胎兔皮肤组织蛋白质组双向电泳技术的建立与分析
《双向电泳技术》课件
高通量
该技术可以同时分离大量蛋白质，提高了实 验的通量。
高稳定性
该技术具有较高的稳定性，实验结果重复性 好。
缺点
实验周期长
双向电泳技术的实验周期较长 ，需要耗费较多的时间和人力
。
对样品要求高
该技术需要大量的起始样品， 并且对样品的纯度要求较高。
对实验条件要求严格
双向电泳技术的实验条件较为 苛刻，需要精确控制实验参数 。
在药物研发中的应用
总结词
双向电泳技术为药物研发提供了高通量和高效率的蛋白质分离手段，有助于发现潜在的药物靶点和筛 选候选药物。
详细描述
在药物研发过程中，双向电泳技术可用于分析药物对蛋白质表达谱的影响，从而发现药物作用的靶点 。此外，通过比较不同物种或组织的蛋白质表达谱，可以发现潜在的药物靶点，为新药研发提供思路 和候选药物。
应用领域的拓展
疾病诊断与治疗
利用双向电泳技术分析疾病相关蛋白质，为疾病诊断 和治疗提供依据。
药物研发
通过双向电泳技术筛选药物作用靶点，加速新药研发 进程。
生物工程与农业
在生物工程和农业领域中应用双向电泳技术，优化生 物过程和育种。
未来发展方向与挑战
标准化与规范化
建立双向电泳技术的标准化操作流程和质量控制体系，提高实验 结果的可靠性和可比性。
CHAPTER 02
双向电泳技术的实验流程
样本制备
01
02
03
样本选择与处理
选择适当的组织或细胞样 本，进行适当的处理以提 取蛋白质。
蛋白提取
使用适当的缓冲液和试剂 ，从样本中提取蛋白质。
蛋白定量
使用蛋白质定量方法，确 定蛋白质的浓度。
蛋白质提取
溶解蛋白质
家兔血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立
家兔血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立要瑞莉;张明顺;李宏杰;董淑云;王世鑫;冯桂玲【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2009(013)028【摘要】BACKGROUND: Rabbit serum samples are widely used in basic researches, and two-dimensional gelelectrophoresis (2-DE) is the most classic technique for protein separation. Therefore, it is of great significance to establish a stable technique system of 2-DE for rabbit serum.OBJECTIVE: To establish a 2-DE technique system for rabbit serum protein separation. DESIGN, TIME AND SETTING: A single sample observational experiment was performed at Tianjin Key Laboratory of Biomarkers for Occupational and Environmental Hazard of Chinese People's Armed Police Forces Medical College from June to July in 2008. MATERIALS: Six healthy rabbits were provided by the Animal Experimental Center of Tangshan Vocational Technical College METHODS: Health rabbit serum was dissolved in rehydration sample loading buffer before and after eliminating high abundance proteins to make