Westernblot蛋白质双向电泳的原理方法及在医学中的应用最终版
westernblot原理及步骤
免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot技术：一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类western显色的方法主要有以下几种：i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP 标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。
)储于棕色瓶，4℃避光保存。
严格核实PH 不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。
使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。
如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
蛋白质双向电泳、western blot原理、方法、应用
双向电泳样品的溶解
• 是成功进行双向电泳的最关键因素之一 • 溶解的目标： • 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积 体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液； • 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、 多糖和核酸等物质的去除； • 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
增加样品溶解性的手段
• 离液剂（变性剂）：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充 分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量 域。典型代表是尿素和硫尿。 • 去垢剂（表面活性剂）：经过离液剂处理而暴露蛋白质的疏 水基团后，还常需至少一种去垢剂来溶解疏水基团。常用的 去垢剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP40、两性离子去垢剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS应用最普遍。 • 还原剂：在离液剂和去垢剂联用条件下，加用还原剂可使已 变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的 DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还 原。
什么是蛋白质印迹法 ？
• Westernblot法 是凝胶电泳技术、固定化 技术及分子亲和技术三者融为一体的综合 性技术，其核心在于把凝胶已分离的区带 并印迹于固化纸上，可分为电泳、转印、 酶免疫测定3个阶段。Westernblot法 结合 了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感 性和特异性，是一种能用于分析样本组分 的免疫学测定的方法。
胶条的转移
• 平衡结束后，先将IPG胶条完全浸末于1× 电泳缓冲液中，然后将胶条胶面朝上放在 凝胶的长玻璃板上（图4、图5）。 • 将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶 架上，在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封 胶液（图-6）。 • 用镊子、压舌板或是平头的针头，轻轻地 将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶 面完全接触（图-7）。 • 放置5分钟，使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝 固。
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
试述western blot技术的原理、方法、注意事项及其在医学科研中的应用。
1. 引言1.1 概述Western blot技术是一种常用的分子生物学实验方法，用于检测、定量和分析特定蛋白质在复杂混合物中的表达和相互作用。
它具有高灵敏度、高特异性和较为准确的测量能力，因此在医学科研领域中得到广泛应用。
1.2 文章结构本文将详细介绍Western blot技术的原理、方法、注意事项以及在医学科研中的应用。
首先，我们将阐述免疫检测原理、蛋白质分离与转移原理以及免疫染色与检测原理，帮助读者全面了解该技术的基本原理。
其次，我们将描述样品制备与电泳条件设置、蛋白质转移与固定方法以及免疫染色及可视化方法，为读者提供详细的实验步骤。
随后，我们将介绍实验室操作要求及安全措施、样品处理和保存注意事项以及技术参数调整和结果解读注意事项，以保证实验的准确性和可重复性。
最后，在医学科研领域中的应用方面，我们将以蛋白质表达水平检测、蛋白质亚细胞定位分析以及蛋白质相互作用和功能分析为例，展示Western blot技术在疾病诊断和药物研发等方面的重要应用。
1.3 目的本文的目的是为读者提供对Western blot技术全面了解，并指导其在医学科研中正确应用该技术。
通过详细介绍该技术的原理、方法和注意事项，读者将能够准确地进行实验操作并正确解读结果，同时也能够认识到其在医学科研中的重要性和广泛应用价值。
2. Western blot技术原理2.1 免疫检测原理Western blot技术是一种常用于检测特定蛋白质的免疫学方法。
它基于抗原与抗体的特异性结合关系，通过将蛋白质溶液经过电泳分离、转移到固体载体上，并使用特异性抗体识别目标蛋白质，从而实现对目标蛋白质的定性和定量检测。
