０— ８—１ ２１ ０ ５
的提取 ， 可在样 ຫໍສະໝຸດ 中加入蛋 白酶抑制 剂 以 防蛋 白
质 水解 ， 在样 本 处理 中尽 量 富集 低 丰度 蛋 白 ， 并 采用 灵 敏度较 高 的银 染或荧 光染 色．
双向电泳详细操作过程
蛋白质的双向电泳一、实验原理：2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE 是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二、实验步骤：1. 芽孢杆菌蛋白质的提取2. 蛋白质样品的纯化将经过硫酸铵沉淀的蛋白质冷冻干燥，放在-80度冰箱里备用，取出蛋白质干粉300mg 加水化液(尿素水化储备溶液)400ul，加丙酮酸（加DTT）1.6ml，放置-20度冰箱2h，离心，吸除丙酮酸，用超纯水中（加DTT），清洗两次，离心，加水化液溶解。
水化液配置：用dd H20定容水化液浓度100ml 20ml尿素（60.06）7M/L 42.0g 8.4g硫脲（76.12）2M/L 15.2g 3.04gCHAPS 4% 4g 0.8gDTT(154.2) 1% 1g 0.2g（注：DTT现用现加）3. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA（牛血清白蛋白）用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 20ul, 40ul, 60ul, 80ul , 100ul的BSA溶解液，在分别加入100ul,80ul,60ul ,40ul,20ul,0ul, 分别加入4ml的Bradfor。
另取2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，各管中分别加入4ml的Bradfor，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
例如：标准曲线方程式：Y= aX+b.其中Y为OD值，X为蛋白含量。
a、b通过作图输入数据可知G250的配置：称取G250 固体0.1g加水定容至1L。
使用前滤纸过滤。
比色皿用70%的乙醇保存，待用时用双蒸水冲洗，再用无水乙醇冲洗，双蒸水冲洗，再加入待测样品溶液润洗，然后，加入样品，测定OD值。
蛋白质双向电泳(two-dimensional electrophoresis)过程与体会-3
蛋白质双向电泳(two-dimensional electrophoresis)过程与体会-3 二、一向电泳（13cm的holder）（1）取大约70-100ng的蛋白与溶胀液混合总体积达到250vl（2）将上述溶液加到holder 的两个电极之间。
（3）去掉胶条的保护膜，胶面朝下，先将胶条尖端朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中，慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡，最后放下胶条平端，使溶液浸湿整个胶条。
（4）在胶条上覆盖适量的覆盖油，盖上盖子。
（5）将胶条槽平放于一向仪器上，与水平方向垂直。
（6）设置仪器的运行参数：三、胶条的平衡（由一向到二向）（1）将胶条放入10ml 平衡缓冲液中（加入10mgDTT）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。
（2）将胶条取出放入10ml 新的平衡缓冲液中（加入250mg 的碘乙酰胺）封口，在振荡仪上振荡15 分钟。
（3）用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的平衡缓冲液。
四、二向电泳（1）将平衡好的胶条直接转移到第二向制好的SDS胶上，然后用琼脂糖封顶，准备第二向电泳.（2）设置仪器的运行参数：五、平板胶的染色硝酸银染色：（整个操作在摇床上进行）（1）固定：25ml的冰醋酸，100ml甲醇，125ml 去离子水，60 分钟。
（2）敏化：75ml甲醇，0.5g硫代硫酸钠（使用之前加入），17g醋酸钠，165ml去离子水，30分钟。
（3）清洗：用250ml 的去离子水清洗3 次每次5 分钟。
（4）银染：0.625g硝酸银，250去离子水，（使用之前配制）20 分钟。
（5）显色：6.25g碳酸钠，100vl 的甲醛（使用之前加入），250ml去离子水。
（6）终止：5%的醋酸。
（7）照相分析。
（8）保存制作干胶。
药品：提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g 尿素0. 2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M 的DTT65μl/ml。
蛋白质双向电泳实验流程
蛋白质双向电泳实验流程一．样品制备1.研磨研磨时间要尽量短，并需及时补充液氮，研磨要充分，同时要保证损失少。
2.重新加入8mltris饱和状态酚（ph8.8）和8ml裂解液，在通风橱内研磨30s。
先加8mltris饱和状态酚，tris饱和状态酚会变为液态，此时需以研磨碓将液态的tris饱和状态酚研磨变成小块。
接着重新加入8ml裂解液，也须要将液态的裂解液研磨变成小块。
等三者搅匀后，将粉末迁移至45mltube。
3.振荡30min。
室温静置，等待tube中液态变为液体后，已经开始震荡。
震荡须要持续30min，每震荡1min，放在冰上加热1min。
4.10000g，4℃，10min。
将酚相（topphase）转移至45mltube。
酚相（topphase）可置于冰上。
酚二者必须就是绿色的，水相必须就是淡黄色的。