proteins in it schizolysis adequately. After reductive alkylation, the samples were loaded into the rehydration tray to undergo passive rehydration for 14 hours. Isoelectric focusing (IEF) electrophoresis was followed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). After sliver staining, the gel was analyzed by PDQuest7.4. MAIN OUTCOME MEASURES: ①Efficiencyof eliminating high abundance proteins. ②Two-dimensional eleotrophoregrams (2-D electrophoregrams)RESULTS: Distinct 2-D eleotrophoregrems were obtained with high resolution and good reproducibility. The removal of high abundance proteins in serum failed to result in better 2-D electrophoregrams.CONCLUSION: We have successfully established a 2-DE technique for rabbit serum proteome, which can lay the foundation for the further study of serum proteomics of diseases.%背景:家兔血清是基础研究中常用的实验样品,双向凝胶电泳是蛋白质组学中最经典的蛋白分离技术,因此建立稳定的家兔血清蛋白质组双向凝胶电泳技术体系非常重要.目的:建立家兔血清蛋白分离的双向凝胶电泳技术体系.设计、时间及地点:单一样本观察,实验于2008-06/07在武警医学院天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室完成.材料:健康家兔6只,由唐山市职业技术学院动物中心提供.方法:去除高丰度蛋白前后的健康家兔血清样品,分别加入水化上样液使样品中的蛋白充分裂解,还原烷基化后上样,被动水化14 h.等电聚焦电泳后进行SDS-PAGE电泳.凝胶银染后用PDQuest7.4软件进行分析.主要观察指标:①高丰度蛋白去除效率.②2-DE图谱.结果:双向电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好.未去除高丰度蛋白的血清2-DE图效果优于去除高丰度蛋白后的血清2-DE图.结论:成功建立家兔血清蛋白质双向凝胶电泳技术,将为进一步开展疾病的血清蛋白质组学研究奠定基础.【总页数】4页(P5440-5443)【作者】要瑞莉;张明顺;李宏杰;董淑云;王世鑫;冯桂玲【作者单位】唐山职业技术学院基础医学部,河北省唐山市063004;武警医学院天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室,天津市300162;华北煤炭医学院基础部病理生理教研室,河北省唐山63000;华北煤炭医学院基础部病理生理教研室,河北省唐山63000;武警医学院天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室,天津市300162;唐山职业技术学院基础医学部,河北省唐山市063004【正文语种】中文【中图分类】R341【相关文献】1.血清蛋白质组双向凝胶电泳技术优化 [J], 董红;王世鑫;罗来龙;栾大伟2.寻常型银屑病血清蛋白质组学研究中双向凝胶电泳-质谱技术的初步建立 [J], 刘占奎;谭升顺;于春水;樊靖华;白转丽;李俊杰3.优化并建立双向凝胶电泳初步研究糖尿病视网膜病变血清蛋白质组 [J], 李俊;贾丽丽;陆琳娜;王悦4.血清蛋白质组双向凝胶电泳技术优化 [J], 张明顺;李雪华;兰晓霞;栾大伟;赵化冰;王世鑫5.血清蛋白质组双向凝胶电泳技术的建立 [J], 李雪华;李欣;丁彦青因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