在Western blot中，首先需要将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳分离。
然后，通过将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶或其他固体载体上，在固相载体上形成一个被称为“Western blotting”的蛋白质模式。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验⽅法原理步骤及注意事项实验⽅法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋⽩质转移到膜上，然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。
对已知表达蛋⽩，可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交⽅法类似，但Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质，“探针”是抗体，“显⾊”⽤标记的⼆抗。
经过PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
实验材料蛋⽩质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基⼄醇ddH2O⽢氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰⼄酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离⼼机离⼼管硝酸纤维素膜匀浆器剪⼑移液枪刮棒实验步骤⼀、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基⼄醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：⽢氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容⾄1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O⾄1000 ml。
5. 膜染⾊液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；⼄酸2 ml；ddH2O118 ml。
Western blot 实验原理和实验步骤
3 Western blot 流程图
Western Blot一般流程
1
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 洗膜 二抗杂交 洗膜 底物显色
蛋白样品的制备
2
1、细胞的处理：1、细胞计数，取5*10^4/well，500g离心5min。加入200ul PBS混匀，500g离心5min。去掉废液加入15ul PBS 再加入5ul 5Xloading buffer， 100C煮沸10min，冰上放置5min，稍离心。
第三步：是用自特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测 的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂 交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（知AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的 抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光 的条带来道显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。
Western blot 实验原理和实验步骤
为什么要做蛋白质印迹实验？
研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中 蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，样品之间的表达差异性。
目录
1
Western blot 基本原理
2
蛋白免疫印迹的组成
3
Western blot 一般流程
洗膜 用 TBST摇动洗三次，每次10min。 洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结 果背景的深浅。
二抗杂交
13
1、将PVDF膜放在密闭的自封袋或抗体盒中，加入稀释好的荧光二抗， 孵育 RT 0.5小时。（ 一般采用HRP标记的二抗，稀释比例参照说明书） 注：二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。
westernblot原理及步骤
Westernblot原理及步骤原理：Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗.经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
操作步骤：蛋白质样品获得：1、所需试剂：(1)蛋白酶抑制剂mix：hjjhh储存浓度5ml mix中的加入量终浓度*PMSF（溶于乙醇）100mM25ul50uM*Trypsin Inhibitor1mg/ml250ul50ug/ml*EGTA（pH8.0）0.5M80ul8mM*EDTA（pH8.0）0.5M10ul1mMAprotinin1mg/ml25ul5ug/mlPepstatin（溶于乙醇）0.2mg/ml50ul10ug/mlLeupeptin5mg/ml100ul0.1mg/mlBenzamidine100mM250ul5mMNaF5M250ul250mMNaVO4（FW183.8）0.2M25ul1mM注意：*代表必须加的试剂(2)细胞裂解缓冲液(培养细胞用)：1% NP40, 25 mM Hepes。
配制1M DTT溶液，保存在-20℃冰箱中。