5.取6ml的抽提液和6ml饱和酚加入水相，蜗旋振荡30min。
振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。
6.10000g，4℃，10min。
将酚二者（topphase）迁移至45mltube。
7.沉淀酚相。
取一定体积（是酚相的5倍）的0.1m乙酸铵/甲醇溶液（c20℃保存）于酚相（45mltube）。
振荡30s，c20℃培育1h或过夜。
8.冲洗结晶①15min，20,000g，4℃。
弃上清。
②提10ml0.1m乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
③15min，20,000g，4℃。
弃上清。
④重新加入10ml乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑤15min，20,000g，4℃。
弃上清。
⑥提10ml80%丙酮（ice-cold)，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑦15min，20,000g，4℃。
弃上清。
⑧重新加入10ml80%丙酮(ice-cold)，用移液器吸打。
c20℃结晶30min。
⑨15min，20,000g，4℃。
弃上清。
蛋白质双向电泳简介
胶条平衡
在第二向SDS-PAGE分离前,必须要平衡IEF 胶。主要目的是用含有SDS的第二向介质 置换含有尿素的第一向介质,使分离蛋白质 与SDS能完全结合,保持蛋白质的巯基呈还 原状态,避免发生重氧化,确保在SDS-PAGE 过程中正常迁移。聚焦后的蛋白质在IEF胶 内处于其等电点处,净电荷为零,若未进行平 衡过程而直接进入第二向的SDS-PAGE分 离,蛋白质仍滞留在IEF胶中不能在第二向凝 胶中正常迁移。胶条平衡包括两个简短的 步骤,每步10~15 min。
复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完 成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。
IPG胶条的pH范围
预试验确定 先宽后窄 先线性后非线性 先短后长
等电聚焦
胶条水合完成后,将开始运行等电聚焦。首先 在胶条两端接触电极处垫上水饱和的纸芯,以 防在高电压下胶条与电极的直接接触,损坏胶 条,同时可以吸附聚焦过程中迁移至两端的盐 离子。等电聚焦最好在高压电源下运行,在IPG 胶条的限制电流范围内迅速将电压升至最后的 目标电压。电压(V)与时间(h)的整合被称为伏 特小时(Vh),可以作为一个相同样品在不同运行 时间比较重现性的参数,也可以作为聚焦是否 充分的指标
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其 典型代表是尿素和硫尿。
表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后， 还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面 活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和 NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS 和SB3-10最好。
双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)-1
双向电泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)-1一、蛋白质组学概论随着人类基因组计划的实施，生命科学步入了后基因组时代，出现了不同于以往经典生物实验科学的全新的研究方式─“生物大科学”。
这种生物大科学的核心思想是整体性研究，即以生物体内某类物质为对象进行完整的研究。
过去对生命活动的研究仅限于研究细胞内个别的基因或蛋白质，而基因组学和蛋白质组学的目标则是细胞内全部的基因和蛋白质。
因此，生物大科学与经典实验生物学在研究思路上有一个重要的区别：前者通常不针对具体的生物学问题或科学假设，其目标主要是把全部研究对象测定清楚，被称为“发现的科学”（Disco very Science）；而后者属于“小科学”，其实施则离不开具体的生物学问题或科学假设，被称为“假设驱动的科学”(Hypothesis-drive n Science)。
显然，生物大科学与经典实验生物学各有其所长，前者“广”而后者“深”。
如何把这二者有机地结合起来，使得人们能够更深刻更全面的揭示生命复杂体系和行为，这是后基因组时代生命科学工作者面临的重要课题，系统生物学（Systems Biology）就是针对这样一个时代需求而产生的生命科学研究领域的一门新兴学科。
它以基因组学和蛋白质组学为基础，通过实验观察和数学建模的反复迭代过程来描述和预测生物系统的动态行为。
点此下载本文的PDF全文：双向电泳(two-dimensional electrophores is).pdf蛋白质组学是系统生物学的基础和组成部分之一，在后基因组学时代的地位尤为突出。
蛋白质组学的内容包括：表达蛋白质组学（express ion proteomics）、结构蛋白质组学（structural proteomics）和功能蛋白质组学（functional proteomics）。
双向电泳是蛋白质组学研究的经典方法之一，特别是对于表达蛋白质学的研究是不可缺少的手段。