胎兔皮肤无瘢痕愈合相关蛋白的筛选与初步分析
胎兔皮肤无瘢痕愈合相关蛋白的筛选与初步分析李杨目的：筛选胎兔皮肤组织无瘢痕愈合相关蛋白，并初步分析其在无瘢痕愈合过程中的作用。
方法：建立胎兔背部切割伤模型，运用蛋白质组双向电泳技术筛选胎兔皮肤伤后差异表达的蛋白质，并进行质谱和数据库检索分析。
结果：筛选出20个在伤后胎兔皮肤组织中特异高表达的蛋白质点，经过质谱和数据库检索分析后确定：伴侣素或线粒体蛋白P1前体、弹性蛋白(Vi－mentin，Vim)、微管蛋白β多肽、核不均一核糖核蛋白H(异质性胞核核糖核蛋白H)、α烯醇酶(α－磷酸丙酮酸水合酶)等无瘢痕愈合相关蛋白在胎兔皮肤伤后表达增加。
结论：上述无瘢痕愈合相关蛋白可能通过对基因转录和翻译的调控，促进胶原蛋白等的合成和正确的折叠、装配，以及促进细胞的增殖、分化和发育等，促进胎兔皮肤创伤的修复，参与其无瘢痕愈合过程。
标签：胎兔；皮肤；无瘢痕愈合；创伤：蛋白质组；基质辅助的激光解析电离／飞行时间质谱自Burrington首次发现胎儿皮肤创伤后修复无瘢痕形成，并确立了“无瘢痕愈合”(Scarless Healing、Scar-free Healing)的概念以来，“无瘢痕愈合”模式成为人们孜孜以求的理想，但至今胚胎个体“无瘢痕愈合”的具体机制还不清楚。
我们在前期的研究中发现在胎兔皮肤创伤无瘢痕愈合过程中确有基因表达的差异存在，且差异表达基因可能在其过程中具有重要的作用。
而基因最终是通过蛋白质的表达才发挥其功能，本实验运用双向电泳技术，筛选胎兔皮肤无瘢痕愈合相关蛋白，并进行初步分析。
1材料和方法1．1动物与试剂：健康雌性大耳白兔20只，体重(3．0～3．5)kg(第三军医大学大坪医院动物中心)，“速眠新”合剂(长春农牧大学兽医研究所)，哺乳动物总蛋白提取试剂盒(Merck公司)，pH4-7、11cm固相pH梯度(Immoblilized pH gradient，IPG)预制胶条(Bio-Rad公司)，银染增强型试剂盒(Bio-Rad公司)。
双向电泳
双向电泳的应用及研究进展摘要:双向电泳是蛋白质组学研究中最常用的技术,具有简便、快速、高分辨率和重复性等优点。
本文重点介绍了双向电泳的基本原理及其应用。
同时对当前双向电泳技术面临的挑战和发展前景进行了讨论。
关键词: 双向电泳，应用，前景1.1双向电泳技术概述双向电泳（two-dimensional gel electrophoresis, 2-DE）是蛋白分离的黄金标准，由此可以分析生物样品的显著差别，产生的结果用于诊断疾病、发现新的药物靶标和分析潜在的环境和药物的毒性。
双向电泳分离技术利用复杂蛋白混合物中单个组分的电泳迁移，第一向通过电荷的不同分离，另一向通过质量的不同分离。
双向电泳协同质谱技术是正在出现的蛋白组学领域的中心技术。
双向电泳是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。
双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撑技术。
可见双向电泳在蛋白质组学研究中的重要性。
就像Fey和Larsen在他们的综述中提到：“尽管人们都想有新技术取代它，可是如果希望对细胞活动有全面的认识，其他技术无法在分辨率和灵敏度上与双向电泳相媲美”。
1.2双向电泳基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术[1],双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质群的技术。
双向电泳技术依据两个不同的物理化学原理分离蛋白质。