配制细胞裂解液（现用现配）：将裂解缓冲液和抑制剂溶液等体积混合，然后加入DTT溶液，使其浓度为1 mM。
（3）RIPA(组织样品)：1×PBS，1％NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS。
（蛋白抑制剂在提取蛋白时现加，按10ul/ml RIPA的量加10mg/ml PMSF，Aprotinin按30ul/ml RIPA的量加入）也可用样品裂解液：（2%SDS；0.01%溴酚兰；10%甘油；60mmol/LTris-HCl(PH6.8)； 100mmol/LDTT(取自-20℃存放的1mol/L储存液，临用时加入)2、细胞裂解步骤：将所有的样品放在冰上（1）4℃离心5min沉淀细胞（2）去掉上清（3）将细胞重悬于1ml冰冷的PBS中（4）转到离心管中（5）4℃离心5min，（6）（除去样中微量血清）（7）除去上清（8）置细胞沉淀于冰上（9）每107cells加裂解工作液100ul（10）轻轻重悬细胞沉淀（11）置冰上20min（12）13000rpm离心15min（13）4℃（14）将上清转到小离心管中（将管盖扎上针孔）（15）取出1ul（16）用于Bradford测定（17）液氮速冻样品（18）-20℃保存3、组织裂解：（1）3ml冰冷的RIPA缓冲液匀浆1g组织,每克组织加30ul 10mg/ml PMSF（2）所有步骤均在4℃下进行,匀完浆后冰上放置30min.，4℃10000×g离心10min，取上清（如果无法沉淀，请加大离心力，操作40min 之后需要再加PMSF，加量同1，如信号转导、转录因子类蛋白易降解，可添加Aprotinin、Benzamidine、NaVO4等蛋白酶抑制剂）；有些蛋白可能存在于沉淀中（Triton不可溶的蛋白多数是SDS加热可溶的），因此要保留沉淀，沉淀用RIPA清洗几次后，保存，电泳前变性处理时要额外加入 SDS，因为沉淀蛋白多数是SDS加热可溶蛋白。
Western-blot的原理、操作及注意事项
Western blot的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins 离心，取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml)，溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取（特例）：直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。
B：蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因1.双缩脲法：双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。
在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。
硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。
双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。
双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。
干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。
可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1m NaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。
western blot 的原理与操作方法(详细)
Western Blot 原理和操作方法（详细）工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳.另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部.重要参数①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算:T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100%其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml)②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度:蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%)<104 20-301×104-4×104 15-204×104-1×10510-151×105-5×105 5-10>5×105 2-5③分离胶:电泳凝胶浓度试剂10% 12% 15% 10% 12% 15%H2O(ml) 4.0 3.3 2.3 5.9 4.93.430%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 3.3 4.0 5.0 5.0 6.07.51.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.5 2.5 2.53.8 3.8 3.810%SDS(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.1510%AP(ml) 0.1 0.1 0.1 0.15 0.15 0.15TEMED(μl) 4 4 4 6 6 6总体积(ml) 10 15④浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 4 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 1 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 1 0.510%SDS(μl) 80 4010%AP(μl) 60 30TEMED(μl) 84总体积(ml) 6 3蛋白质的样品制备：蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
