双向凝胶电泳和二维色谱技术检测大肠癌蛋白质谱的意义
蛋白质组学检测P4HB蛋白在结直肠癌组织中的表达及其意义
蛋白质组学检测P4HB蛋白在结直肠癌组织中的表达及其意义陈德波;洪成业;王青兰;洪志鹏;施凉潘;池畔【摘要】Objective To investigate the differential expression of protein between colorectal canc-er tissue(CRC)and normal adjacent tissues,and to explore its relationship with CRC characteristics. Methods Two dimensional polyacrylamide gel electrophoresis(2D-PAGE)was used to analyze the differ-ential expression proteins between 12 cases of colorectal cancer tissues and normal adjacent tissues,and Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry(MALDI-TOF-MS)and MS/MS were used to identify and analyze the markers of differential expression proteins. After being found out as a protein of interest,which was expressed at a higher level in the colorectal cancer tissues,the prolyl 4 hyd roxylase β subunit(P4HB)was validated using Western-blot. The expression of P4HB in colorectal cancer was detected by immunohistochemistry ,and the relationship between the expression ofP4HB and clinicopathologic features and prognosis was analyzed . Results 2D-PAGE analysis and MALDI-TOF-MS showed that the abundance expression of P4HB in CRC tissue was 2 .01 times higher than that in normal mucosa ( P < 0 .01) . The results of Western-blot showed that the expression level of P4HB in CRC tissues was significantly higher than that in normal mucosa tissues ( P < 0 .05 ) [(1 .36 ± 0 .54 ) vs (0 .74 ±0 .35 )] .The positive expression rate of P4HB protein was successivelydecreased by 43 .85% (82/187)in colorectal cancer tissues ,19 .35%(12/62)in adenoma and 12 .67% (19/150) in normal mucosa ,and difference had statistical significance ( P < 0 .001) .The expression of P4HB protein was significantly correlated with TNM stage (P = 0 .003) ,tumor differentiation (P = 0 .020)) and tumor size ( P < 0 .001) ,however significant associations were not observed between P4HB expression and patient's gender ( P = 0 .880) ,age (P = 0 .464) and tumor location ( P =0 .293) .The median survival time of patients with positive expression ofP4HB protein was 70 months ,and the median survival for patients of postoperative without P4HB expression was 104 months .Log-rank test showed that the survival rate of patients with positive expression of P4HB protein was not statistically significant than that with negative expression of P4HB( P = 0 .11) . Conclusion The expression of P4HB is up-regulated in CRC tissue ,and the positive expression of P4HB is related to later CRC stage ,poorly differentiated and larger tumor of colorectal cancer.%目的分析结直肠癌(CRC)组织和正常癌旁组织之间的差异表达蛋白质,探讨其与CRC疾病特征的关系. 方法应用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳法(2D-PAGE)分析12例配对CRC 组织和正常癌旁组织之间的差异表达蛋白,并运用激光解吸电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)和MS/MS法对差异表达的蛋白质标记点进行鉴定和分析.