第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。
在此基础上进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子量的不同将之分离。
双向电泳所得结果的斑点序列都对应着样品中的单一蛋白。
因此，上千种蛋白质均能被分离开来，并且各种蛋白质的等电点，分子量和含量的信息都能得到。
双向电泳技术在蛋白质组研究中的应用体会
像分析系统 。还应该强调分析 中是否进行了光密度 的校准 和空 间的标定以及 ＭＯ Ｄ的计算 方法 ， 以便 其他 科研 工作 者能够判 断测量结果 的精度 和客观性 。此外在科研实验 中不 能片面地夸 大计算机图像分 析的作用 ， 要注意样本 的代表性和随机性 ， 选择 合适的参数 ， 并保证实验条件和分析步骤完全统一 。
参 考 文 献
个 实 验 的 所 有 图 片手 工 进 行 上 述 的 分 析 步 骤 极 为 烦 琐 ，
并要保持 统 一 的标 准尤 为 困 难。这 就需 要进 行 批 处 理 ， 宏 即 （ ｃｏ 功能 ， Ｍａｒ） 该功能 由图像 分析软件提 供 ， 操作 中不受人 为 在
因素 的干 扰 ， 主要 步 骤 是 将 测 量 参 数 、 图像 分 割 阈 值 分 别 保 存 为
Ｄ － ｂ ｌ ｉ ｕ ｏ ｍｍｕ ｏ ｉ ｏｈｍｉ ｌｑ ａ ｔｉ ｔ ｎ［ ］ Ｊ ＡＢｌ ｅｅ ｔｓ ｅｆｒｉ ｎ ｈｓ ｃｅ ｃ ｕｎｉｃ ｉ Ｊ． ａ ｄ ｓ ｔ ａ ｆａ ｏ
Ｈｉ ｔ ｃ ｍ ｔ ｃ ｅ ，２ ０ ５ （ ） ５ ８ ． ｓｏ ｈｅ Ｃｙ ｏ ｈ ｍ ０ ３， １ ５ ： ７５ ５ ４
最后聚焦结束为36000v1124胶条的平衡重泡胀和等电聚焦结束后用四蒸水打湿的滤纸充分吸干胶条上的矿物油和多余的样品把胶条放入平衡液i胶条平衡缓冲液母液10mldtt03g中于摇床摇振15rain再于平衡液胶条平衡缓冲液母液10iill碘乙酰胺0375g中摇床摇振15min25第二向电泳sdpage用滤纸吸去胶条上多余的水化液及样品将胶条转移至事先制好的聚丙烯酰胺凝胶上转移时注意胶条支持膜紧贴长玻板胶面朝向短玻板
双向电泳操作步骤
双向电泳操作步骤双向电泳是一种常用的蛋白质分离和纯化方法。
下面是一篇超过1200字的双向电泳操作步骤：双向电泳是一种通过两个不同方向的电场来进行蛋白质分离的方法。
它可以更好地区分具有不同等电点和分子质量的蛋白质，并用于研究蛋白质组学以及生物化学等领域。
以下是一般的双向电泳操作步骤：1.确保准备充足的电泳装置，包括双向电泳槽、平衡缓冲液、电泳缓冲液、电泳细胞等。
2.准备样品：将待分离的蛋白质样品进行适当的前处理，包括样品提取、蛋白质浓缩、去除干扰物等。
将样品溶解在适当的电泳缓冲液中。
3.将样品加载到电泳槽中：在准备好的电泳缓冲液中加入样品，然后将样品加载到电泳槽中的样品孔中。
注意，为了保持电泳稳定性，在样品孔加载样品后，要尽快将缓冲液加入到其他储备槽以保持全面和均匀的电解质浓度。
4.进行等电点电泳：将电泳槽中的样品浸没在平衡缓冲液中，并在两侧分别连接正负极。
设置合适的电流和电压，开始进行等电点电泳。
在等电点电泳过程中，蛋白质根据它们的等电点被定向地分离。
5.停止等电点电泳：根据需要进行电泳时间的设定，一般情况下为2-3小时。
等电点电泳时间结束后，关闭电源，并小心地取出电泳舱。
6.水平电泳：停止等电点电泳后，将样品塘从上清洗掉，并用水平电泳缓冲液进行冲洗。
然后，在两侧连接正负极，设置合适的电流和电压，开始水平电泳。
在水平电泳过程中，蛋白质根据它们的分子质量被定向地分离。
7.停止水平电泳：根据需要进行电泳时间的设定，一般情况下为4-5小时。
水平电泳时间结束后，关闭电源，并小心地取出电泳舱。
8.染色和图像采集：将分离完毕的样品进行染色，常用的染色方法包括银染和荧光染色。
然后，使用图像采集系统获取电泳图像，可根据需要调整采集参数。
9.数据分析和解释：通过对电泳图像的分析，包括珠状图、分子质量标准物的修正和待测蛋白质的标定等，将分离出来的蛋白质鉴定和定位。
10. 验证和验证：对其中感兴趣的蛋白质进行验证和验证。