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤双向电泳操作步骤及相关溶液配置A(实验过程一实验原理:2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离，第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同，而将一向分离后的蛋白进一步分离。
这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
二实验步骤:1. 样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。
其中每隔10,15分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，—80oC保存。
2. Bradford法测蛋白含量取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
取7个10ml的离心管，首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul,10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液，另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液，再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul)，然后，各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用)，摇匀，2min在595nm下，按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值，再测样品OD值。
(测量过程要在一个小时内完成)。
3. 双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05, 的溴酚兰，3.5ul(0.5,v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。
在含300ug 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。
3.2 点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开 Immobiline DryStrip gels (18cm，pH 3—10)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。
Western-Blot-蛋白质双向电泳
蛋白质双向电泳
*双向电泳技术在蛋白质组学中发挥着重 要的作用,可用于研究样品总蛋白、不同 样品蛋白质表达差异、蛋白质间相互作 用、蛋白质修饰等。 *在人类恶性肿瘤的研究中，人们可以通 过双向电泳技术分离正常组织细胞和肿 瘤细胞之间的差异蛋白质组分，在寻找 肿瘤特异型标志物，解释肿瘤发病机制 及治疗方面有极大作用。 *双向电泳的出现，为动态、高通量的研 究药物作用机制提供了强有力的支持。
操作步骤
Western blot
Westernblot法应用分子生物学、生物化学和免疫遗传学 中时常会用到的一种实验方法，蛋白质分析中应用的W estern杂交法是把电流分离的组分从凝胶转移至一种固相 支持体，并以针对特定氨基酸所制备的特异性样品作为 探针检测其相同或相似序列。 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是 蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗它与 附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异 性反应。它能够从生物组织的粗提物或部分纯化的粗提 物中检测和识别几种特异的蛋白质。 这一技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水 平而又无需免疫沉淀法那样必须对靶蛋白进行放射性标 记。因此要对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的 某些特定蛋白进行鉴别和定量时，Westernblot法极为有 用
应用
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（4）IPG 胶条的平衡
• 将胶条放入平衡缓冲液Ⅰ中，封口，在摇床上振荡15 min。
• 将胶条取出放入平衡缓冲液Ⅱ中，封口，在摇床上振荡 15 min。
蛋白质的分离纯化及双向电泳
离 解 和
不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质 粒子带负电荷，在电场中向正极移动；
电 泳
在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带
现 正电荷，在电场中向负极移动。这种现
象 象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。
电泳
蛋白质在等 电点pH条件 下，不发生 电泳现象。 利用蛋白质 的电泳现象， 可以将蛋白 质进行分离 纯化。
用 如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉
淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。
蛋白质的性质与它们的结构密切相关。
