rt-qPCR实验操作课件
合集下载
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技术 ppt课件
OD260/OD280在1.8~2.0之间 ，比值越低，混有蛋白质污染。 OD260/OD230在2.0~2.5之间 ，若比值小于2，说明有残余的盐存在； OD230/OD260在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在 。
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
• 乙醇：主要目的是：沉淀+除盐；洗涤异丙醇，也可以溶解一部分
蛋白，痕量的乙醇很容易挥发掉。
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
RNA浓度和纯度的测定
DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰， 蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，因为酪氨酸和色氨酸的最大吸收峰在 280nm附近，而大多数蛋白含有酪氨酸和色氨酸残基，且含量相对恒定。 盐和小分子则集中在230nm处， 320nm或340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0。
“Measure”
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
RNA提取常见问题及分析
得率
A．样品裂解或匀浆处理不彻底 B．最后得到的RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65
A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。 B．样品匀浆时加的试剂量太少。 C．匀浆后样品未在室温放置5分钟。 D．水相中混有有机相。 E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
RNA的琼脂糖凝胶电泳
• 28S的亮度是18S的2倍左右 • rRNA占总RNA80%以上。
5lRNA+1ul loading buffer，100V电泳10分钟
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
• 乙醇：主要目的是：沉淀+除盐；洗涤异丙醇，也可以溶解一部分
蛋白，痕量的乙醇很容易挥发掉。
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
RNA浓度和纯度的测定
DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰， 蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，因为酪氨酸和色氨酸的最大吸收峰在 280nm附近，而大多数蛋白含有酪氨酸和色氨酸残基，且含量相对恒定。 盐和小分子则集中在230nm处， 320nm或340nm为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0。
“Measure”
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
RNA提取常见问题及分析
得率
A．样品裂解或匀浆处理不彻底 B．最后得到的RNA沉淀未完全溶解
A260/A280<1.65
A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。 B．样品匀浆时加的试剂量太少。 C．匀浆后样品未在室温放置5分钟。 D．水相中混有有机相。 E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
RNA的琼脂糖凝胶电泳
• 28S的亮度是18S的2倍左右 • rRNA占总RNA80%以上。
5lRNA+1ul loading buffer，100V电泳10分钟
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
基因分子生物学实验--第二节 RNA的制备及鉴定和RT-PCR技 术
RTPCR实验报告课件
逆转录pcrrt-pcr）和及时为反转录rcr （ reverse transcription pcrpcr （ real time pcr）共同的缩写。
逆转录pcr ，或许称反转录pcr(reversetranscription-pcr, rt-pcr) ，是聚合酶链式反响 (pcr) 中，一条 rna 链被逆转录成为互补 dna ，再以此为模板经过的一种宽泛应用的变形。
在pcr 进行dna 扩增。
rt-pcr由一条rna 单链转录为互补dna(cdna) 称作“逆转录” ，由依靠rna 的dna 聚合酶（逆转录酶）来达成。
随后，dna 的另一条链经过脱氧核苷酸引物和依靠rna 的dna 聚合酶达成，随每个循环倍增，即往常的pcr 。
原来的rt-pcr的指数扩增是一种很敏捷的技术，于遗传病的诊疗，并且能够用于定量监测某种rna 模板被rna 酶 h 降解，留下互补dna 。
能够检测很低拷贝数的rna 。
rt-pcr宽泛应用rna的含量。
（检测基因表达的方法，拜见northern blot 法。
）rt-pcr 作“ 定量有时也会指代及时pcr ” (quantitative pcr)pcr(real-time pcr)。
为了与逆转录或许rtq-pcr(real-time quantitative pcr)pcr 相差别，往常被写。