找出CRC组织中表达上调的蛋白脯氨酰-4-羟化酶(P4HB)β亚单位作为兴趣蛋白后,通过Western-blot验证,并运用免疫组织化学技术检测P4HB在CRC中的表达情况,分析其与CRC的临床病理特征及预后的关系. 结果 2D-PAGE分析和MALDI-TOF-MS鉴定结果显示,CRC组织中 P4HB表达丰度比正常黏膜组织上调2.01倍(P<0.01).Western-blot结果显示,CRC组织中P4HB的表达水平明显高于其配对的正常黏膜组织[(1.36 ± 0.54)vs(0.74 ± 0.35)](P<0.05).P4HB蛋白在CRC组织、腺瘤组织和正常黏膜组织中的表达阳性率依次减低,分别为43.85%(82/187),19.35%(12/62)及12.67%(19/150),三者间的差别均有统计学意义(P<0.001).P4HB蛋白表达与CRC的TNM分期(P=0.003)、肿瘤分化程度(P=0.020)、肿瘤大小(P<0.001)有关,而与患者的性别(P=0.880)、年龄(P=0.464)及肿瘤部位(P=0.293)无关.Log-rank检验结果显示,在CRC患者中,P4HB表达阳性组与阴性组的生存时间差别无统计学意义(P=0.110). 结论 CRC组织中P4HB表达上调,这与CRC更晚的分期、低分化及较大的肿瘤相关.【期刊名称】《福建医科大学学报》【年(卷),期】2017(051)006【总页数】6页(P358-362,380)【关键词】结直肠肿瘤;蛋白质组学;脯氨酸;羟基化;质谱分析法【作者】陈德波;洪成业;王青兰;洪志鹏;施凉潘;池畔【作者单位】福建医科大学附属泉州第一医院城东新院普外科,泉州 362000;福建医科大学附属泉州第一医院城东新院普外科,泉州 362000;福建医科大学附属泉州第一医院城东新院普外科,泉州 362000;福建医科大学附属泉州第一医院城东新院普外科,泉州 362000;福建医科大学附属泉州第一医院城东新院普外科,泉州362000;福建医科大学附属协和医院结直肠外科,福州350001【正文语种】中文【中图分类】R341;R735.35;R977.6结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是一种常见的严重危害人类健康的恶性肿瘤，全世界每年大约有100万的新发、50万的死亡病例[1]。
差异蛋白分析方法
差异蛋白分析方法差异蛋白分析是一种用于比较不同样本中蛋白质表达差异的方法。
在生物研究中，差异蛋白质的分析对于理解生物学过程的变化、疾病的发生和发展等具有重要意义。
下面将介绍几种常用的差异蛋白质分析方法。
1. 二维凝胶电泳（2-DE）：二维凝胶电泳是一种常用的分离和定量蛋白质的方法。
首先，通过等电聚焦将蛋白质在电泳液中按照等电点（pI）分离出不同pI的谱点，然后，使用SDS-PAGE将蛋白质按照分子量分离出不同大小的谱点。
最后，通过染色或质谱分析技术进行蛋白质的可视化和鉴定。
该方法可以同时分析数千种蛋白质，对于差异蛋白质的筛选具有高通量和分辨率高的优势。
2. 差异凝胶电泳（DIGE）：差异凝胶电泳是二维凝胶电泳的改进方法。
该方法利用荧光染料（如CyDye）对两组样本中的蛋白质进行荧光标记，然后将两组样本混合后共同进行电泳分离。
在同一个凝胶上，差异蛋白质的表达差异可以通过荧光信号强度的比较来确定。
相比于传统的二维凝胶电泳，DIGE方法的灵敏度更高，并且能够同时分析多个样本，适用于大规模样品分析。
3. 质谱分析：质谱分析是一种常用的蛋白质鉴定和定量方法。
主要有两种方法：基于质谱仪的定性分析和基于同位素标记的定量分析。
前者通过将蛋白质样品利用质谱仪进行断裂和离子化后，通过质谱图谱与数据库对比鉴定其潜在蛋白质；而后者则通过同位素标记技术（如TMT、iTRAQ等）对两组样品中的蛋白质进行标记，然后将标记样品混合后质谱分析，通过同位素峰的比较来定量差异蛋白质的表达水平。
4. 蛋白质芯片技术：蛋白质芯片是一种高通量和高灵敏度的蛋白质分析方法。
它利用固相支持介质上的已知蛋白质或蛋白质片段（如抗体、寡核苷酸）构建芯片，然后将样品中的蛋白质与芯片上的蛋白质发生特异性结合。
通过对芯片上信号的检测和分析，可以确定蛋白质的表达差异。
蛋白质芯片技术具有高通量、高灵敏度和高特异性等特点，可同时检测上千种蛋白质。
5. 高通量测序技术：高通量测序技术也可应用于差异蛋白质的分析。
双向凝胶电泳
双向凝胶电泳(2-DE)双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离,第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离,把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。
近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。
分离蛋白质组所有蛋白的两个关键参数是其分辨率和可重复性。
在目前情况下,双向凝胶电泳的一块胶板(16cm×20cm)可分出3~4千个,甚至1万个可检测的蛋白斑点,这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。
80年代开始采用固定化pH梯度胶,克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。
由于可以建立很窄的pH范围(如0.05U/cm),对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析,从而大大提高了分辨率。
此种胶条已有商品生产,因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。
这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。
第二向SDS-PAGE有垂直板电泳和水平超薄胶电泳两种做法,可分离10~100kD分子量的蛋白质。
其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白,最灵敏的还是用同位素标记,20ppm 的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。