4 某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质
蛋 的结构状态，引起蛋白质理化性质改变
白 质 的
并导致其生理活性丧失。这种现象称为 蛋白质的变性(denaturation)。
变
性
蛋白质的变性
变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水 和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有 的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不 可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、 激烈的搅拌以及强酸和强碱等。
超过滤法
超过滤技术是在一定的密封容器，施
2 ． 蛋
加一定压力使一定分子量的物质透过 超滤膜。
白 其中包括有：中空纤维超滤器、圆筒
质 的 纯
式超滤器、板式超滤器。 超滤膜的截止分子量有100万、50万、
化 30万、10万、5万、1万、5千和1千
方法ຫໍສະໝຸດ 超过滤法2 ． 蛋 白 质 的 纯 化 方 法
2 半透膜，而使它与其它小分子化合物，如
． 无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及
蛋 表面活性剂等分离。
白 质 的
常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料， 截止分子量一般为一万。
纯
双向电泳法
双向电泳法双向电泳法（Bidimensional Electrophoresis，2-DE）是一种常用的蛋白质分离技术，可以同时分析样品中上千种蛋白质。
本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。
原理双向电泳法结合了等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE两种技术，通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。
在第一维度中，根据蛋白质的等电点（pI）进行分离；在第二维度中，根据蛋白质的分子量进行分离。
通过将这两个维度的分离结果叠加，可以获得高分辨率的蛋白质图谱。
双向电泳法的关键步骤如下：1.等电聚焦（IEF）：在第一维度中，使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按照其等电点进行分离。
等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子（OH-）或氢离子（H+）方向移动的分离方法。
在等电聚焦过程中，蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移，直到净电荷为零。
通过控制pH梯度和应用的电压，可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。
2.SDS-PAGE分离：在第二维度中，将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝胶垂直叠加。
在SDS-PAGE凝胶中，蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。
由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。
因此，蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。
3.染色和分析：经过双向电泳分离后，凝胶可以通过染色方法显示出一系列斑点，每个斑点代表一个蛋白质。
常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。
对于银染法，它在灵敏度和线性范围上具有优势。
染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。
通过对斑点的比较和定量，可以识别不同样品之间的差异和变化。
步骤双向电泳法的步骤如下：1.样品制备：将待分析的生物样品（如细胞提取物）进行蛋白质提取，并使得蛋白质在石蜡中可溶解。
常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。
2.等电聚焦（IEF）：将蛋白质样品与具有连续pH梯度的凝胶进行接触。
蛋白质双向电泳
将胶条取出放入10
用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤
5 SDS－PAGE
使蛋白质按照分 子量的大小来分 离
6 胶条染色
染色示例
7 呈像及图像分析
获取凝胶图象；
调整和校准凝胶图象；
检定和定量蛋白点；
注释蛋白点和像素；
匹配凝胶图像；
分析、整合数据并报告结果
蛋白质双向电泳
蛋白质双向电泳是最主要的基于胶的蛋白质组学分离技 术，具有高灵敏度和高分辨率，便于计算机进行图像分 析等优点
蛋白质双向电泳的原理
第一向 等电聚焦，根据蛋白质等电点进行分离
第二向 SDS－PAGE电泳，根据相对分子质量分离蛋白质
操作步骤
1 样品制备
2 IPG条的重泡涨及上样 3 第一向等电聚焦
注意事项
（1）根据预分离蛋白质的相对分子质量范围确定使用的凝胶的浓度。
（2）凝胶染色方法众多，其主要区别是灵敏度不同，需根据实际需要选择。通常 考马斯亮蓝染色能检测到约含量为1 μg的蛋白质点，硝酸银染色法能检测到含量为 ng级的蛋白质点。