及时pcr及时为基础进行pcr(real-time pcr)dna 的定量剖析。
，属于定量pcrreal time pcr（ q-pcr）的一种，以一准时间内dna 的增幅量的定量使用萤光色素，当前有二种方法。
一种是在ds dna 中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅dna 序列中特定寡核酸序列相联合的一种萤光探针（probe ）。
real time pcr 与reverse transcription pcr 相联合，能用微量的rna 来找出特准时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
rtqPCR实验操作 ppt课件
耐热dna聚合酶按53方向催化以引物为起始点的延伸反应70723060srtqpcr实验操作示意图rtqpcr实验操作?realtime定量pcr仪是在pcr反应体系中加入荧光基团利用荧光信号累积实时监测和连续地分析整个pcr进程随着反应时间的进行监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线最后通过标准曲线对未知模板进行定量的分析
内参基因(Endogenous Control) 用于校准实验过程中样品本身对定量结果的
影响 原因：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数 为单位取
样，提取过程中存在得率差异和操作误 差，造成
等量样品不一定获得等量提取物 目的：将定量结果校准rtqPCR为实验操以作 基因组（或单个细
2、降低随机误差: 重复实验
rtqPCR实验操作
• 在相同的条件下，进行复制扩增，每扩增 一个循环，通过检验荧光来检测每个孔里 目标基因片段的含量，记录每个反应管内 的荧光信号达到设定的域值时所经历的循 环数（样本的域值循环数Ct），次数越多就 说明目标基因在原本的样品里越少，即初 始模板的量越少。
rtqPCR实验操作
logX= n (1+E)+logX0
4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每 孔18.4微升，加完后rt按qPCR实排验操作板顺序加相应的前
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
rtqPCR实验操作
荧光定量PCR如何减小误差 1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
rtqPCR实验操作
1、校准生物学误差内参(管家基因)
rtqPCR实验操作荧光实时定量PCFra bibliotek rt-qPCR
定义
实时荧光定量PCR(rt-qPCR)： • 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号的变化对PCR过程进行 实时监控，以 此实现对初始模板的定量分析。
内参基因(Endogenous Control) 用于校准实验过程中样品本身对定量结果的
影响 原因：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数 为单位取
样，提取过程中存在得率差异和操作误 差，造成
等量样品不一定获得等量提取物 目的：将定量结果校准rtqPCR为实验操以作 基因组（或单个细
2、降低随机误差: 重复实验
rtqPCR实验操作
• 在相同的条件下，进行复制扩增，每扩增 一个循环，通过检验荧光来检测每个孔里 目标基因片段的含量，记录每个反应管内 的荧光信号达到设定的域值时所经历的循 环数（样本的域值循环数Ct），次数越多就 说明目标基因在原本的样品里越少，即初 始模板的量越少。
rtqPCR实验操作
logX= n (1+E)+logX0
4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每 孔18.4微升，加完后rt按qPCR实排验操作板顺序加相应的前
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
rtqPCR实验操作
荧光定量PCR如何减小误差 1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
rtqPCR实验操作
1、校准生物学误差内参(管家基因)
rtqPCR实验操作荧光实时定量PCFra bibliotek rt-qPCR
定义
实时荧光定量PCR(rt-qPCR)： • 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号的变化对PCR过程进行 实时监控，以 此实现对初始模板的定量分析。
rt-qPCR实验操作
生物学重复：样品三次重复 • 技术重复：每个样品做3-4个复孔
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
荧光定量PCR如何减小误差 1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
1、校准生物学误差内参(管家基因)
内参基因(Endogenous Control) 用于校准实验过程中样品本身对定量结果的影响 原因：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数为单位取 样，提取过程中存在得率差异和操作误差，造成 等量样品不一定获得等量提取物 目的：将定量结果校准为以基因组（或单个细胞）为 单位，不同样品之间才具有可比性 校准方法：[目的基因]-[内参]=均一化的目的基因表达量