用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化,再经过计算机处理,去除纵向和横向的曳尾以及背景底色,就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度,得到布满蛋白斑点的图像,即所谓“参考胶图谱”。
蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白,进行定性和定量的分析。
最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析,确定它们是已知还是未知蛋白。
现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析,也可先做4~5个循环的N末端微量测序,再做氨基酸组成分析;结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量,查对数据库中已知蛋白的数据,即可作出判断。
蛋白组学二维电泳
第一向等电聚焦与IPG胶条的剥离
聚焦程序设置
剥离IPG胶条
根据蛋白质的等电点设置等电聚焦程 序。
聚焦完成后，将IPG胶条从聚焦盘上 剥离下来。
开始聚焦
施加电压，使蛋白质在IPG胶条上分 离。
第二向SDS-PAGE电泳
转移蛋白质
将IPG胶条上的蛋白质转移 到SDS-PAGE凝胶上。
开始电泳
施加电压，使蛋白质在凝 胶上分离。
02
二维电泳技术原理
蛋白质的等电点与分子量
蛋白质的等电点
蛋白质是两性电解质，在特定的 pH环境中，蛋白质分子呈电中性 状态，这个pH值就称为该蛋白质 的等电点。
蛋白质的分子量
蛋白质的分子量是指其分子的大 小，通常以道尔顿为单位表示。
固相pH梯度技术
原理
通过在电泳过程中保持恒定的电流， 使蛋白质根据其等电点在电场中移动 ，从而实现分离。
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蛋白质翻译后修饰的研究
总结词
详细描述
二维电泳在蛋白质翻译后修饰的研究中具有 重要价值，通过分离和鉴定修饰后的蛋白质， 可以了解蛋白质的修饰类型和修饰位点。
二维电泳能够分离出各种翻译后修饰的蛋白 质，如磷酸化、泛素化、糖基化等。通过质 谱等技术对这些蛋白质进行鉴定和修饰位点 的确定，可以深入了解蛋白质的修饰类型、 修饰位点和功能调控。这些结果有助于揭示 生命过程的调控机制和疾病发生发展的机维 的基础，能够将复杂的蛋白质混合物 分离成多个条带。
双向凝胶电泳技术
原理
结合了等电聚焦和SDS-PAGE两种技术，首先根据蛋白质的等电点进行分离， 然后再根据分子量进行分离。
应用
双向凝胶电泳技术能够全面地展示细胞或组织中蛋白质的表达情况，为后续的 蛋白质组学研究提供基础。
双向电泳技术原理及其应用
¹双向电泳技术原理及其应用刘上峰 傅俊江 综述 李麓芸 审校(中南大学湘雅医学院人类生殖工程研究室,湖南长沙410078)摘要:双向电泳技术是蛋白质组研究的核心技术之一,本文对其基本原理、分辨率、可重复性、相关数据库、减法分析等作了介绍,并对其今后的发展方向作了展望。
关键词:双向电泳; 蛋白质组; 数据库;减法分析中图分类号:R318133 文献标识码:A 文章编号:100121773(2002)022*******随着后基因组时代的到来,蛋白质组学应运而生。
双向电泳(tw o 2dimensional electrophoresis,22D E)作为蛋白质组研究的三大关键核心技术之一(另二种是质谱技术和计算机图像数据处理与蛋白质组数据库即蛋白质组信息学),仍然是目前分析组份复杂蛋白质分辨率最高的工具,因此日益受到人们的广泛关注。
1 双向电泳的基本原理首先根据蛋白质等电点不同在pH 梯度胶中等电聚焦(isoelec tric f ocusing,IEF)将其分离,然后按照它们的分子量大小在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS 2PAG E)第二次分离。
根据第一向等电聚焦条件的不同,可将22DE 分为三种系统:第一种系统是在聚丙烯酰胺凝胶中进行,两性电解质在外加电场作用下形成梯度,该系统称为IS O 2D A L T 。
其主要缺点是pH 梯度不稳定,重复性差,上样量低,不利于不同实验室间进行图谱比较;如果第一向电泳使用丙烯酰胺和Immobilines 共聚,形成具有pH 梯度的凝胶,这种系统称为IPG 2D AL T 系统,该系统pH 梯度稳定,不依赖于外加电场,基本上克服了ISO 2D AL T 的主要缺点,无论是重复性和上样量均优于I SO 2D AL T;第三种是非平衡pH 梯度电泳(nonequilibrium pH gradient electrophoresis,NEPhG E),主要用于分离碱性蛋白质,电泳展开时间相对比较短。
蛋白质组学在消化系统肿瘤中的研究进展
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箜！！鲞箜！塑！坐』里运望！！Ｑ！！！ｂ笪；！！！！业：Ｙ！！：垫！丝！：！
・综述・
蛋白质组学在消化系统肿瘤中的研究进展
丁 莺 吕 宾
摘要：蛋白质组学是系统研究分子体系、亚细胞系、细胞、组织、器官乃至整体等生物体系内蛋白质组成 及其活动规律的科学。近些年来，它已成为全面分析蛋白质表达变化的有力研究工具，并被广泛应用到各 种疾病研究之中。此文旨在介绍蛋白质组学的相关研究技术及其在消化系统肿瘤中的应用。 关键词：蛋白质组学；消化系统肿瘤；生物标志物 蛋白质组学是一门以全面蛋白质性质研究（如 表达水平、转录后修饰、细胞内定位、相互作用等） 为摹础，在蛋白质整体水平对疾病机制、细胞模式、 功能联系等方面进行探索的科学。２００１年，国际人 类蛋白质组组织（ＨＵＰＯ）成立，提出了人类蛋白质 组计划（ＨＰＰ），使其在人类疾病方面的应用迅速
Ａ、
Ｅｂｅｒｔ等［６］用单克隆上皮特异性抗体（ＢｅｒＥＰ４ 直接针对上皮细胞黏附分子）与磁珠相连来分别纯 化１０例胃癌患者的原发肿瘤与正常组织，获得１９１ 个差异表达的蛋白质。经ＭＳ鉴定，组织蛋白酶８
（ｅａｔｈｅｐｓｉｎ
Ｇ）在６０％的胃癌患者中表达上调。
Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证实，ｃａｔｈｅｐｓｉｎｌ３以活性形式在胃癌细
突变位点。
蛋白质组学作为肿瘤研究的新平台，通过从整 体水平研究蛋白质间的网络调控，对食管癌、胃癌、 肝癌、胰腺癌、结直肠癌等消化系统肿瘤的早期诊 断，寻找新标志物，治疗以及药物开发的新靶点等 方面具有重要意义。 １蛋白质组学的研究技术
１．１
一些新的技术不断涌现也更加丰富和完善了 传统技术。例如，在蛋白质分离方面激光捕获显微 切割技术和多维强离子交换一阵列式毛细管高效液 相色谱技术［１］被运用到其中。在蛋白质鉴定方面还
双向电泳
双向电泳的应用及研究进展摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。
本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。
同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。
关键词: 双向电泳，应用，前景1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。
双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。
双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。
就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。
1.2双向电泳基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。
双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。
第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。
在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。
双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。
因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
蛋白组学检测方法
蛋白组学检测方法蛋白组学是一种利用高通量技术对蛋白质表达与功能进行系统研究的科学领域。
蛋白组学检测方法包括蛋白质分离、蛋白质定性和定量分析等多个环节。
下面将分别介绍蛋白组学检测的主要方法。
第一部分：蛋白质分离蛋白质分离是蛋白组学研究的基础，常用的分离方法主要包括凝胶电泳、质谱分离和亲和纯化等。
凝胶电泳是最常用的蛋白质分离技术之一，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（）和二维凝胶电泳（2-DE）。
主要用于分离蛋白质样品，可以根据分子量确定蛋白质的大小。
2-DE则通过将蛋白质首先按等电点（pI）进行分离，然后再按分子量进行分离，可以获得更高分辨率的蛋白质图谱。
质谱分离是另一种常用的蛋白质分离技术，主要包括液相色谱-质谱联用分析（LC-MS）和基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-TOF-MS）。
LC-MS通过将蛋白质样品在色谱柱中进行分离，然后通过质谱进行检测和分析。
MALDI-TOF-MS则通过将蛋白质样品与基质混合，然后通过激光解吸电离质谱进行检测和分析。
亲和纯化是利用蛋白质与特定结合分子之间的相互作用进行分离的方法。
常见的亲和纯化方法包括亲和层析和亲和捕获技术。
亲和层析通过将样品溶液通过含有特定结合分子的固定相进行分离，从而选择性地纯化目标蛋白质。
亲和捕获技术则是利用具有高特异性的抗体或配体捕获目标蛋白质。
第二部分：蛋白质定性和定量分析蛋白质定性和定量分析是蛋白组学研究中的重要环节，常用的方法主要包括质谱定性和定量分析、蛋白质芯片技术和蛋白质酶解及肽段识别等。
质谱定性和定量分析是蛋白组学中最常用的方法之一、定性分析通过分析蛋白质样品中的氨基酸序列、翻译后修饰位点等信息来鉴定目标蛋白质。
质谱定性通常与蛋白质分离技术相结合，如液相色谱-质谱联用分析。
定量分析则通过测定蛋白质样品中特定蛋白的丰度来比较不同样品之间的差异。
蛋白质芯片技术是一种高通量的蛋白质定量和功能分析方法。
它通过将大量抗体或配体固定在玻片表面，并与蛋白质样品进行特异性结合，来实现对目标蛋白质的检测和分析。
蛋白质组学研究内容和相关技术
一、什么是蛋白质组？与基因组差别？蛋白质组学的主要研究内容及技术体系？答：蛋白质组：Proteome，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。
蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识，这个概念最早是由Marc Wilkins 在1994年提出的。
基因组：Genome，一个细胞或者生物体所携带的一套完整的单倍体序列，包括全套基因和间隔序列。
可是基因组测序的结果发现基因编码序列只占整个基因组序列的很小一部分。
因此，基因组应该指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。
二者区别：蛋白质组研究和基因组研究依然是形影相随的两个重要领域，它们之间既为互相补充又能互相帮助，但二者之间仍有一些区别：蛋白质组：多样性，无限性，动态性，空间性，互相作用。
基因组：同一性，有限性，静态性，周期性，孤立性。
蛋白质组学的主要研究内容：（1）表达蛋白质组学(expressionproteomics)：是对蛋白质组表达模式的研究，即检测细胞、组织中的蛋白质，建立蛋白质定量表达图谱，或扫描表达序列(EST)图谱。
在整个蛋白质组水平上提供了研究细胞通路、疾病、药物相互作用和一些生物刺激引起的功能紊乱的可能性，对寻找疾病诊断标志、筛选药物靶点、毒理学研究等具有重要作用。
（2）细胞图谱蛋白质组学(cellmapproteomocis)：是对蛋白质组功能模式的研究，即确定蛋白质在亚细胞结构中的位置和鉴定蛋白质复合物组成等，便于研究蛋白质在细胞内的行为、运输及蛋白质相互作用网络关系，它对确定蛋白质功能和疾病诊疗的靶位极有价值。