1、甲醇活化PVDF膜10min原理：PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
大于20000的蛋白选用0.45um的膜，小于20000的蛋白选用0.2um的膜。
PVDF膜在使用时需预处理，用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。
2、制备1xtransferbuffer（冰上保存）10xtransferbuffer：tris 30.3g+Glycine144g+ddH20到1L11xtransferbuffer：100ml10xtransferbuffer（一般都放在冷室里）+100ml甲醇（一般都在通风橱）+800mlddH203、关闭电源，取出胶，切去不用的区域，并在左上角做标记（目的是标记第一个条带的上方。
western-blot与蛋白质双向电泳的原理,方法及应用
THANKS
LOREM IPSUM
沉淀蛋白质
除杂质
溶解
IPG胶条上样与第一向等点聚焦 将样品与水化上样缓冲液混合，体积比约为1:4
混合物加入胶条槽
除去保护膜，将胶条酸性端（尖端）朝胶条槽 阳极方向放入，慢慢下压，最后放入碱性端 （平端），使溶液浸湿胶条，避免生成气泡
将胶条槽平放在电泳仪上，对好正负极， 设定等电聚焦程序
在胶条上覆盖适量矿物 油，盖上盖
western blot与蛋白质双向电泳的原理， 方法及应用
演示人：胡祺祥，张锋，余涵
目
录
Contents
1
western blot原理及方法
2
蛋白质双向电泳原理及方法
3
医学应用
第
1
western blot原理及方法
章
一.基本原理
PAGE分离蛋白质 印迹转移
通过PAGE（聚丙烯
一抗，二抗杂交
第
3
医学应用
章
western blot的临床应用
01
过敏原检测 及方法建立
02
诊断寄生虫 病
03
检测基因产 物表达及水 平
04
检测病毒感 染
过敏原检测及方法建立
由于许多过敏原是来着生物体的机体，尤其表现在蛋白质上。 例如鱼类。鱼类是最常见的易引起过敏反应的食物，而小清蛋白是最常见的过敏原。在建立鱼小清蛋 白检测及方法建立过程中利用western blot法完成免疫鉴定，为低免疫产品研制生产提供理论依据。
底物显色或者放射自显影
酰胺凝胶电泳）分 离的蛋白质样品， 转移到固相载体上， 以固相载体上的这 些蛋白质或者多肽 作为抗原与对应的 抗体起免疫反应再 与酶或者同位素标 记的第二抗体起作 用，通过底物显色 或者放射自显影来 检测特定基因表达 的蛋白质
蛋白质免疫印迹（WesternBlot）实验步骤和原理及注意事项
蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot）实验步骤和原理及注意事项蛋⽩质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋⽩样品(Protein sample preparation)可以使⽤适当的裂解液。
收集完蛋⽩样品后，为确保每个蛋⽩样品的上样量⼀致，需要测定每个蛋⽩样品的蛋⽩浓度。
根据所使⽤的裂解液的不同，需要采⽤适当的蛋⽩浓度测定⽅法。
因为不同的蛋⽩浓度测定⽅法对于⼀些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很⼤。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋⽩样品中加⼊适量浓缩的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液。
使⽤5X的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液可以减⼩上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋⽩样品。
100℃或沸⽔浴加热3-5分钟，以充分变性蛋⽩（根据蛋⽩分⼦的⼤⼩，煮沸时间可适当变化，⼀般不低于5min。
煮沸只是变性蛋⽩，⽽不是分解，⼀般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋⽩质的⽴体⼆级结构,伸展为⼀维线性结构,所以⼀般来讲⼆聚体都会解体,才能完全按照分⼦量跑电泳,加的蛋⽩Marker才有指⽰分⼦量的意义。
蛋⽩样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋⽩呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离⼼5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另⼀管,4度可以放⼀周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：⼀只⼿扣紧玻璃板，另⼀只⼿蘸点洗⾐粉轻轻擦洗。
两⾯都擦洗过后⽤⾃来⽔冲，再⽤蒸馏⽔冲洗⼲净后⽴在筐⾥晾⼲。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放⼊夹中卡紧。
然后垂直卡在架⼦上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加⼊TEMED后⽴即摇匀即可灌胶。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
操作步骤（一）蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。
然后4℃，13,000g 离心15min。
取上清液作为样品。
（二）电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