• 理论上来说，PCR反应过程中生成的DNA产物是呈指 数方式增加的，即每增加一个循环，PCR产物加倍。 但随着反应循环数的增加，产物积累、原料消耗， 最终PCR反应无法继续维持指数方式的扩增，而进 入线性期和平台期。整个PCR反应过程中，只有在 指数期，PCR产物的量与加入的初始模板量存在明 确的数学关系（PCR产物量=初始模板量×2^N，N= 循环数），因此，利用公式，可以由产物的量精确 推算出初始模板量的多少。而在线性期和平台期， PCR产物量和初始模板量之间不存在准确的数学关 系，由这两个时期的产物量来推算初始模板量的多 少是不准确的。
1、把要测的RNA逆转录为cDNA，决定要跑的基因和 使用的内参序列，排好板的顺序。 2、准备好DNA样本，水，sybr，前后引物，融化，离 心。 3、计算样本混合物（每个孔加sybr10ul、cDNA30ug、 水8.4ul-cDNA），前后引物的量（每个孔加前后引物 各0.8ul），多算1到2孔。按比例混合样本，sybr，水。 按比例混合前后引物。 4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每孔18.4微 升，加完后按排板顺序加相应的前后引物混合物，每 孔1.6微升。 5、贴膜，离心，上机，Real Time PCR扩增结束后输出 对照组和待测组的目的基因及内参基因的CT值。
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
荧光定量PCR如何减小误差 1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
1、校准生物学误差内参(管家基因)
内参基因(Endogenous Control) 用于校准实验过程中样品本身对定量结果的影响 原因：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数为单位取 样，提取过程中存在得率差异和操作误差，造成 等量样品不一定获得等量提取物 目的：将定量结果校准为以基因组（或单个细胞）为 单位，不同样品之间才具有可比性 校准方法：[目的基因]-[内参]=均一化的目的基因表达量
• 理论上来说，PCR反应过程中生成的DNA产物是呈指 数方式增加的，即每增加一个循环，PCR产物加倍。 但随着反应循环数的增加，产物积累、原料消耗， 最终PCR反应无法继续维持指数方式的扩增，而进 入线性期和平台期。整个PCR反应过程中，只有在 指数期，PCR产物的量与加入的初始模板量存在明 确的数学关系（PCR产物量=初始模板量×2^N，N= 循环数），因此，利用公式，可以由产物的量精确 推算出初始模板量的多少。而在线性期和平台期， PCR产物量和初始模板量之间不存在准确的数学关 系，由这两个时期的产物量来推算初始模板量的多 少是不准确的。
1、把要测的RNA逆转录为cDNA，决定要跑的基因和 使用的内参序列，排好板的顺序。 2、准备好DNA样本，水，sybr，前后引物，融化，离 心。 3、计算样本混合物（每个孔加sybr10ul、cDNA30ug、 水8.4ul-cDNA），前后引物的量（每个孔加前后引物 各0.8ul），多算1到2孔。按比例混合样本，sybr，水。 按比例混合前后引物。 4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每孔18.4微 升，加完后按排板顺序加相应的前后引物混合物，每 孔1.6微升。 5、贴膜，离心，上机，Real Time PCR扩增结束后输出 对照组和待测组的目的基因及内参基因的CT值。
基因表达检测RTPCR-PPT课件
Total RNA
3l (2-5g)
RNase-free DNase
１l (１u / l)
10× DNase buffer
1 l
add DEPC-treated ddH2O
5 l
4. Incubate at 37℃ for 15 min, then 70℃ for 10 min.
操作步骤（二）Reverse Transcriptase Reaction
鼠白血病毒反转录酶 M-MLV：
单链多肽，具有聚合酶和较弱的RNase H活性 （或RNase H－），最适反应条件：37 °C, pH8.3,
禽成髓细胞反转录酶 AMV
2条多肽链，具有聚合酶活性和较强的RNase H活 性，最适反应条件41-45 °C，pH8.3比pH7.6活 性高
RNase H： 催化DNA-RNA杂合体的RNA部分的降解，产生不同 链长带3‘羟基和5’磷酸末端的寡核苷酸。
3. 检测 0.5×TBE
电泳
In 1× MOPS 80 —150V 40 min —1h30min
有溴化乙锭存在时，电泳后28S rRNA和18S rRNA 在紫外灯下应当很清楚的看得到，还应当有一条由 tRNA，5.8S rRNA和5S rRNA组成的较模糊的迁移较 快的带。如果RNA没有降解， 28S rRNA的亮度应当是 18S rRNA的2倍，且这两条带都没有弥散现象。
水冲洗）；
防止外源RNase污染的主要措施(二）：
5. 准备所有的溶液和缓冲液时，使用无RNA酶的玻 璃器皿，DEPC处理过的水，用于RNA的化学药品 使用专用药勺或直接敲击瓶底分离，可能的话， 用0.1％的DEPC在37ºC处理溶液1小时后在 15psi(1.05kg/cm2高压蒸气灭菌15min。
实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用ppt课件
