双向电泳技术和实验流程

29
固相pH梯度聚丙烯酰胺凝胶基质结合缓冲基团
30
3、固相pH梯度等电聚焦原理
蛋白质分子按照自己的pI位臵在固相pH梯度中迁移， 知道达到自己的等电点，停止迁移。
4、固相pH梯度的优点和注意事项
固相pH梯度可窄至pH0.1的范围，因此分辨率极高，可 达0.001pH；pH梯度稳定，不漂移；灵活性大，可随意选 择pH梯度和斜率；重复性好；加样容量大；样品中盐的干 扰小；对碱性蛋白质也能很好的分离，无边缘效应，故可 用很窄的胶条（如5mm宽）聚焦，特别适合于双向电泳的 第一相，但固相 pH梯度灌胶技术复杂，只能使用聚丙烯 酰胺凝胶，电泳时候需要高电压，电泳时间长，窄范围pH 测定困难，只能计算。 注意事项：温度：20-30‴ ；电压：梯度上升。
在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷(种 类和数量)、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场 中泳动速度不同，各自集中到特定的位臵上而形成紧密
的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、 分析和鉴定的基本原理。
4
二、影响电泳速度的因素
1、电场强度；2、缓冲溶液的pH；3、缓冲溶液的离子强度；4、 电渗；5、焦耳热
34
浓缩效应
连续电泳 不连续电泳
凝胶层 缓冲液离子成分 pH 电位梯度
浓缩效应 电荷效应 分子筛效应
35
2、影响凝胶聚合的因素
25
3、载体两性电解质分离原理
等电聚焦样品可放于任何位臵。
4、载体两性电解质的缺点
① ② ③ ④ ① ② ③ ④ ⑤ 载体两性电解质合成过程复杂，影响蛋白质点的位臵，从而影响 了重复性； 负极漂移现象，使pH梯度不稳定； 负极漂移现象使碱性蛋白质无法聚焦； 凝胶灌制重复性差，凝胶机械稳定性差，影响重复性。 pH梯度的选择； 添加中性载体两性电解质； 电流降到最小切恒定时尽快结束IEF; pH梯度测定：电泳结束后，用微电机检测凝胶表面pH; 蛋白质在pI处形成沉淀。添加表面活性剂。
26
5、等电聚焦中应注意的事项
三、固相pH梯度等电聚焦电泳技术
固相pH梯度等电聚焦是80年代建立起来的一种等电 聚焦技术。固相pH梯度等电聚焦比传统等电聚焦具有更 高的分辨率，更大的上样量，其分辨率可达到0.001pH， 是目前分辨率最高的电泳方法之一。
27
1、固相pH梯度的介质
其所用的介质是一些具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺 衍生物，它们与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有相似的聚合 行为。
7
③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一 层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用， 但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大， 很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦， 分辨率低，实验室中已很少使用。 ④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔 径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 ⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及 检测。其分辨率较高。 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。
28
2、固相pH梯度的建立
固相pH梯度等电聚焦技术的突破要归功于Immobilines试剂 （Amersham Pharmacia Biotech, APB）的基础上开发的固相pH梯度（IPG） 技术。Immobilines（固相试剂）是一系列性质稳定的具有弱酸弱碱性质 的丙烯酰胺衍生物，与丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺有类的聚合行为。每个 分子都有一个单一的酸性或碱性缓冲基团与丙烯酰胺单连，其结构式为：
•在20‴能NH3反应，生成β、β′、β″-氮川三丙酰胺。
•与一些硫醇反应，生成β-烷基丙酰胺。 •也会由于超声、γ-射线和自然光线引起聚合作用。如果烃 键靠近在高度聚合的位臵，酰胺基也会受到分子间的缩聚 作用而成亚胺桥。
15
3、聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径：
凝胶的孔径可调性及其他性质
•每100亳升凝胶溶液中含有单体和交联剂的总 克数称凝胶浓度，用T%表示； T% = (a+b)/m •a：丙烯酰胺克数；b：N,N-甲叉双丙烯酰胺 克数；m：缓冲液体积(毫升)。
其中R代表羧基或第三氨基。分子一端的双键可以在聚合过程中共价键合 镶嵌到聚丙烯酰胺介质中。所以它是固相的，即使是在电场中也不会漂移 。分子另一端的R基团为弱酸或弱碱性的缓冲基团，利用缓冲体系滴定终 点附近一段pH范围就可形成近似线性的分布在pH3～10范围的缓冲体系。 所以固相pH梯度与载体两性电解质pH梯度的区别在于前者的分子不是 两性分子，在凝胶聚合时候便形成pH梯度，不随环境电场条件的改变而改 变，后者是两性分子，在电场中迁移到自己的等电点后才形成pH梯度。
三、电泳的分类
按原理分类： 自由界面电泳：又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶 液中进行的电泳。其装臵复杂，价格昂贵，费时费力，不 便于推广应用。 稳态电泳（或称臵换电泳）：分子颗粒的电泳迁移在一定时间 达到一个稳态后，带的宽度不随时间而变化。 区带电泳：是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上 分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中 的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。 区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分 5 为不同的类型。