蛋白质组学研究中双向电泳技术的应用
胶中或膜上切取这些 目标蛋 白质作鉴定。现在绝 大多数蛋白质的鉴定是通过质谱分析来完成 的。
丙烯 酰胺 共 价聚 合而 成 ＩＧ胶 条 ，其 优势 主要 Ｐ 有 ［ ：ｐ ６ Ｈ梯度稳定 ，聚焦准确 ，精度高 ，梯度分 ］ 辨率可 达 ００ １Ｈ ． ｐ ；无 阴极漂移及碱性蛋 白丢失 ０
在主要和通用的一向等电聚焦方式［ 。 引
２ ３ 第二 向 电泳 ．
寻找和预分离未知蛋白及其翻译后修饰形式 （ ￣ ｔｓ ｘｔ
—
ｔｍｌ—ｔｎｌｍ ｄ ｅ ｒｓ ｌ ）的方 法 ｏ ｒ ａ ｉ ａｙ ｏｉ ｄｆｍ ，ｅ＇ ａ ｏ ｌ ｉ ｆ ｏ Ｍｓ
第二向是十二烷基磺酸钠 一聚丙烯酰胺凝胶
泳 ，进 行染 色 。 目前 实 验 室 最 常用 的显 色 方 法 是
第一向是等点聚焦电泳 ，根据一 向等 电聚焦
方 式 的不 同 ，可 将 双 向 电泳 分 为 ３种 系统 ： （ ） １
ＩＯ—Ｄ Ｌ （ｓ Ｓ ＡＴ ｉ ｏ—ｅ ｃ ｉ ｆ ｕｉ ｆｌ ｅ 锄 ・ ｌ ｔｃ ｏ ｓ ｇ ｌｗ ｄ ｂ ｅ ｒ ｃ ｎ ｏｏ ｔ ｎ ｉ ｒｓｅｔｍｏ ｕａｎｓ ｘｒ ｓｄ ａ ｏｓ 系 ｉ ｗｔ ｅｐｃｔ ｌ ｌ ａｓｅｐｅ ｅｉ ｄｌ ｎ ） ｏ ｈ ｏ ｅ ｎ ｃ ｓ ｎ ｔ
（ｎ ｎ — ｅ ｕ ｉｒ ｍ ｐ ｇａｉ ｔ ｅ ｃ ｏｈｒｓ ， ｏ ｑ ｉｂｉ ｌ ｕ Ｈ ｒ ｅ ｌ ｔｐｏ ｉ ｄｎ ｅｒ ｅｓ
Ｎ Ｐ Ｇ ）系 统 ，主 要 用 于 分 离 碱 性 蛋 白质 ，但 ＥＨ Ｅ 如果 聚焦 达到 平 衡 状 态 ，碱 性 蛋 白会 离 开 凝胶 基
概 念 出现之前 ，免 疫印迹 法就 已得 到广 泛 的应 用 。
方法与生物质谱技术 的不断进步，以及两者有效 的结合 ，使研究人员能够更加有效地分离蛋 白质
《蛋白质双向电泳》课件
目录 Contents
• 蛋白质双向电泳概述 • 实验流程与技术 • 双向电泳的优缺点 • 双向电泳的应用实例 • 未来展望与研究方向
01
蛋白质双向电泳概述
定义与原理
定义
蛋白质双向电泳是一种分离和鉴定蛋白质混合物的技术，通过两次不同pH值 的电泳分离蛋白质。
原理
利用蛋白质的电荷和分子量差异，在电场中实现分离。在第一向电泳中，蛋白 质根据等电点不同被分离；在第二向电泳中，蛋白质根据分子量被分离。
蛋白质组学与其他技术的结合
与质谱技术联用
01
将蛋白质双向电泳技术与质谱技术联用，实现蛋白质
的精准鉴定和定量分析。
与基因组学、代谢组学等多学科交叉
02 将蛋白质双Hale Waihona Puke 电泳技术与基因组学、代谢组学等多学
科交叉，全面解析生命活动的调控机制。
与单细胞技术结合
03
将蛋白质双向电泳技术与单细胞技术结合，揭示单个
蛋白质定量
选择合适的蛋白质定量方法：如BCA 法、Lowry法等，确保准确性。
按照定量方法操作步骤进行定量，记 录数据并进行分析。
蛋白质溶解与分离
溶解蛋白质
将蛋白质样品溶解于适当的缓冲液中 ，以便进行电泳分离。
电泳分离
将溶解的蛋白质样品进行等电聚焦电 泳和SDS-PAGE电泳，实现蛋白质的 分离。
凝胶染色与图像分析
凝胶染色
采用银染、考马斯亮蓝染色等方法对凝胶上的蛋白质进行染 色。
图像分析
对染色后的凝胶进行拍照，并利用相关软件进行蛋白质点的 检测、匹配和比较分析。
03
双向电泳的优缺点
优点
高分辨率
双向电泳可以根据蛋白质的等电 点和分子量进行分离，具有较高 的分辨率，能够分离出更多的蛋 白质。
蛋白质双向电泳简介
样品中核酸的去除
对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成 复合物后会出现假象迁移和条纹。 解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切 酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质 （SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通 过超速离心来去除复合物。