（三）转移：（半干式转移）1、电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。
2、膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。
3、转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。
接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。
转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。
将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。
值得一提的是，western blot 这个名称的由来很有意思。
western-blot与蛋白质双向电泳的原理,方法及应用
检测病毒感染
检测病毒感染有两个应用方向：疾病诊断与血液筛选。 疾病诊断例：风疹病毒(ＲＶ) 能够引起先天感染。通过孕妇传播,致使胎儿先天畸形或导致先天性风 疹综合征如先天性心脏病、智力低下等。因此能够早期快速诊断对于优生优育、提高人口素质 、预 防后天及再感染具有重要意义。目前临床上所用的ELISA 检测试剂盒所包被抗原为全细胞粗制抗原 , 特异度低、灵敏度差,缺乏统一的抗原标准。现可采用Western-blot的方法,测定风疹病毒的主要抗原 性蛋白, 以指导临床应用 。
IPG胶条平衡 聚焦结束的胶条应立即进行平衡 将胶条放入平衡缓冲液Ⅰ中，振荡15分钟 将胶条放入平衡缓冲液Ⅱ中，振荡15分钟 用去离子水润洗胶条1秒，用滤纸在胶条边缘吸去多余水 分
平衡缓冲液Ⅰ：
--含DTT（二硫苏糖醇） --使变性的非烷基化蛋白质处于还原状态 平衡缓冲液Ⅱ： --含碘乙酰胺 --使蛋白质巯烷基化，防止其在电泳过程中重新氧化
增加样品溶解性的方法： ①变性剂，使蛋白质的疏水基团暴露，降低接近疏水残 基 的能量域。如尿素、硫脲等 ②表面活性剂，可溶解疏水基团，如离子去污剂SDS，非 离子去污剂NP-40及两性离子去污剂CHAPS，其中CHAPS 最好 ③还原剂，可使蛋白质展开更完全，溶解更彻底
预处理细胞 （清洗等）
破碎细胞
为抗体,从中筛选出4个特异性抗原（cC1、cC2、cP1、cH1）,这些抗原克隆经IPTG诱导,形成β-半乳糖
苷酶-猪囊尾蚴特异性抗原的融合蛋白( fusion protein, FP)。 诊断人颚口线虫病：采用Western印迹技术检测颚口线虫特异的相对分子质量为21 000和24 000抗原蛋
白条带，结果 Western印迹法检测颚口线虫患者血清,均可见相对分子质量为24 000的条带,7份可见相对
Western-blot技术方法、原理及步骤
Western-blot技术⽅法、原理及步骤Western-blot技术原理：Western Blot技术是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
实验步骤：Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是⽤抗体检测蛋⽩的重要⽅法之⼀。
Western可以参考如下步骤进⾏操作。
1. 收集蛋⽩样品(Protein sample preparation)：使⽤适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。
对于某些特定的亚细胞组份蛋⽩，例如细胞核蛋⽩、细胞浆蛋⽩、线粒体蛋⽩等，可以参考相关⽂献提取这些亚细胞组份蛋⽩，也可以使⽤试剂盒进⾏抽提。
亚细胞组分分离⽅法：（参考）制备组织匀浆（根据组织类型选择不同的匀浆⽅法，进⾏优化）离⼼时间亚细胞组分1,000g X 10 min pellets nuclei（细胞核）heavy mitochondria（线⽴体）plasma membrane sheets（浆膜）3,000g X 10 min heavy mitochondria（线⽴体）plasma membrane fragments（浆膜）6,000g X 10 min Mitochondria（线⽴体）Lysosomes（溶酶体）Peroxisomes（过氧化物酶体）intact Golgi（完整⾼尔基体）10,000g X 10 min Mitochondria（线⽴体）Lysosomes（溶酶体）Peroxisomes（过氧化物酶体）intact Golgi membranes（完整⾼尔基体膜）20,000g X 10 min Lysosomes（溶酶体）Peroxisomes（过氧化物酶体）Golgi membranes（⾼尔基体膜）large dense vesicles（⼤⾼密度囊泡）100,000g X 10 min all vesicles from ER（来⾃内质望⽹的囊泡）plasma membrane（浆膜）Golgi（⾼尔基体）Endosomes（内含体）注：以上⽅法仅做为参考，需根据实验条件进⾏优化。
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31
技术流程
提出 生物学问题
实验组和对照组样品制备
双向电泳(2DE/DIGE)
凝胶图像分析
差异蛋白点选取 蛋白酶解及质谱分析 差异蛋白点的成功鉴定
Western blot 、蛋白质双向电泳的 原理、方法及在医学中的应用
湘雅医学院精神医学 1301班
CONTENTS
1
Western blot 原理及方法
2
蛋白质双向电 泳的原理
4
应用
3
蛋白质 双向电 泳的方
法
2
Western blot 原理及方法
蛋白质印迹法
3
Western blotting
? 做免疫印迹时选择抗体主要应考虑两个问题，一是所选抗体是否能识别 凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉 反应条带 。
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化学显色法
方便、便宜、灵敏 度较低、费抗体、 反应慢、线性窄、 不易保存、不能重 新剥离检测