蛋白质组学技术体系：（1）蛋白质组学分离技术，在整个蛋白质组学的研究中，分离技术是最基础的部分。
蛋白质组学研究介绍结合双向电泳
蛋白质组学研究的主要内容和方法
蛋白质表达分析
研究不同生理或病理条件下蛋白质的表 达水平变化，揭示蛋白质的表达模式和
规律。
蛋白质相互作用研究
利用酵母双杂交、免疫共沉淀等技术 手段，研究蛋白质之的相互作用和
复合物的形成。
蛋白质功能研究
通过基因敲除、基因敲减、定点突变 等技术手段，研究蛋白质的功能和作 用机制。
智能化
结合人工智能和机器学习技术，实现双向电 泳的智能化分析，自动识别和鉴定蛋白质， 提高数据分析的准确性和可靠性。
拓展双向电泳技术的应用领域
临床诊断
01
将双向电泳技术应用于临床诊断，通过对生物标志物的检测和
分析，辅助医生进行疾病诊断和治疗方案的制定。
药物研发
02
利用双向电泳技术筛选和鉴定药物作用靶点，为新药研发提供
蛋白质芯片技术
高通量、快速、简便，但灵敏度和分辨率相对较低，且覆盖的蛋白质数量有限。
双向电泳与蛋白质免疫印迹技术的比较
双向电泳
可以对全蛋白质组进行分离和定性，分 辨率高。
VS
蛋白质免疫印迹技术
可以对特定蛋白质进行检测和定量，灵敏 度高，但只能针对已知的蛋白质进行检测 。
05
双向电泳技术的发展前景 和展望
蛋白质的纯化
通过双向电泳，可以去除样品中的杂 质，提高蛋白质的纯度，从而获得更 准确的鉴定结果。
蛋白质的表达和鉴定
蛋白质表达分析
通过比较不同生理状态或不同组织中 蛋白质的表达模式，可以研究蛋白质 的表达水平，进而了解其在生命活动 中的作用。
蛋白质鉴定
通过与已知蛋白质的数据库进行比对， 可以鉴定出双向电泳图谱中的蛋白质， 为后续的功能研究提供依据。
双向电泳和质谱技术
双向电泳和质谱技术双向电泳和质谱技术是两种广泛应用于生物化学和生物物理学领域的分析方法。
它们通过不同的原理和技术手段，可以对生物分子进行定性和定量的分析。
本文将介绍双向电泳和质谱技术的基本原理、应用领域以及发展前景。
一、双向电泳双向电泳是一种常用的蛋白质分析方法，它通过电泳将蛋白质在两个正交方向上进行分离，从而实现高分辨率的分析。
其基本原理是利用蛋白质在电场中的电荷、大小和形状等特性，通过在两个方向上施加电场，不断地移动蛋白质分子，使其在凝胶中分散开来，最终实现完全的分离。
双向电泳技术在生物化学和生物物理学领域中有着广泛的应用。
它可以用于研究蛋白质的组成和结构，探索蛋白质相互作用的机制，寻找新的蛋白质标记和药物靶点等。
双向电泳技术的主要优点是分离效果好、分析速度快、灵敏度高。
然而，该技术也存在一些局限性，比如在分离过程中可能出现混叠现象，对样品要求较高等。
二、质谱技术质谱技术是一种以测定生物样品中质量与荷电比（m/z）为基础的分析方法，它可以对样品中的化合物进行分析和鉴定。
质谱技术的基本原理是将样品中的化合物通过电离技术转化为带电离子，然后根据离子在磁场中受到的作用力大小，测量离子的质量和荷电比，从而确定分子的质量。
根据质谱仪的不同类型和检测模式，质谱技术可以分为质谱仪、质谱成像、质谱图谱等多种形式。
质谱技术在生物化学和生物物理学领域中扮演着重要的角色。
它可以用于寻找新的生物标记物、研究代谢产品的组成、药物的代谢途径以及蛋白质的翻译后修饰等。
同时，质谱技术还可以与其他分析方法进行联用，如液相色谱联用质谱、气相色谱联用质谱等，以增强分析的灵敏度和分辨率。
三、双向电泳与质谱技术的结合双向电泳和质谱技术在生物科学研究中常常被结合使用，以实现更全面、深入的分析。
双向电泳可以将蛋白质分子进行高效的分离，而质谱技术可以对分离得到的蛋白质进行质量测定和结构鉴定。
通过双向电泳与质谱技术的结合，可以在一定程度上弥补两种方法的局限性，提高分析结果的准确性和可靠性。
蛋白质组学研究中双向电泳技术的应用
胶中或膜上切取这些 目标蛋 白质作鉴定。现在绝 大多数蛋白质的鉴定是通过质谱分析来完成 的。
丙烯 酰胺 共 价聚 合而 成 ＩＧ胶 条 ，其 优势 主要 Ｐ 有 ［ ：ｐ ６ Ｈ梯度稳定 ，聚焦准确 ，精度高 ，梯度分 ］ 辨率可 达 ００ １Ｈ ． ｐ ；无 阴极漂移及碱性蛋 白丢失 ０
在主要和通用的一向等电聚焦方式［ 。 引
２ ３ 第二 向 电泳 ．
寻找和预分离未知蛋白及其翻译后修饰形式 （ ￣ ｔｓ ｘｔ
—
ｔｍｌ—ｔｎｌｍ ｄ ｅ ｒｓ ｌ ）的方 法 ｏ ｒ ａ ｉ ａｙ ｏｉ ｄｆｍ ，ｅ＇ ａ ｏ ｌ ｉ ｆ ｏ Ｍｓ
第二向是十二烷基磺酸钠 一聚丙烯酰胺凝胶
泳 ，进 行染 色 。 目前 实 验 室 最 常用 的显 色 方 法 是
第一向是等点聚焦电泳 ，根据一 向等 电聚焦
方 式 的不 同 ，可 将 双 向 电泳 分 为 ３种 系统 ： （ ） １
ＩＯ—Ｄ Ｌ （ｓ Ｓ ＡＴ ｉ ｏ—ｅ ｃ ｉ ｆ ｕｉ ｆｌ ｅ 锄 ・ ｌ ｔｃ ｏ ｓ ｇ ｌｗ ｄ ｂ ｅ ｒ ｃ ｎ ｏｏ ｔ ｎ ｉ ｒｓｅｔｍｏ ｕａｎｓ ｘｒ ｓｄ ａ ｏｓ 系 ｉ ｗｔ ｅｐｃｔ ｌ ｌ ａｓｅｐｅ ｅｉ ｄｌ ｎ ） ｏ ｈ ｏ ｅ ｎ ｃ ｓ ｎ ｔ
（ｎ ｎ — ｅ ｕ ｉｒ ｍ ｐ ｇａｉ ｔ ｅ ｃ ｏｈｒｓ ， ｏ ｑ ｉｂｉ ｌ ｕ Ｈ ｒ ｅ ｌ ｔｐｏ ｉ ｄｎ ｅｒ ｅｓ
Ｎ Ｐ Ｇ ）系 统 ，主 要 用 于 分 离 碱 性 蛋 白质 ，但 ＥＨ Ｅ 如果 聚焦 达到 平 衡 状 态 ，碱 性 蛋 白会 离 开 凝胶 基
概 念 出现之前 ，免 疫印迹 法就 已得 到广 泛 的应 用 。
方法与生物质谱技术 的不断进步，以及两者有效 的结合 ，使研究人员能够更加有效地分离蛋 白质
双向电泳的应用和原理
双向电泳的应用和原理应用双向电泳是一种常用的生物分析技术，常用于蛋白质分析和DNA分析等领域。
以下是双向电泳的一些主要应用：1.蛋白质分析：双向电泳被广泛用于蛋白质分析。
通过将样品中的蛋白质分离成不同的带，可以进一步研究蛋白质的结构和功能。
2.DNA测序：双向电泳也可以用于DNA测序。
通过将DNA片段分离成不同的带，可以确定DNA的序列。
3.肿瘤标记物检测：双向电泳可以用于检测肿瘤标记物，从而帮助早期诊断和治疗。
4.药物筛选：双向电泳可以用于筛选新药物的研究。
通过比较不同试验条件下的蛋白质表达，可以确定新药物的作用机制。