蛋白。
2
第一节 蛋白质电泳的基本原理
一、电泳的基本原理
1、在电场作用下，带电颗粒向着与其电性相反的方向移 动的现象称为电泳（electrophoresis)。 由F = Eq，f = 6πr υ η
可得υ=Eq/(6πr η)
2、带电颗粒的泳动速度同电场强度和分子本身所带的净 电荷量成正比，与颗粒半径和介质黏度成反比。 蛋白质是一种两性电解质。其泳动速度取决于蛋 白质分子所带电荷的性质、数量以及颗粒的大小和形 3 状。
6
������
按支持介质种类的不同，区带电泳可分为
①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定
量分析。 ②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、
胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电
泳分辨率高。 ������ 以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有
分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。
光聚合作用通常需痕量氧原子存在才能发生，因为核黄素 在TEMED及光照条件下，还原成无色核黄素，后者被氧再氧 化形成自由基，从而引发聚合作用。
13
14
丙烯酰胺会产生如下几个化学反应：
•高浓度酸和碱会促进其水解形成丙烯酸和NH3。 •与一些羟基化合物如酚或酯族醇反应，生成β-芳氧基或烷 氧基丙酰胺。
PAGE应用广泛，可用于蛋白质、酶、核酸等生物 分子的分离、定性、定量及少量的制备，还可测 定分子量、等电点等。
10
1、丙烯酰胺凝胶有以下优点：
①几乎无电渗作用。
②化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。对pH和温度 变化较稳定。 •在一定浓度范围内凝胶无色透明，有弹性，机械性能好， 易观察。
•凝胶孔径可调。
•分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和
电荷效应为一体，因而有更高的分辨率。
11
2、聚丙烯酰胺凝胶的聚合
12
催化剂和加速剂的种类
①AP-TEMED：化学聚合作用。 加速剂四甲基乙二胺(TEMED)的碱基可使催化剂过硫酸铵 (简称AP)的水溶液产生出游离氧原子，然后激活Acr单体， 形成单体长链，在交联剂Bis作用下聚合成网状的凝胶。 ②核黄素-TEMED：光聚合作用。
第三章 双向电泳技术 和实验流程
1
*1809年俄国物理学家Peйce首次发现电泳现象。 *1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。
他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。
*1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius 电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白 蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓 性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。 *1948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨 基酸的分离进行过研究。 *从上世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离 以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、 淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。 *1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙 烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时 代。 *由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的 重要新发展，己受到人们的充分重视。 *双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1000个E.coli
20
利用蛋白质分子或其他两性分子等电点的不同，
在一个稳定的、连续的、线性的（或非线性）pH梯度 中进行蛋白质的分离和分析。分析对象只限于蛋白质 和其他两性分子。 根据建立pH梯度原理不同，可分为载体两性电解
质pH梯度（carrier ampholyte pH gradient)和固
相pH梯度(immobilized pH gradient, IPG)。
16
17
浓缩效应
18
聚丙烯酰胺凝胶电泳的异常现象及解决办法
1.凝胶未聚合
2.未加水层时凝胶聚合
3.电泳后未能检测出样品 4.样品分离区带宽或拖尾 5.只显一条区带 6.分离区带呈条纹状
19
第二节 蛋白质等电聚焦电泳
1966年，瑞典科学家Rible和Vesterberg建立。 等电聚焦：isoelectric focusing,IEF。 1.电泳系统中加进两性电解质载体，当通直流电时，两性电 解质载体即形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。蛋 白进入时，不同的蛋白移动到与其等电点相当的pH位臵上， 从而使不同等电点的蛋白得以分离。 2.优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性 好，可测定蛋白或多肽的等电点。 3.缺点：需无盐溶液，不适用于在等电点不溶解或发生变性 的蛋白。