pcrrtpcr反应体系模板45ltagmixture50l025l荧光染料sybrgreen荧光标记的探针taqman探针法rtpcrmonitoringpcrsybrgreendyesybrgreen变性退火延伸rtpcrsybrgreenrtpcr10rtpcrmonitoringpcrtaqmantaqman法11rtpcrtaqman法12taqmanrtpcr13?绝对定量absolutequantificationaq病原体检测转基因食品检测基因表达研究?相对定量relativequantificationrq基因在不同组织中的表达差异药物疗效考核耐药性研究rtpcr14相对定量通过内标定量内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数rtpcr内标endogenouscontrol通常是18s28sactingapdh基因等看家基因在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定受环境因素影响小15rtpcr16rtpcrctpcr扩增循环数荧光域值threshold的设定在定量pcr中需要经过数个循环后荧光信号才能够被检测到一般以15个循环的荧光信号作为荧光本底信号
4
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
5
RT-PCR技术的原理及试验流程
6
RT-PCR技术的原理及试验流程
7
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系
模板
4.5μl
Tag mixture
5.0μl
F(F’)
0.25μl
R(R’)
0.25μl
4
实时荧光定量PCR的定义
PCR技术和荧光检测技术的结合
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行 标记跟踪，实时在线监控反应过程，通过仪器和相应的软 件分析结果，对待测样品的初始模板进行定量或定性分析。
5
RT-PCR技术的原理及试验流程
6
RT-PCR技术的原理及试验流程
7
RT-PCR技术的原理及试验流程
RT-PCR反应体系
模板
4.5μl
Tag mixture
5.0μl
F(F’)
0.25μl
R(R’)
0.25μl
定量RT-PCR原理 PPT课件
确定足够的样品数，保证可对PCR扩 增产物量间差异进行统计分析。
非竞争性RT-PCR
目前主要采用荧光实时RT-PCR， 放射性标记核苷酸的方法已基本淘汰。
实时RT-PCR
实时RT-PCR就是在PCR扩增的每一个循 环后分别检测其PCR产量，借助计算机数据 处理，可以描绘出PCR扩增循环过程中PCR产 物变化曲线。
主要内容
1. Taqman探针原理 2. CT值和阈值的确定 3. ROX内参比荧光的作用 4. IPC内对照的作用
退火，开始延伸
Forward 5’Primer
3’
5’
TaqMan®
R Probe Q
5’
3’ 5’
Reverse Primer
替换
Forward
R
5’Primer
3’
5’
Q
5’
未知样品 标准品：产生标准曲线
内参比（Internal Standard）－ROX 校正样品管和加样误差
内对照（Internal Control）： 校正扩增效率的误差
+/-对照：检验试剂和仪器的可靠性 6次重复：满足统计学要求
多色荧光技术
准确的荧光定量要求ROX校正和IPC校正 检材和对照最好在同一反应管中，误差最小 多重检测要求仪器有多种荧光检测能力 只有ABI的仪器才具有四色检测能力：
William P. Halford:
是否只有竞争性RT-PCR才能精确定量？
竞争性RT-PCR
PCR的终产物量取决于靶序列与竞争性 序列量的起始比例。
理想情况下，靶序列与参照物以相同 的效率扩增，在琼脂糖凝胶电泳中区别开 。
竞争性RT-PCR
参照物片段分两类: - 同源性片段——与靶序列只有微小差 别
非竞争性RT-PCR
目前主要采用荧光实时RT-PCR， 放射性标记核苷酸的方法已基本淘汰。
实时RT-PCR
实时RT-PCR就是在PCR扩增的每一个循 环后分别检测其PCR产量，借助计算机数据 处理，可以描绘出PCR扩增循环过程中PCR产 物变化曲线。
主要内容
1. Taqman探针原理 2. CT值和阈值的确定 3. ROX内参比荧光的作用 4. IPC内对照的作用
退火，开始延伸
Forward 5’Primer
3’
5’
TaqMan®
R Probe Q
5’
3’ 5’
Reverse Primer
替换
Forward
R
5’Primer
3’
5’
Q
5’
未知样品 标准品：产生标准曲线
内参比（Internal Standard）－ROX 校正样品管和加样误差
内对照（Internal Control）： 校正扩增效率的误差
+/-对照：检验试剂和仪器的可靠性 6次重复：满足统计学要求
多色荧光技术
准确的荧光定量要求ROX校正和IPC校正 检材和对照最好在同一反应管中，误差最小 多重检测要求仪器有多种荧光检测能力 只有ABI的仪器才具有四色检测能力：
William P. Halford:
是否只有竞争性RT-PCR才能精确定量？
竞争性RT-PCR
PCR的终产物量取决于靶序列与竞争性 序列量的起始比例。
理想情况下，靶序列与参照物以相同 的效率扩增，在琼脂糖凝胶电泳中区别开 。
竞争性RT-PCR
参照物片段分两类: - 同源性片段——与靶序列只有微小差 别
RT-PCR及其产物电泳分析ppt课件
③ 延伸 延伸温度取决于DNA聚合酶的最适温度（70－75℃；延伸时间由扩增片段的长度 决定（＜500bp 30s,500-1200bp 40s）。
④ 循环次数 PCR循环次数取决于模板DNA的浓度，一般为25－35次，PCR产物可达最大值 。
20
;.
PCR体系的优化
➢ PCR反应成分浓度的优化 ① Taq DNA聚合酶：1～2.5U/100μL反应液。 ② dNTP浓度：20～200μmol/L，且四种底物浓度相等，以减少错误掺入的机
3
;.