5.疾病研究：双向电泳可以用于研究不同疾病的发生机制和治疗靶点。
通过比较患者样本和正常对照的蛋白质表达，可以发现与疾病相关的蛋白质变化。
原理双向电泳是将电泳技术应用于两个方向的分离，以实现更高分辨率的分析。
以下是双向电泳的基本原理：1.等位点电泳：双向电泳始于等位点电泳（IEF），即根据蛋白质的等电点将其分离成不同的带。
蛋白质在直流电场下会在电极之间移动，直到达到与环境中的离子浓度相等的位置。
这样，蛋白质就能被固定在凝胶中的特定位置。
2.SDS-PAGE：随后，使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将蛋白质按照其分子量进一步分离。
在SDS-PAGE中，SDS（十二烷基硫酸钠）会使蛋白质带负电荷，从而使蛋白质按照其分子量在电场下移动。
3.双向电泳：在双向电泳中，IEF和SDS-PAGE两个步骤结合在一起。
首先，将样品在一维的IEF凝胶中进行等位点电泳分离。
然后，将等位点电泳的凝胶旋转90度，将其置于SDS-PAGE凝胶上。
这样，样品就可以在两个方向上进行电泳分离。
4.分析结果：双向电泳结束后，可以通过染色或质谱分析等方法来可视化和分析分离的蛋白质带。
比较不同样品的带的强度和位置可以得出有关蛋白质表达和组成的信息。
双向电泳的原理和应用使其成为生物学和生物医学研究中不可或缺的工具。
蛋白组学检测方法
蛋白组学检测方法引言：蛋白组学是研究生物体内所有蛋白质的组成、结构、功能及其相互作用的学科，被广泛应用于生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域。
蛋白组学检测方法是实现蛋白质组学研究的关键，本文将介绍几种常用的蛋白组学检测方法。
一、二维凝胶电泳（2D-PAGE）二维凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离方法，能够将复杂的蛋白质混合物按照等电点和分子质量的不同进行分离。
首先，蛋白质样品经过等电聚焦分离，根据蛋白质的等电点将其分离到凝胶的不同位置；然后，将凝胶水平电泳分离，根据蛋白质的分子质量将其进一步分离。
最后，通过染色或质谱分析等方法检测和鉴定分离出的蛋白质。
二、质谱分析质谱分析是一种基于蛋白质质量特性进行分析的方法。
常用的质谱分析方法有质谱仪和质谱成像技术。
质谱仪能够测量蛋白质的分子质量和结构信息，通过与数据库比对可以鉴定蛋白质的身份。
质谱成像技术则能够在组织或细胞水平上分析蛋白质分布情况，为研究生物体内蛋白质的空间分布提供了重要手段。
三、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是利用高通量平台对蛋白质进行检测和分析的方法。
蛋白质芯片上固定了大量的蛋白质，可以同时检测多个蛋白质样品。
蛋白质芯片技术具有高灵敏度、高通量和高效性的优点，被广泛应用于蛋白质相互作用、蛋白质表达水平和信号转导等研究领域。
四、蛋白质亲和层析蛋白质亲和层析是一种基于蛋白质与配体的特异性结合进行分离的方法。
通过将蛋白质样品与具有高亲和性的配体固定在层析柱上，可以选择性地捕获目标蛋白质。
蛋白质亲和层析方法广泛应用于蛋白质纯化和分析，如抗体亲和层析、金属离子亲和层析等。
五、蛋白质结构预测和模拟蛋白质结构预测和模拟是通过计算方法推测蛋白质的三维结构。
这些方法基于蛋白质序列和结构之间的关系，通过模拟和预测蛋白质的二级结构、三级结构和功能域等特征，为蛋白质功能和折叠等方面的研究提供了重要工具。
结论：蛋白组学检测方法是实现蛋白质组学研究的关键，本文介绍了几种常用的蛋白组学检测方法，包括二维凝胶电泳、质谱分析、蛋白质芯片技术、蛋白质亲和层析和蛋白质结构预测和模拟。
双向电泳的原理和应用
双向电泳的原理和应用1. 原理双向电泳（Bidirectional Electrophoresis）是一种常用的电泳技术，可以有效分离和分析复杂样品中的蛋白质和核酸。
其原理是基于物质在电场中的带电性质和不同分子的迁移速度差异。
双向电泳采用两个电场分别作用于样品，一个在水平方向，另一个在垂直方向。
这两个电场的方向相反，使得样品分子在两个方向上均受到电场力的作用。
在水平方向上，电场力使得样品分子在凝胶中做两个方向的扩散；在垂直方向上，电荷的作用力使得样品分子沿凝胶向电极方向迁移。
通过双向电泳，样品分子在水平和垂直方向上的运动会发生偏移，从而实现蛋白质和核酸的分离。
根据分子的大小、形状和电荷等特性，不同的分子在双向电泳中会有不同的迁移速度，从而形成不同的带状图案。
这些图案可以被进一步分析和检测。
2. 应用双向电泳在生物科学研究和生物医学应用中具有广泛的应用，主要体现在以下几个方面：2.1 蛋白质分析双向电泳是蛋白质分析的一种重要方法。
通过双向电泳，可以将混合蛋白质样品进行分离，从而得到各自独立的蛋白质条带。
根据蛋白质条带的位置和数量可以推测样品中不同蛋白质的类型和相对含量。
这对于研究蛋白质的功能和相互作用非常有帮助。
2.2 新药开发双向电泳可以用于筛选和分析药物作用的靶向蛋白质。
通过比较药物处理前后的双向电泳图案，可以确定哪些蛋白质与药物有关。
这对于新药的开发和评估起到了重要的作用。
2.3 基因分析双向电泳也可以用于基因分析。
通过将DNA样品置于双向电泳中，可以将DNA的不同片段分离和检测。
这对于研究基因的结构、功能和突变等起到了关键作用。
2.4 生物标记物检测在临床诊断中，双向电泳可以用于检测特定蛋白质标记物，如肿瘤标志物。
通过分析血液或组织中的蛋白质条带，可以辅助诊断和评估疾病的发展和治疗效果。
结论双向电泳以其独特的分离原理和广泛的应用领域，在生物科学研究和生物医学领域发挥着越来越重要的作用。
它在蛋白质分析、新药开发、基因分析和生物标记物检测等方面具有广阔的应用前景。
利用二维色谱与质谱联用技术检测大肠癌蛋白质谱差异表达
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应用每个蛋白质的谱图数来评价其丰度。对于
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蛋白检测篇-双向凝胶电泳分享
编号：1-6主题：双向凝胶电泳概述：双向凝胶电泳技术结合了等电聚焦技术（根据蛋白质等电点进行分离）以及SDS －聚丙烯酰胺凝胶电泳技术（根据蛋白质的大小进行分离）。