（3）离子是等电聚焦过程中比较大的干扰因素，在实验过程中应该尽量避免引入 离子。如蛋白质提取方法的确定，使用去离子水等。
应用前景 应用双向电泳技术分离肿瘤与正常组织细胞之间的差异表达蛋白可为寻找肿 瘤的特异标志物、揭示肿瘤的发病机制以及开发新的肿瘤治疗方式及治疗药 物等提供新途径。电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外，最主要用于 蛋白质、核酸、酶，甚至病毒与细胞的研究
4 胶条的平衡
5 SDS－PAGE 6 胶条染色 7 呈像及图像分胞
蛋白质双向电泳
模块五蛋白质双向电泳1. 实验目的掌握双向电泳能根据等电点和分子量分离蛋白质的原理，第一向等电聚焦电泳（IEF）和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）操作步骤，掌握凝胶染色方法，掌握凝胶分析软件的使用，了解对分离出的特异蛋白质的进一步分析方法，了解利用电泳技术分析生物大分子的方法。
2. 实验原理从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。
目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。
这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。
双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。
在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。
第一向等电聚焦：等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholyte）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。
以电泳观点看，蛋白质最主要的特点是它的带电行为，它们在不同的pH值环境中带不同数量的正电荷或负电荷，只有在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoeletric point，PI）。
在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH 环境中以阳离子形式向负极移动。
如果在pH梯度环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集，聚焦部位的蛋白质质点的净电荷为零，测定聚焦部位的pH即可知道该蛋白质的等电点。
第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS是一种阴离子表面活性剂，当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS时，形成了蛋白质－SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。
双向电泳实验蛋白质样品制备要点
双向电泳实验蛋白质样品制备要点双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是蛋白质组学研究中的一种常用技术。
这项技术利用蛋白质的两种特性，即等电点与相对分子量，通过等电聚焦（IEF）与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）这两项技术，将上千种不同的蛋白质分离，同时得到每种蛋白质的等电点、相对分子量和含量等信息。
这里将蛋白质样本分为两种，一种是血清样本，另一种是组织和细胞样本，分别介绍样本的制备方法。
一、血清样本的制备血清和其他生物液体中的蛋白质存在有大量的白蛋白和IgG而很难用双向电泳分离，因为这些蛋白质会掩盖凝胶上的其他蛋白，从而难以分辨血清蛋白量。
而且这些蛋白质的等电点和分子量分布范围广，会掩盖一些低分度的蛋白质，因此需要使用白蛋白和IgG清除试剂盒（使用IgG结合树脂作为清除试剂），具体步骤如下：①用移液管移取15μL人血清，放入带盖样本管中（为保证良好的树脂与样本的混合，推荐采用一次性15mL离心管）。
②在含有样本的管中加入750μL悬浮匀浆，取液前必须保证树脂匀浆为均匀的悬浮液。
③室温下在振荡混合器上混合匀浆/样本混合液3分钟，混合转速应确保混合液处于悬浮液状态。
④将微离心柱的底端折去，置于试剂盒中所配的离心管中。
⑤孵育完成时，确保树脂处于悬浮状态，然后小心地将树脂/样本混合物移入微离心柱的上层槽中。
⑥以大约6500×g离心5分钟。
⑦将含有树脂凝胶的上层槽弃去，收集滤出液。
⑧样品即可用于下一步的处理和储存备用。
二、组织和细胞样本的制备裂解不同种类的蛋白质样本应采取不同的处理和条件，裂解的效果取决于细胞破碎的方法、蛋白质浓缩和裂解的方法，去污剂的选择以及样本溶液的组成等。
1. 破碎细胞的方法细胞破碎过程中蛋白酶可能被释放出来，并引起蛋白质的分解，使双向电泳的最后结果复杂化。
因此，应直接将样本在强变性液裂解（8mol/L尿素、10%TCA或2%SDS）来抑制蛋白酶，并且在低温下制备样品。
双向电泳的原理
双向电泳的原理双向电泳是一种用于分离和分析蛋白质和核酸的技术。
它通过两个方向上的电场来实现分离，是一种高效的电泳技术。
双向电泳的原理涉及到凝胶电泳和两个方向上的电场，下面将详细介绍双向电泳的原理。
首先，双向电泳使用凝胶作为分离介质。
凝胶电泳是一种利用凝胶作为分离介质的电泳技术，通过凝胶孔隙的大小和形状来实现对分子的分离。
凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等。