RT反应试剂 （1）引物： Oligo(dT)16，寡聚胸甘酸16个，要求mRNA有poly(A)尾巴（mRNA 1-4%） （2）逆转录酶 ： 鼠白血病病毒莫洛尼株 （MMLV）、鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV ） （3）RT反应缓冲液：常用5×浓度。 （4）底物：即四种dNTP的混合物溶液，常用10×浓度（2 mmol/L或2.5 mmol/L）。 （5）模板 （6）RNasin
2
;.
实验原理
RT反应：在逆转录酶作用下，以mRNA为模板合成cDNA（complementary DNA）分子 的过程。 PCR反应：PCR扩增是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合酶在体外扩增一对引物 之间特异性DNA片段的方法。其主要热循环过程可分为三个步骤：（1）变性；（2）退 火；（3）延伸 。 RT-PCR: 以RT反应产物cDNA分子为模板进行特异性PCR扩增的过程，是检测基因表 达最常用的方法。
15
;.
结果分析
M
1 23
观察结果： ① 是否有扩增产物。 ②如有拖尾或有几条区带,说明有非特异性扩增 。 ③分子量标准电泳后区带是否分开。 ④与分子量标准比较，PCR产物的长度是否正确 。 ⑤PCR产物的产量。 ⑥引物二聚体。
④ 循环次数 PCR循环次数取决于模板DNA的浓度，一般为25－35次，PCR产物可达最大值 。
20
;.
PCR体系的优化
➢ PCR反应成分浓度的优化 ① Taq DNA聚合酶：1～2.5U/100μL反应液。 ② dNTP浓度：20～200μmol/L，且四种底物浓度相等，以减少错误掺入的机
3
;.
RT反应试剂 （1）引物： Oligo(dT)16，寡聚胸甘酸16个，要求mRNA有poly(A)尾巴（mRNA 1-4%） （2）逆转录酶 ： 鼠白血病病毒莫洛尼株 （MMLV）、鸟类成髓细胞瘤病毒（AMV ） （3）RT反应缓冲液：常用5×浓度。 （4）底物：即四种dNTP的混合物溶液，常用10×浓度（2 mmol/L或2.5 mmol/L）。 （5）模板 （6）RNasin
2
;.
实验原理
RT反应：在逆转录酶作用下，以mRNA为模板合成cDNA（complementary DNA）分子 的过程。 PCR反应：PCR扩增是模拟天然DNA复制过程，利用DNA聚合酶在体外扩增一对引物 之间特异性DNA片段的方法。其主要热循环过程可分为三个步骤：（1）变性；（2）退 火；（3）延伸 。 RT-PCR: 以RT反应产物cDNA分子为模板进行特异性PCR扩增的过程，是检测基因表 达最常用的方法。
15
;.
结果分析
M
1 23
观察结果： ① 是否有扩增产物。 ②如有拖尾或有几条区带,说明有非特异性扩增 。 ③分子量标准电泳后区带是否分开。 ④与分子量标准比较，PCR产物的长度是否正确 。 ⑤PCR产物的产量。 ⑥引物二聚体。
柯萨奇病毒的RT-PCR实验.ppt
cDNA于-20℃ 冰箱冻存。
聚合酶链反应（PCR） 配液：25ul体系
2×mix PrimerA(100ug/ml) PrimerS(100ug/ml) cDNA ddH2O
12.5 × 1ul× 1ul× 1ul× 9.5ul×
反应程序：
95℃ 95℃ 60℃ 72℃ 72℃ 4℃
5min 15sec 20sec 20sec 10min 保存
⑸缓冲溶液：保证DNA聚合酶催化时所需的适当的溶 液pH值
PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与 靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三 个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后， 使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成 为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单 链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列 配对结合； ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的 作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与 半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留 复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的 “半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因 扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决 于样品中模板的拷贝。
Types of RT-PCR Reactions
Standard RT-PCR usually with one-step (recommended)
– Sensitive and specific
RTPCR常见问题分析ppt课件
精选版课件ppt
26
问题五：信号高于预期，在低 于预期的循环中即可检出产物?
1、 反应中加的样品太多：降低模板的浓度。 2、 模板或PCR残余污染：隔离污染来源，更换试
剂，使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备 反应，使用抗气溶胶的吸头。
精选版课件ppt
27
问题六：电泳后出现意外的条带 RNA?