这两项技术结合形成的二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。
目的：凝胶中蛋白的检测、图像采集和分析、蛋白鉴定、分离蛋白质组所有蛋白。
原理：1、根据蛋白质的等电点（第一向）和分子量（第二向）的不同进行分离。
蛋白质是两性分子，在不同的pH环境中可以带正电荷、负电荷或不带电荷。
对每个蛋白质来说都有一个特定的pH，此时蛋白质的静电荷为零，此pH值即该蛋白质的等电点(pI)。
将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，它会向与其所带电荷相反的电极方向移动。
在移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并且随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。
当蛋白质迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。
聚焦是一个与pH相关的平衡过程：蛋白质以不同的速率靠近并最终停留在它们各自的pI值；在等电聚焦过程中，蛋白质可以从各个方向移动到它的恒定位点。
双向电泳的第二向是将IPG胶条中经过第一向分离的蛋白转移到第二向SDS．PAGE凝胶上，根据蛋白相对分子质量或分子量(MW)大小与第一相垂直的分离。
蛋白质与十二烷基硫酸钠(SDS)结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，由于SDS是一种强阴离子去垢剂，所带的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，能消除不同分子之间原有的电荷差异，从而使得凝胶中电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质分子的质量大小，其迁移率与分子量的对数呈线性关系。
步骤：１.样品制备２.第一向分离等电聚焦３.第二向分离聚丙烯酰胺凝胶电泳３.修饰和加工，如用32P标记可以研究磷酸化蛋白的变化流程图：营养知识饮食原则：三高三低（高蛋白/高纤维/高维生素，低糖/低脂肪/低盐）人体六大营养元素脂肪/蛋白质/碳水化合物维生素/矿物质/水比例：脂肪：蛋白质：碳水化合物=1：2：3一、脂肪的作用保护内脏/储存能量/维持神经系统的正常功能/防寒保暖/帮助荷尔蒙的产生/能量的来源之一/支持组织的生长/保护和修复注：脂肪是能量储存的最有效的方式，一克脂肪含热量9.3千卡。
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双向凝胶电泳和二维色谱技术检测大肠癌蛋白质谱的意义李峰师庆红张晓静何成彦赵丽纯1郭宏华（吉林大学中日联谊医院，吉林长春130033）〔摘要〕目的利用双向凝胶电泳和二维色谱技术分析Dukes B 期大肠癌肿瘤与癌旁组织蛋白质差异，为大肠癌的早期诊断、生物学治疗寻找新的靶点。
方法①双向凝胶电泳技术和质谱技术鉴定大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组；②二维色谱技术和质谱技术鉴定大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组。
结果在大肠癌肿瘤组织与癌旁组织差异蛋白中两种技术路线有13个蛋白得到一致的鉴定结果，其中在肿瘤组织中表达上调的有7个，表达下调的有6个。
结论两种技术路线共同鉴定出的差异蛋白质是有意义的，对研究大肠癌的发病、转移及复发机制提供了依据和方向。
〔关键词〕双向凝胶电泳；二维色谱技术；质谱；大肠癌；蛋白质组学〔中图分类号〕R735〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2012）03-0497-03；doi ：10.3969/j.issn.1005-9202.2012.03.026基金项目：吉林省科技厅资助项目（No.20100742，200705387，20050702-4，20090461）1吉林大学药学院通讯作者：郭宏华（1964-），女，副教授，副主任医师，硕士生导师，主要从事消化道肿瘤的发病机制及治疗研究。
第一作者：李峰（1979-），女，在读硕士，主要从事肿瘤分子生物学研究。
大肠癌（colon cancer ）是一种常见的消化道恶性肿瘤，死亡率在世界范围内居各种肿瘤的第三位，在西方居第二位，并且发病率和死亡率均有逐年上升的趋势〔1，2〕。
大肠癌的发生和发展受到基因和环境等多种因素的影响，其病理机制复杂，从单一的基因突变和分子通道的变化难以全面理解大肠癌的发生机制。
蛋白质组学是近年来发展起来的新兴学科，已经广泛应用于肿瘤研究的诸多方面。
本文拟采用双向凝胶电泳和二维色谱技术分析Dukes B 期大肠癌肿瘤与癌旁组织蛋白质的差异性，为大肠癌的早期诊断、生物学治疗寻找新的靶点。
1材料与方法1.1组织标本收集吉林大学中日联谊医院手术治疗的大肠癌患者18例，年龄49 78岁，其中男13人，女5人。
在手术中获得的癌组织均是新鲜标本。
所获得的癌旁正常组织均距离癌边缘10cm 之外、切缘正常组织，并且所取的正常组织标本均是在癌组织上端。
标本离体后立即取材，生理盐水冲洗，放入液氮冷冻，－80ħ保存。
病人术前未接受任何治疗。
取部分组织标本进行石蜡包埋、切片、HE 常规染色，病理学检查证实组织类型，均是Dukes B 腺癌。
1.2主要试剂载体两性电解质（Bio-Lyte 3-10）、IPG 预制胶条（pH3 10，17cm ；pH5 8，17cm ）、矿物油、碘代乙酰胺（IAA ）购自Bio-Rad 公司（Hercules ，CA ，USA ）。
尿素、硫脲、精胺、蔗糖、甘油、三羟甲基氨基甲烷、3-〔（3-胆酰胺丙基）-二乙胺〕-丙磺酸（CHAPS ）、丙烯酰胺、N ，N ，N'，N'-四甲基乙二胺（TMED ）、甘氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS ）、溴酚蓝、考马斯亮蓝G-250、苯甲基磺酰氟（PMSF ）购于Sigma 公司（St Louis ，MO ，USA ）。
低熔点琼脂糖、甲叉双丙烯酰胺、DTT 、TPCK 修饰的测序级胰酶购自Promega 公司。