在双向电泳中，凝胶可以根据需要调整孔隙大小和形状，以实现对不同大小和电荷的分子的分离。
其次，双向电泳使用两个方向上的电场。
在双向电泳中，样品在水平方向上进行电泳分离，然后在垂直方向上进行电泳分离。
这样可以使得样品在两个方向上都得到有效的分离，提高了分离效率和分辨率。
通过在两个方向上施加不同的电场，可以实现对样品的双向分离。
双向电泳的原理是基于分子的大小和电荷来实现分离。
在水平方向上，分子根据大小被分离，较小的分子移动得更快，较大的分子移动得更慢。
在垂直方向上，分子根据电荷被分离，带正电荷的分子向一个方向移动，带负电荷的分子向另一个方向移动。
通过这种方式，可以实现对复杂混合物中不同分子的高效分离。
双向电泳在生物学和生物化学领域有着广泛的应用。
它可以用于分离和鉴定复杂混合物中的蛋白质和核酸，对于研究细胞信号转导、蛋白质相互作用、基因表达调控等具有重要意义。
双向电泳的原理和技术不断得到改进和完善，使得其在生命科学研究中发挥着越来越重要的作用。
总之，双向电泳是一种基于凝胶电泳和双向电场的分离技术，利用分子的大小和电荷来实现高效的分离。
它在生物学和生物化学领域有着广泛的应用前景，为研究复杂混合物中的蛋白质和核酸提供了重要的技术支持。
随着技术的不断进步，双向电泳将会发挥越来越重要的作用，为生命科学研究带来新的突破和进展。
实验八 蛋白质双向电泳
蛋白质双向电泳【实验目的】1、学习和掌握蛋白质双向电泳的基本原理和方法。
2、了解双向电泳技术在蛋白质组学研究中的应用。
【实验原理】蛋白质的双向电泳的第一向为等电聚焦（Isoelectrofocusing, IEF），根据蛋白质的等电点（pI,isoelectric point）不同进行分离；第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按蛋白质亚基分子量大小(Mr, relative molecule)进行分离。
经过电荷和分子量两次分离后，可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。
等电聚焦(IEF, isoelectric focusing)是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳，其特点是在凝胶中加入一种两性电解质载体，从而使凝胶在电场中形成连续的pH梯度。
蛋白质是典型的两性电解质分子，它在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向电场的正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。
这种泳动只有在等于等电点的pH环境中才停止。
如果在一种pH梯度的环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，那么在电场作用下，不管这一群混杂的蛋白质分子原始分布如何，各蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度相对应的位置进行聚集经过一定时间后，不同的蛋白质组分便分割在不同的区域之中。
这个过程称作等电聚焦，蛋白质聚集的部位蛋白质所带电荷为零，测定此部位的pH值，即可知该蛋白质的等电点。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），主要用于测定蛋白质亚基分子量，SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
强还原剂（DTT，二硫苏糖醇）则能使半光氨酸残基之间的二硫键段裂。
在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，分子被解聚成它们的多肽链。
解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有电荷的差异。
双向电泳的概念和原理
双向电泳的概念和原理双向电泳是一种分子生物学技术，早期于1980年被开发出来，目的在于研究从蛋白质到核酸的分子形式。
它成功地用电场来完成蛋白质和核酸的迁移。
它可以生物学物质之间进行重要的调查和研究，它对生物分子的结构和功能提供了有用的信息。
双向电泳是一种电泳技术，它可以将分子物质从一个电极移动到另一个电极，将它们分开，从而可以生物学实验过程中的分子物质进行调查和研究。
它的基本原理是利用电场的力来引导电荷密度的分子经过一个单独的电极，从而将它们分开。
由于电泳法中的电场有一定的方向性和强度，因此，电荷密度不同的分子会由于电场的影响，在施加了强电场的电极之间移动。
双向电泳的核心部分是一个称为磁控电泳仪的仪器，它具有一对可旋转的电极，可以施加随时间变化的电场强度，它还具有调节电场强度的功能，以满足研究需求。
一般来说，双向电泳的原理是通过将悬浮液加入电极室中，再施加适量的电场，将电荷密度不同的分子分开，其中电荷密度较高的分子朝着电极移动，而电荷密度较低的分子则会朝着电极反向移动，以此进行分离。
另一方面，双向电泳中也可以使用不同类型的电极液体，如酸性液体和碱性液体。
当电极液体的酸碱性发生变化时，它会影响分子的移动方向，从而影响分子的分离效果。
双向电泳技术可以用于核酸和多肽的分离，也可以用于水溶液中的分子的分离。
双向电泳的应用非常广泛，它可以用于对各种生物分子的结构和功能关系的研究，为医学和生物科学的发展提供帮助。
双向电泳是一种新型技术，它具有高通量分析、低成本、易于操作等特点。
它可以在短时间内分析大量样品，而且相比传统的技术，它也更加准确、可靠。
双向电泳技术也正在广泛应用于基因组学、蛋白组学、工业过程中的分子序列定位、癌症诊断、药物毒性测定等方面。