精选版课件ppt
19
1.引物和模版 的非特异性 退火
对策
1.避免引物3’端含有2 个到3个dG或dC’
2.在第一链合成中使用 基因特异性引物，而 不是随即引物或 oligo(dT)。
3.在开始几个循环使用 较高的退火温度，然 后使用较低的退火温 度。
4.使用热启动Taq DNA 酶进行PCR，提高反 应的特异性。
火的GSP;对于>1kb的RT-
PCR产物，保持反应温 度≤65℃。不要在高于 37℃时使用M-MLV;如 果不需要全长cDNA， 在第一链反应中使用
随机引物;
精选版课件ppt
13
7.引物或模板 对残余的RNA 模板敏感
8.靶序列在分 析的组织中不 表达
9.PCR没有起 作用
在PCR前用RNaseH处理。
30
问题九： 扩增产物滞留在加样 孔中
有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了 高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少 稀释100倍再进行二次扩增。
另外，在二次PCR时使用的退火温度如果比引物 的Tm值低5℃，可以将退火温度适当增高或进行 热启动以提高特异性
精选版课件ppt
31
Thank You!
精选版课件ppt
32
精选版课件ppt
33
rtqPCR实验操作 ppt课件
rtqPCR实验操作
荧光实时定量PCR rt-qPCR
定义
实时荧光定量PCR(rt-qPCR)： • 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号的变化对PCR过程进行 实时监控，以 此实现对初始模板的定量分析。
Rt-qPCR的应用
• mRNA表达的研究 • 微小残留病变的检测 • 肿瘤耐药基因表达的研究 • 病毒感染的定量监测
4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每 孔18.4微升，加完后rt按qPCR实排验操作板顺序加相应的前
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
rtqPCR实验操作
荧光定量PCR如何减小误差 1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
rtqPCR实验操作
1、校准生物学误差内参(管家基因)
rtqPCR实验操作
• 在相同的条件下，进行复制扩增，每扩增 一个循环，通过检验荧光来检测每个孔里 目标基因片段的含量，记录每个反应管内 的荧光信号达到设定的域值时所经历的循 环数（样本的域值循环数Ct），次数越多就 说明目标基因在原本的样品里越少，即初 始模板的量越少。
rtqPCR实验操作
logX= n (1+E)+logX0
rtqPCR实验操作
PCR基本原理
•试管中进行的DNA复制反应，依据
1.DNA半保留复制的机理
2.体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性 质
•通过人为控制体外合成系统的温度，使
1.双链DNA变成单链
2.单链DNA与人工合成的引物退火
3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链
DNA。
rtqPCR实验操作
• 生物学重复：样品三次重复 • 技术重复：每个样品做3-4个复
荧光实时定量PCR rt-qPCR
定义
实时荧光定量PCR(rt-qPCR)： • 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧 光信号的变化对PCR过程进行 实时监控，以 此实现对初始模板的定量分析。
Rt-qPCR的应用
• mRNA表达的研究 • 微小残留病变的检测 • 肿瘤耐药基因表达的研究 • 病毒感染的定量监测
4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每 孔18.4微升，加完后rt按qPCR实排验操作板顺序加相应的前
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
rtqPCR实验操作
荧光定量PCR如何减小误差 1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
rtqPCR实验操作
1、校准生物学误差内参(管家基因)
rtqPCR实验操作
• 在相同的条件下，进行复制扩增，每扩增 一个循环，通过检验荧光来检测每个孔里 目标基因片段的含量，记录每个反应管内 的荧光信号达到设定的域值时所经历的循 环数（样本的域值循环数Ct），次数越多就 说明目标基因在原本的样品里越少，即初 始模板的量越少。
rtqPCR实验操作
logX= n (1+E)+logX0
rtqPCR实验操作
PCR基本原理
•试管中进行的DNA复制反应，依据
1.DNA半保留复制的机理
2.体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性 质
•通过人为控制体外合成系统的温度，使
1.双链DNA变成单链
2.单链DNA与人工合成的引物退火
3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链
DNA。
rtqPCR实验操作
• 生物学重复：样品三次重复 • 技术重复：每个样品做3-4个复
RTPCR反转录原理及方法PPT资料【优选版】
RTPCRБайду номын сангаас转录原理及方法
优选RTPCR反转录原理及方法 Ppt
背景
基因的表达
基因组DNA (genomic DNA)
信使RNA (messenger RNA, mRNA)
蛋白质产物
不同细胞或组织表达不同的基因
目的
通过反转录(reverse transcription，RT) 和聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的方法，检测目的基因在 特定组织或细胞中、mRNA水平的表达丰度 。