过硫酸铵、碳酸氢氨、硝酸银、甲醛、乙醇、硫代硫酸钠、冰乙酸为国产分析纯。
蛋白质定量试剂盒（RC DC Protein Assay Kit ）购于Bio-Rad 公司。
1.3方法1.3.1双向凝胶电泳技术和质谱技术鉴定大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组利用裂解缓冲液制备肿瘤组织与癌旁组织总蛋白，然后分别取肿瘤组织与癌旁组织总蛋白各1mg ，分别加入水化上样缓冲液至终体积300μl 。
经pH 3 10等电聚焦分离和SDS-PAGE 电泳分离后，考马斯亮蓝染色，利用PDQUEST 软件对电泳图像进行分析、剪切，建立匹配组并进行归一化处理。
最后建立分析组，比较匹配点之间光吸收度的差异，获得肿瘤组织与癌旁组织总蛋白质的差异蛋白表达谱。
1.3.2二维色谱技术和质谱技术鉴定大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组首先利用裂解缓冲液制备肿瘤组织总蛋白，然后分别用25mmol /L NH 4HCO 3稀释，使尿素浓度低于2mmol /L 。
经酶解后，将酶解产物进行二维液相色谱与质谱联用分析，得到肿瘤组织酶解混合物的多肽质谱数据。
2结果2.1双向凝胶电泳技术和质谱技术2.1.1肿瘤组织与癌旁组织的差异蛋白表达谱肿瘤组可分离（614ʃ36）个蛋白点，癌旁组可分离（682ʃ24）个蛋白点，匹配率为83.3%。
其中肿瘤组织中21个蛋白质点的表达量有显著差异，其中有14个表达上调，有7个表达下调。
2.1.221个差异蛋白质点的质谱鉴定直接切取21个差异蛋白质点，进行胶内酶切和肽段提取。
然后在MALDI-TOF-TOF （DE STR ，Applied Bio systems ）质谱仪上进行肽质量指纹分析。
将得到的数据用Mascot 检索引擎在Swiss Prot 数据库中进行检索，对21个蛋白质点进行鉴定。
2.2二维色谱技术和质谱技术2.2.1肿瘤组织总蛋白酶解混合物二维色谱与质谱联用分析共鉴定29825个多肽序列，得到860个蛋白质的鉴定数据。
2.2.2癌旁组织总蛋白的二维色谱与质谱联用分析共鉴定了40388个多肽序列，共得到549个蛋白质的鉴定数据。
2.2.3肿瘤与癌旁组织差异蛋白质的质谱分析应用实验中每个蛋白的图谱评价其丰度。
对于在不同样品中丰度发生变化的蛋白，其谱图数变化必须满足以下原则：①两个样品中谱图数的比值≥1；②两个样品中谱图数的差值≥72（平均每次实验差值为24）。
为评价上述方法用于鉴别蛋白丰度变化的假阳性率，每个样品进行3次实验，然后比较结果，相应假阳性率为2.13%。
将肿瘤与癌旁组织的蛋白质组分析的结果进行比对，依据上述评价原则及标准得到44个蛋白质具有显著差异，其中肿瘤组织中21个蛋白表达上调，23个蛋白表达下调。
2.3双向凝胶电泳和二维色谱技术的对比在大肠癌肿瘤组织与癌旁组织差异蛋白中有13个蛋白得到一致的鉴定结果，其中在肿瘤组织中表达上调的蛋白有7个，表达下调的蛋白有6个。
见表1。
表1肿瘤组织表达上调（A1 A7）和下调（B1 B6）的蛋白质鉴定结果蛋白点蛋白质ID 蛋白质名称分子量（kD ）等电点Mascot 评分匹配率（%）匹配的多肽数A1Q670S4血红蛋白Lepore-Baltimore （片段）11.4591 6.21126678A2P1080960kD 线粒体热休克蛋白61.0546 5.59855922A3P25705线粒体ATP 合酶59.75069.48925318A4P05783角蛋白，I 型cytoskeletal 1848.0578 5.21654215A5P30101蛋白质disulfide-isomerase A356.7824 5.95823616A6P06733烯醇化酶47.16897.161328513A7P06748核磷蛋白亚型132.575 4.49714510B1O15061Desmuslin 亚型1172.7675 4.9678172.7675 4.96B2Q01995Transgelin 22.61099.2810522.61099.28B3P17661结蛋白53.5357 5.078653.5357 5.07B4P51911钙调理蛋白133.17049.4213233.17049.42B5P04792热休克蛋白β22.7825 5.977122.7825 5.97B6P18206纽蛋白亚型2123.79935.3986123.79935.393讨论双向凝胶电泳和二维色谱一直是目前蛋白质组学的两大重要分离技术，双向凝胶电泳作为传统的技术手段由于其价格较低、易于操作等特性，一直被大多数实验室所采用〔3，4〕。
但是一些特殊的蛋白质，如：强碱、强酸，过大、过小以及膜蛋白质，现在还不能用双向凝胶电泳方法进行分离，所以需要发展其他·894·中国老年学杂志2012年2月第32卷相关技术。
而随着色谱技术的迅猛发展，发展可替代或补充双向凝胶电泳的新方法成为蛋白质组学研究技术最主要的目标。
由于二维色谱质谱联用技术具有分析范围广、分析能力强、定性分析结果可靠、检测限低、分析时间快、自动化程度高等特点，所以液质联用技术成为分离、鉴定复杂混合物最有效的手段〔5，6〕。
二维色谱（2D-LC ）、二维毛细管电泳（2D-CE ）、液相色谱－毛细管电泳（LC-CE ）等新型分离技术都有补充和取代双向凝胶电泳之势。
本实验利用双向凝胶电泳和二维色谱两大分离技术对Dukes B 期大肠癌肿瘤组织与癌旁组织进行鉴定分析，两种方法所得到的结果有不一致的地方，主要原因为：①双向凝胶电泳方法测定的pH 范围相对液质联用要窄，双向电泳等电聚焦分离的pH 是3 7，而二维色谱方法测定的范围要比双向电泳广；②双向凝胶电泳在蛋白质提取的过程中必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和重复性的物质，比如核酸、脂类、多糖等大分子以及盐类小分子。
大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏IPG 胶条，这样都会造成2-DE 的失败，而二维色谱方法分析范围广、分析能力强、检测限低。
但两者共同鉴定出的差异蛋白质对研究大肠癌的发病、转移及复发机制提供了依据和方向。
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