Western blotting ！！
4
什么是蛋白质印迹法 ？
Westernblot法 是凝胶电泳技术、固定化技术及分 子亲和技术三者融为一体的综合性技术，其核心在 于把凝胶已分离的区带并印迹于固化纸上，可分为 电泳、转印、酶免疫测定3个阶段。Westernblot法 结合了电泳的高分辨率和酶免疫测定的高敏感性和 特异性，是一种能用于分析样本组分的免疫学测定 的方法。
Western Blotting 间接法操作流程
Western Blotting 设计标准
分子量 标准
膜的选择
抗体
显色结果
不可小看“蛋白标准” --分子量标准的选择修Leabharlann 分子 量标准预染分子 量标准
分子量标准
预混分子 量标准
15
不可小看“蛋白标准” --分子量标准的选择
?预混分子量标准
高分子量标准 低分子量标准 宽分子量标准
异性抗体结
2.PVDF膜
灵敏度、分辨 率和蛋白亲和 力比常规的膜 要高，对蛋白 的吸附能力要 远远大于NC膜
3.尼龙膜
对核酸和蛋白 质具有很强的 结合能力，能 代替NC膜用于 分子印迹和杂
交实验。
选择膜的标准
选择标准
1.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合 蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）
2.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法， 信噪比好）
3.后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还 要根据不同目的来挑选不同的转移膜
膜的特点
抗体的选择
? 作为western 来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少 一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。 用于western 的抗体和用于 ELISA 的抗体，一般来说用于 western 的抗体识别的是氨基酸序列特异 性；而可用于 ELISA 的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特 异性，有些是识别构像特异性 。所以一般根据抗体说明书来确定。
26
第一向：等电聚焦
第二向：SDS —PAGE 电泳
?聚丙烯酰胺是由单体丙烯酰胺(Arc)和交联剂N,N-甲叉丙烯 酰胺(Bis)在加速剂N,N,N'—四甲基乙二胺（ TEMED）和催 化剂硫酸铵（AP）或核黄素的作用下聚合交联成三维网状 的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为PAGE。
30
蛋白质双向电泳的方法
显色的 方法
化学发光法
灵敏、快速、节省抗 体、反应快、线性宽、 无害、特异性高、可 重新剥离检测
同位素法
灵敏度高、不安全 、环境污染、不方 便和半衰期短
荧光底物法
Krypton ?荧光底物
蛋白质双向电泳的原理
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25
双向电泳的实验原理
◆第一向：等电聚焦 ◆第二向：SDS—PAGE电泳
Edward M. Southern建立 了将DNA转移到硝酸纤维 素膜 （NC膜）上，并利 用DNA－RNA杂交检测特定 的DNA片段的方法
George Stark对电 泳后的蛋白质分子进 行印迹分析从而发明 western印迹技术
1975 1979 同年 最终
McMaster和Carmichael 对RNA进行印迹分析，发 明 Northern印迹技术
5
为什么要作蛋白质印迹实验 ？
1
研究一些体外的 蛋白质分子，寻 找目的蛋白是否 存在样品当中
2
不同的样品中检 查蛋白质的表达 情况，上调或下 调表达，如疾病 和正常的样品之 间的表达差异性
6
Western Blot 的基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一 种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
?缺点：
? 1.免疫反应性降低 ? 2.无信号二级放大 ? 3.抗体标记费时昂贵 ,使用不方便
Western Blotting 方法二: 间接法
?优点：
? 1. 免疫特异性不受标记影响 ? 2. 信号放大灵敏度高（多个二抗结合位点） ? 3. 多种标记的二抗可供选择 ? 4. 可选择不同的Marker
?预染分子量标准
单色预染 多色预染
?修饰分子量标准
糖基化 磷酸化 荧光标记
预混分子量标准
? 高分子量标准 ? 低分子量标准 ? 宽分子量标准
预染分子量标准
? 单色预染 ? 多色预染
修饰分子量标准
? 糖基化 ? 磷酸化 ? 荧光标记
膜—三种选择
1.硝酸纤维素膜（NC 膜）
价格便宜，简单 快速封闭与非特
?缺点：
? 1. 交叉反应引起的非特异性条带 ? 2. 额外的二抗孵育以及条件优化
为什么一般情况下都采用间接法进行检测？
?直接法与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记可用于很多种 不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一 抗结合不知一个二抗分子，所以二抗可以增强信号，所以一般 情况下都采用间接法进行检测
Western Blotting 操作流程
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
转膜 封闭 一抗孵育 二抗孵育 底物显色
Western Blotting 操作流程
第三步
第五步
底物显色
第一步
一抗杂交
转膜
第二步
封闭
第四步
二抗杂交
9
Western Blotting 方法一: 直接法
?优点：
? 1.快速（一种抗体） ? 2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带