通过反转录(reverse transcription，RT)和聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的方法，检测目的基因在特定组织或细胞中 、mRNA水平的表达丰度。
所需材料及试剂
二、实验器具的处理与准备 1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等） 先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其 中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再 烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次 2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC 水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再高压） 3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高温干烤
反应条件 ： 一9、5℃实5验分 器预具变性与材料： 9X742℃℃℃12、、433移吸000秒秒秒液头退变延枪：火性伸 1：ml1m、l、2002μ00μl、l、20μ20lμl、10μl、2μl 72℃3、7匀分 浆终管末延：伸 5ml
T1、RI细zo胞l法218抽×-3提16450循总、、7环R或N，E吸组AP4织℃管头1保0台：0温mg：、,加1、放mlT1置R0Iz01olμml吸l 头的一个，放置20μl吸头的一个 (细胞用1ml加6样、器试吹至剂液体瓶澄：清且2无个细6胞0团m块l匀的浆棕要彻色底，试后剂转至瓶EP管（）广口，带盖） 颠试Taq倒剂B混u匀ffe1r0下17浓个、，1度0室×1量温255筒分体m钟2积l：μ。l的(55μ白0l_m) 色l、终试1浓×25剂度0m瓶l（、放50无0m水l 乙醇） dNTP 81、0mM容量0瓶. ：250ml、500ml、1000ml 0琼 ，%脂将：糖温+热1的00凝91m胶、0l电、倒泳试入缓盐已管冲置水液好架，瓶梳微：子波：的5炉胶m2中膜5l火、0中3m，0秒l、在、至室2沸温05腾μ0下，0放熔ml置l化3各的0-4琼25脂m个i物n后备冷进却用行至电6，0泳℃。一时加个入1装0m无g/m水l溴化乙乙醇锭(G，old另en V一iew个) 5μ装l，充分混匀 cDNA (compDleEmPenCta水ry DNA) 323μ、、l 玻匀(1璃浆μl)制器品：11：（212.泡包、、酸括过剪铝塑夜 刀制料，、冲镊饭小洗子干）盒饭净先：盒，洗蒙净4：锡后个纸，1个烤再干高备温用干（烤DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再高压） 5M EDTA 201m3l？、pH大8. 瓷缸：2个 0蒸5×溜T水BE1（00贮011m存45l液、、）卷锡纸泊纸：2：卷一卷 再将5×TBE1稀6释、10倍三成角就可烧以在瓶电：泳时带使用盖（，即工稍作液大浓度），如取50ml贮存液+450ml水--→500ml工作缓冲液
优选RTPCR反转录原理及方法 Ppt
背景
基因的表达
基因组DNA (genomic DNA)
信使RNA (messenger RNA, mRNA)
蛋白质产物
不同细胞或组织表达不同的基因
目的
通过反转录(reverse transcription，RT) 和聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的方法，检测目的基因在 特定组织或细胞中、mRNA水平的表达丰度 。
通过反转录(reverse transcription，RT)和聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的方法，检测目的基因在特定组织或细胞中 、mRNA水平的表达丰度。
所需材料及试剂
二、实验器具的处理与准备 1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等） 先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其 中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再 烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次 2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC 水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再高压） 3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高温干烤
反应条件 ： 一9、5℃实5验分 器预具变性与材料： 9X742℃℃℃12、、433移吸000秒秒秒液头退变延枪：火性伸 1：ml1m、l、2002μ00μl、l、20μ20lμl、10μl、2μl 72℃3、7匀分 浆终管末延：伸 5ml
