双向电泳原理及实验步骤(1)

第二向：SDS-PAGE电泳
–
Proteins migrate through the gel at a rate proportional to their size.
Smallest proteins travel the furthest distance
+
pH 3
pH 7.5
pH10
size
蛋白质组双向电泳 实验操作
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1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins 和Williams首先提出了蛋白质组（Proteome） 的概念，其定义为在一种细胞内存在的全部蛋
白质。
蛋白质组研究中主要应用的技术包括：双相电 泳(2-DE)、新型质谱(MS)技术、数据库设置 与检索系统等。
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蛋白质组分析的首要要求
• 将来自于全细胞、组织或生物体中所包含 的多达几千种混合蛋白质进行分离、检测 和分析 。
• 2-DE技术依然是大多数蛋白质组研究中分 离复杂蛋白质混合物的首选技术 。
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生物学问题 的提出
实验模型 的设计
实验组和对照组 样品的制备
感兴趣 蛋白点 的切取
蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离 图像扫描和初步分析
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样品上样缓冲液
标准溶液：
Reagent
8M urea
50mM DTT or 2mM TBP 4% CHAPS 0.2%carrier ampholytes 0.0002%bromophenol blue ddH2O
Amount
47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O
可c编h辑a版rge
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样品制备基本原则
• 使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包 括多数疏水性蛋白），制备方法应具有可重现性。
• 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 • 防止在样品制备过程中发生样品抽提后的化学修
饰（如酶性或化学性降解等）。
• 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而
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增加样品溶解性的手段
离液剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸展， 将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。 典型代表是尿素和硫尿。
去垢剂：经过离液剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后， 还常需至少一种去垢剂来溶解疏水基团。常用的去垢 剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和 NP-40、两性离子去垢剂CHAPS、OBG等。其中 CHAPS应用最普遍。
级抽提，按样品溶解度不同进行分离。
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双向电泳样品的溶解
• 是成功进行双向电泳的最关键因素之一
• 溶解的目标：
– 样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏， 从而形成各个多肽的溶解液；
– 必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸 等物质的去除；
– 保证样品在电泳过程中保持溶解状态。
• IPG胶的材料是Immobilines，为拥有 CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍 生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它 们构成了分布在pH3-10不同值的缓冲体系。 根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂 添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓 冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨 架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的 IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特 别稳定的IEF分离达可到编辑真版 正的平衡状态。 8
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IPG胶条蛋白质大约载样量
IPG Strip length
Analytical Load (silver staining)
7cm
10~100 g /125 l
Preparative Load (Coom staining)
胰酶对脱色后蛋白质的消化 质谱的多肽指纹图、微测序分析
蛋白信息的 初步获得
质谱结果的生物信息学分析和比对 新蛋白质的发现
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其它实验
的进一步
验证
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蛋白质组研究的基本技术路线
蛋白质样品的制备
凝胶中的蛋白
双向电泳
图像分析
转印至膜上的蛋白
溶液中的蛋白
混合肽
肽指纹图
肽序列质谱数据 蛋白质质量 N端测序
还原剂：在离液剂和去垢剂联用条件下，加用还原剂可 使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含 自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁 基膦（TBP）进行还原。
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两性载体电解质：即便在离液剂和去垢剂存在的情 况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保 持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点 时会发生沉淀。 两性载体电解质的作用在于补充样品中少量的盐分 ，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质 的浓度应小于0.2％（w/v)。浓度过高会使IEF的升 压困难、速度降低。另外，为了保证实验的精确性 ，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电 解质的pH值与之相符合。
保证待研究蛋白的可检测性。
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样品制备
• 细胞样品：反复冻融、超声破碎
• 组织样品：碾磨、匀浆
• 植物样品：碾磨
• 分泌蛋白
蛋白质样品的浓缩、去除滤液中的高丰度蛋白
• 菌体蛋白
裂解液处理、超声破可编碎辑版
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不同样品的基本处理方法
可溶性样品
固体组织样品 细胞
样品的分级处理
通过采用亚细胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法 对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并 富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分
数据搜索 新的或已知蛋白
蛋白转录可编后辑修版 饰的鉴定
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一、双向电泳的实验原理
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第一向：等电聚焦
+
pH 3
+
pH 3
pH 7.5 pH 7.5
–
pH 10
–
pH 10
+
pH 3
+
pH 3
pH 7.5
pH 7.5 可编辑版
–
pH 10
–
pH 10 7
一维固相pH梯度等电聚焦 （IEF with IPG）：
385mg or 500ul of 200mM TBP stock
2g
See next table
100ul of 0.1% stock
To 50ml
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胶条蛋白载样量
影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括： • 待分析的蛋白点的量需满足随后的质谱分
析。 • 电泳的研究目的。 • 待研究蛋白的丰度： • 样品的复杂度。 • IPG胶条的pH范围