因此，双向电泳技术的应用和神奇的效果在生物医学研究中已经被越来越广泛地认识和使用。
未来，双向电泳技术将会成为进行生物学研究所必不可少的工具，为研究生物分子的结构和功能提供新的方法。
双向电泳和质谱技术
双向电泳和质谱技术双向电泳和质谱技术是生物分析领域中常用的两种先进技术手段，它们在蛋白质分析、基因测序和疾病诊断等方面发挥着重要作用。
本文将重点介绍双向电泳和质谱技术的原理、应用及未来发展趋势。
1. 双向电泳技术双向电泳是一种利用电场在两个方向同时进行电泳分离的方法。
在垂直电泳的基础上，通过在水平方向引入一个交叉的电场，使得分子在两个方向上同时受到电场的作用，从而实现更加细致的分离和分析。
双向电泳技术可以有效地应对复杂样品的分析需求，提高分离效率和分辨率，广泛用于蛋白质组学和基因组学领域。
2. 质谱技术质谱技术是一种通过测定分子的质荷比来识别、定量和分析化合物的方法。
质谱技术主要包括质谱仪器、样品制备和数据分析三个方面。
通过质谱技术可以快速准确地鉴定生物样品中的蛋白质、代谢产物和小分子化合物，为生物医学研究和临床诊断提供重要帮助。
3. 双向电泳和质谱技术的应用双向电泳和质谱技术在生物学研究和医学诊断中有着广泛的应用。
在蛋白质组学研究中，双向电泳可以帮助科学家分析蛋白质的组成和结构，揭示蛋白质的功能与调控机制；而质谱技术则可以通过蛋白质质谱鉴定和定量，解析复杂生物系统中的蛋白质交互作用和信号传导通路。
在疾病诊断中，质谱技术可以通过检测患者生物标志物的质谱图谱，诊断疾病类型和病情进展，为个体化治疗提供指导。
4. 双向电泳和质谱技术的未来发展随着科学技术的不断进步，双向电泳和质谱技术也在不断优化和完善。
双向电泳技术不断提高分离效率和分辨率，以适应更加复杂样品的分析需求；质谱技术在仪器性能、数据处理和生物信息学分析方面得到了进一步提升，为生物学研究和医学诊断带来更多可能性。
未来，双向电泳和质谱技术将继续发展壮大，成为生命科学研究和临床医学应用的重要工具之一。
总结双向电泳和质谱技术作为生物分析领域的重要手段，为生命科学领域的研究和应用提供了有力支持。
通过深入了解双向电泳和质谱技术的原理和应用，我们可以更好地利用这两种技术手段，推动生物学研究的进步和医学诊断的发展。
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（13）凝胶的检测：当溴酚蓝染料迁移到胶的底部边缘即可结束电泳，取下胶放入染色盒中进行染色。
考马斯亮蓝染色和脱色：
染色液染色4 hr，也可染色过夜。加入适量脱色液，可多次更换直到脱色干净为止。
硝酸银染色
固定：25 mL的冰醋酸，100 mL甲醇，125 mL去离子水，60 min。
敏化：75 mL甲醇，0.5 g硫代硫酸钠（使用之前加入），17 g醋酸钠，165 mL去离子水，30 min。
清洗：用250 mL的去离子水清洗3次每次5 min。
（4）灌胶模具的安装：按仪器说明书装好灌胶模具，称之为“三明治”。
（5）凝胶浓度确定：根据预分离蛋白质相对分子质量范围确定需配置的凝胶浓度，主要指分离胶浓度。
凝胶浓度
分离范围（KD）
5％
36 ~ 200
7.5％
24 ~ 200
10 %
14 ~ 200
12.5 %
14 ~ 100
15 %
14 ~ 60
4.实验试剂
（1）溶涨液：
8 mol/L
Urea
2 %
CHAPS
20 mmol/L
DTT
0 .5 %或2 %
IPG buffer
少许
溴酚蓝
（2）平衡缓冲液储液：
50 mmol/L
Tris (pH 8.8)
6 mol/L
Urea
30 %
甘油
2 %
SDS
少许
溴酚蓝
（3）单体储液：
30 %（W/V）
丙烯酰胺
一般实验中多采用浓度10％或12.5 %的分离胶及浓度为5％的浓缩胶，制胶参照下表。
（6）灌注分离胶：按配比配制分离胶，配制完成后即可加入到制作好的制胶模具中，该过程需均匀注入，防止产生气泡，同时动作要迅速。灌注一定量的分离胶后迅速注入水覆盖在凝胶溶液上层，将“三明治”充满。
（7）分离胶凝结后会形成清晰的胶平面，此时可参照浓缩胶配方配制浓缩胶。
7.作业
（1）SDS - PAGE测定蛋白质的相对分子质量的原理是什么？
（2）蛋白质电泳过程中，蛋白质分子迁移受到电泳系统中哪些因素的影响？
（3）双向电泳中第一向等电聚焦中的电压条件设定基本原则是什么？
（4）在双向电泳中一向等电聚焦8 000 V电压达不到预定值，分析其主要原因。
第一向等电聚焦：等电聚焦（isoelectrofocusing，IEF）是在凝胶柱中加入一种称为两性电解质载体（ampholyte）的物质，从而使凝胶柱在电场中形成稳定、连续和线性pH梯度。以电泳观点看，蛋白质最主要的特点是它的带电行为，它们在不同的pH值环境中带不同数量的正电荷或负电荷，只有在某一pH时，蛋白质的净电荷为零，此pH即为该蛋白质的等电点（isoeletric point，PI）。在电场中，蛋白质分子在大于其等电点的pH环境中以阴离子形式向正极移动，在小于其等电点的pH环境中以阳离子形式向负极移动。如果在pH梯度
0.8 %（W/V）
甲叉双丙烯酰胺
（4）分离胶缓冲液：1.5 mol/L Tris（pH8.8）。
（5）浓缩胶缓冲液：1.0 mol/L Tris（pH6.8）。
（6）SDS电泳缓冲液：
25 mmol/L
Tris
192 mmol/L
甘氨酸
0.1 %
SDS
（7）染色液：
0.25％
考马斯亮蓝R-250
45％
利用扫描仪扫描得到凝胶图像。
导入凝胶图像（图1，2）。
凝胶图像选点（图3，4）。
设置landmark（图5）。
自动匹配（图6，7）。
分析数据（图8）。
6.注意事项
（1）根据预分离蛋白质的相对分子质量范围确定使用的凝胶的浓度。