T1、RI细zo胞l法218抽×-3提16450循总、、7环R或N，E吸组AP4织℃管头1保0台：0温mg：、,加1、放mlT1置R0Iz01olμml吸l 头的一个，放置20μl吸头的一个 (细胞用1ml加6样、器试吹至剂液体瓶澄：清且2无个细6胞0团m块l匀的浆棕要彻色底，试后剂转至瓶EP管（）广口，带盖） 颠试Taq倒剂B混u匀ffe1r0下17浓个、，1度0室×1量温255筒分体m钟2积l：μ。l的(55μ白0l_m) 色l、终试1浓×25剂度0m瓶l（、放50无0m水l 乙醇） dNTP 81、0mM容量0瓶. ：250ml、500ml、1000ml 0琼 ，%脂将：糖温+热1的00凝91m胶、0l电、倒泳试入缓盐已管冲置水液好架，瓶梳微：子波：的5炉胶m2中膜5l火、0中3m，0秒l、在、至室2沸温05腾μ0下，0放熔ml置l化3各的0-4琼25脂m个i物n后备冷进却用行至电6，0泳℃。一时加个入1装0m无g/m水l溴化乙乙醇锭(G，old另en V一iew个) 5μ装l，充分混匀 cDNA (compDleEmPenCta水ry DNA) 323μ、、l 玻匀(1璃浆μl)制器品：11：（212.泡包、、酸括过剪铝塑夜 刀制料，、冲镊饭小洗子干）盒饭净先：盒，洗蒙净4：锡后个纸，1个烤再干高备温用干（烤DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再高压） 5M EDTA 201m3l？、pH大8. 瓷缸：2个 0蒸5×溜T水BE1（00贮011m存45l液、、）卷锡纸泊纸：2：卷一卷 再将5×TBE1稀6释、10倍三成角就可烧以在瓶电：泳时带使用盖（，即工稍作液大浓度），如取50ml贮存液+450ml水--→500ml工作缓冲液
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
• Real-time定量PCR仪是在PCR反应体系中加入荧光 基团，利用荧光信号累积实时监测和连续地分析 整个PCR进程，随着反应时间的进行，监测到的荧 光信号的变化可以绘制成一条曲线，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量的分析。
rt-qPCR实验操作
G r e e n
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位，只有和 双链DNA结合后才发出荧光，DNA双链分开就不发 出荧光，随PCR循环数的增加，产物量的增多，产生 的荧光信号逐渐增强，实现了荧光信号与产物量的关 联。
•病毒感染的定量监测
rt-qPCR实验操作
基 本 原 理•试管中进行的DNA复制反应，依据
1.DNA半保留复制的机理 2.体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质 •通过人为控制体外合成系统的温度，使 1.双链DNA变成单链 2.单链DNA与人工合成的引物退火 3.DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。
5、贴膜，离心，上机，Real Time PCR扩增结束后 输出对照组和待测组的rt-目qPCR的实验基操作 因及内参基因的CT值。
即实验组基因表达相较于对 照组上调或下调的倍数。
rt-qPCR实验操作
荧光定量PCR如何减小误差
1、校准生物学误差：内参(管家基因) 2、降低随机误差
rt-qPCR实验操作
荧光实时定量PCR rt-qPCR
rt-qPCR实验操作
定义 实时荧光定量PCR(rt-qPCR)： • 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信 号的变化对PCR过程进行 实时监控，以此实现对初 始模板的定量分析。
rt-qPCR实验操作
C R 的•mRNA表达的研究 应用••微肿小 瘤残 耐留 药病 基变 因的 表检达测的研究
3、计算样本混合物（每个孔加sybr10ul、 cDNA30ug、水8.4ul-cDNA），前后引物的量（每 个孔加前后引物各0.8ul），多算1到2孔。按比例混 合样本，sybr，水。按比例混合前后引物。
4、按照排板的顺序往板内加样本混合物，每孔18.4 微升，加完后按排板顺序加相应的前后引物混合物， 每孔1.6微升。
rt-qPCR实验操作
• 基本步骤 • 变性：加热使双链DNA变为单链（94℃，30s） • 退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链
（55℃，30s） • 延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物
为起始点的延伸反应（70~72℃，30~60s）
rt-qPCR实验操作
意 图
rt-qPCR实验操作
1、校准生物学误差内参(管家基因)
内参基因(Endogenous Control) 用于校准实验过程中样品本身对定量结果的影响
原因：核酸提取时通常以重量，体积或细胞数为单位 取
样，提取过程中存在得率差异和操作误差，造 成
等量样品不一定获得等量提取物 目的：将定量结果校准为以基因组（或单个细胞）为
单位，不同样品之间才具有可比性 校准方法：[目的基因]-[r内t-qPC参R实验]操=作均一化的目的基因表达
•在 相 同 的 条 件 下 ， 进 行 复 制 扩 增 ， 每 扩 增
rt-qPCR实验操作
logX= n (1+E)+logX0
rt-qPCR实验操作
步 骤
1、把要测的RNA逆转录为cDNA，决定要跑的基因 和使用的内参序列，排好板的顺序。
2、准备好DNA样本，水，sybr，前后引物，融化， 离心。
2、降低随机误差: 重复实验
• 生物学重复：样品三次重复 • 技术重复：每个样品做3-4个复孔
rt-qPCR实验操作
谢谢！
rt-qPCR实验操作
rt-qPCR实验操作
Байду номын сангаас
• 理论上来说，PCR反应过程中生成的DNA产物是呈 指数方式增加的，即每增加一个循环，PCR产物加 倍。但随着反应循环数的增加，产物积累、原料 消耗，最终PCR反应无法继续维持指数方式的扩增， 而进入线性期和平台期。整个PCR反应过程中，只 有在指数期，PCR产物的量与加入的初始模板量存 在明确的数学关系（PCR产物量=初始模板量×2^N， N=循环数），因此，利用公式，可以由产物的量 精确推算出初始模板量的多少。而在线性期和平 台期，PCR产物量和初始模板量之间不存在准确的 数学关系，由这两个时期的产物量来推算初始模 板量的多少是不准确的rt-qP。CR实验操作