（2）凝胶染色方法众多，其主要区别是灵敏度不同，需根据实际需要选择。通常考马斯亮蓝染色能检测到约含量为1 μg的蛋白质点，硝酸银染色法能检测到含量为ng级的蛋白质点。
单体丙烯酰胺和交联剂N，N－甲叉双丙烯酰胺，在催化剂存在的条件下，通过自由基引发的聚合交联形成聚丙烯酰胺凝胶，这提供了蛋白质泳动的三维空间凝胶网络。在SDS - PAGE电泳时相对分子质量小的蛋白质迁移速度快，相对分子质量大的蛋白质迁移速度慢，这样样品中的蛋白质可以分开形成蛋白质条带。
3.实验设备
垂直电泳仪，水平电泳仪，低温循环水浴，脱色摇床，扫描仪，ImageMaster 2D platinum version 5.0软件。电泳仪及其配套制胶设备、脱色摇床。
甲醇
45％
水
10％
冰乙酸
（8）脱色液：
45％
甲醇
45％
水
10％
冰乙酸
（9）10％SDS
（10）10％的过硫酸铵。
5.实验方法
（1）上样：一般采取加样品溶涨法，取大约30-60 μg的蛋白与溶胀液混合，总体积为250 μL。
（2）第一向等电聚焦：设置IPGphor仪器的运行参数。工作温度20 ℃，每胶条最大电流50 μA，以下为电压设定情况：
从广义上讲，双向电泳是将样品电泳后为了不同的目的在垂直方向再进行一次电泳的方法。目前蛋白质双向电泳常用的组合第一向为等电聚焦（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度），根据蛋白质等电点进行分离，第二向为SDS－PAGE，根据相对分子质量分离蛋白质。这样经过两次分离后，在凝胶上显示出的蛋白点可以获得蛋白质等电点和相对分子质量信息。双向电泳技术作为分离蛋白质的经典方法，目前得到了相当广泛的应用。在植物研究中，成功建立了拟南芥、水稻、玉米等植物种类的双向电泳图谱数据库，对推动植物蛋白质组研究起到重要作用。
（3）离子是等电聚焦过程中比较大的干扰因素，在实验过程中应该尽量避免引入离子。如蛋白质提取方法的确定，使用去离子水等。
（4）如果双向电泳分离的蛋白质点需进行质谱鉴定，那么需要注意选择对质谱没有干扰的染色方法。
（5）重复性是双向电泳需要注意的问题之一，所以在操作过程中应保持试剂、操作过程、实验条件的一致性，以确保双向电泳的重复性，从而获得可靠的可比性。
电压（V）
升压模式
电泳时间
电压（V）
升压模式
电泳时间
30
Step-n-hold
12 hr
1000
Step-n-hold
1 hr
200
Step-n-hold
1 hr
8000
GraHale Waihona Puke ient3 hr500
Step-n-hold
1 hr
（3）一向到二向胶条的平衡：
将胶条放入10 mL平衡缓冲液Ⅰ中（含1 % DTT）封口，在摇床上振荡15 min。将胶条取出放入10 mL平衡缓冲液Ⅱ中（含2.5 %碘乙酰胺）封口，在摇床上振荡15 min。用去离子水润洗胶条一秒钟，将胶条的边缘置于滤纸上几分钟，以去除多余的液体。
（8）灌注浓缩胶：倒掉覆盖液，注入浓缩胶后立即插入梳子。待浓缩胶凝结后可上样。
（9）将固定制胶模具与底座的凸轮取下，用其将上层电泳槽与凝胶模具连接。按照顺序一次固定好电泳设备。
（10）小心拔出梳子，将灌注好的制胶模具放入到盛有1Х SDS电泳液的电泳槽中，然后在制胶模具内注入1Х SDS电泳液。
（11）上样：将准备好的样品加入到上样孔中。
模块五蛋白质双向电泳
1.实验目的
掌握双向电泳能根据等电点和分子量分离蛋白质的原理，第一向等电聚焦电泳（IEF）和第二向聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）操作步骤，掌握凝胶染色方法，掌握凝胶分析软件的使用，了解对分离出的特异蛋白质的进一步分析方法，了解利用电泳技术分析生物大分子的方法。
2.实验原理
银染：0.625 g硝酸银，250 mL去离子水（使用之前配制）。
显色：6.25 g碳酸钠，100 μL的甲醛（使用之前加入），250 mL去离子水。
终止：5 %的醋酸。采集图像，分析结果。
（14）双向电泳图谱的分析：双向电泳图谱的分析的一般过程为获取凝胶图象；调整和校准凝胶图象；检定和定量蛋白点；注释蛋白点和像素；匹配凝胶图像；分析、整合数据并报告结果。该过程检验、分析蛋白质双向电泳结果，从而决定下一步的实验去向，应用软件为ImageMaster 2D Platinum version 5.0。
环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，不管混合蛋白质分子的原始分布如何，都将按照它们各自的等电点大小在pH梯度某一位置进行聚集，聚焦部位的蛋白质质点的净电荷为零，测定聚焦部位的pH即可知道该蛋白质的等电点。
第二向SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳：SDS是一种阴离子表面活性剂，当向蛋白质溶液中加入足够量的SDS时，形成了蛋白质－SDS复合物，这使得蛋白质从电荷和构象上都发生了改变。SDS使蛋白质分子的二硫键还原，使各种蛋白质－SDS复合物都带上相同密度的负电荷，而且它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的天然的电荷差别。在构象上，蛋白质－SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，这样的蛋白质－SDS复合物，在凝胶中的迁移就不再受蛋白质原来的电荷和形状的影响，而仅取决于相对分子质量的大小，从而使我们通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）来测定蛋白质的相对分子质量。