注意事项
双向电泳的最关键步骤之一
制备原则：尽可能多地提取出总蛋白质，尽 可能简单的操作步骤，注意防止样品提取过 程中的各种化学修饰，去除样品中核酸、盐 离子等干扰物质
蛋白质组学（proteomics）
概念：是从整体角度分析生物体蛋白质组动态变 化的一门科学
研究内容：蛋白质的识别、定量；蛋白质的定位、 修饰；蛋白质之间的相互作用并根据这些研究最 终确定它们的功能
仪器设备
原理
双向电泳是指利用蛋白质的带电性和分子量大 小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质 群的技术。双向电泳技术依据两个不同的物理 化学原理分离蛋白质。第一向电泳依据蛋白质 的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷 的蛋白质进行分离。在此基础上进行第二向的 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,它依据蛋白质分子 量的不同将之分离。
通过细胞破碎方法从原材料中提取粗蛋白质, 然后用含变性剂(或离液剂)、去污剂和还原剂 的裂解液溶解蛋白并使其变性。提取的蛋白可 用裂解液稀释。裂解液也可结合IPG胶条上基 质以维持IEF期间的蛋白质的稳定性。变性剂 尿素和硫脲与IEF兼容。用高浓度的变性剂以 打断蛋白质样品中的氢键结构。使用非离子型 或两性去污剂以破坏疏水交互作用。
IPG 胶的水合及上样
2-DE 样品
水合溶液
IPG 胶条支或 CHAPS
2%
IPG缓冲液 (两亲性电解液)
0.28% DTT
微量 溴酚蓝
IPG 胶条 定位
蛋白质双向凝胶电泳操作经验及解析
蛋白平衡操作细节
¾ 等电聚焦完成后的胶条可以马上进行平衡，也可以用保鲜膜包裹 后放在-80度条件下长期保存 ¾ 胶条平衡前用半干滤纸吸取胶面上的覆盖油和多余样品，可以有 效减少纵条纹的产生 ¾平衡两次，每次15分钟，时间太短会导致平衡不充分，影响蛋白 分离效果，太长则会引起蛋白丢失 ¾ 可以采用丙烯酰胺替代IAA进行第二步平衡操作，效果也不错 ¾ 平衡缓冲液体积需足量且淹没整根胶条 ¾ 平衡后将胶条在电泳缓冲液中浸泡一下有助于蛋白更好地向第二 向胶转移
表：参考上样量(材料为无明显高丰度蛋白的样品、胶条长度24cm)
pH范围 3-10
4-7
染色方法 银染 考染 银染 考染
上样量(ug) 150-300 500-1000 200-400 1000-1500
胶条与两性电解质的对应关系
常用非线性胶条的pH分布规律
等电聚焦操作细节
¾ 胶条从冰箱中取出后需在室温平衡10分钟才可使用 ¾ 蛋白溶液在上样前需充分离心以去除不溶性杂质 ¾ 加入蛋白溶液时，尽量使溶液保持连贯，并避免气泡产生 ¾ 蛋白溶液体积要足量以免水化不充分 ¾ 放入胶条时需从一端开始缓慢连续放入，避免气泡产生，如有气 泡可通过缓慢来回拖动胶条将气泡赶走 ¾ 设置缓慢升压步骤有利于除盐和除杂 ¾ 夏天空气湿度过大时注意及时除湿
蛋白提取常见问题实例
症 状：出现连续横向拖尾 可能原因：蛋白溶解不充分 改 进：选用蛋白溶解性强的裂解液，上样前充分离心
蛋白提取常见问题实例
症 状：蛋白出现在低分子量区域 可能原因：蛋白提取过程中的蛋白降解 改 进：注意获取样品后及时冷冻保存，样品提取过程中注意低温， 裂解液中添加蛋白酶抑制剂
目录
双向电泳操作常见问题实例
症 状：整体出现纵向拖尾 可能原因：TEMED过期失效或不足量 改 进：加入足量并且有效的TEMED
双向电泳技术研究进展
双向电泳技术研究进展摘要：双向电泳(two dimensional electrophoresis , 2-DE)技术是获得细胞、组织或器官等蛋白表达图谱的主要手段，是蛋白质组学研究的三大核心技术之一。
本文主要从双向电泳技术的发展，主要操作步骤及其面临的主要挑战等方面对改技术的研究进展进行综述。
关键词：双向电泳；研究1.双向电泳技术的发展蛋白质双向电泳源于1975年O,Farrell. Klose.Scheele 对大肠杆菌、老鼠及几尼猪蛋白质的研究。
它首先根据样品中蛋白质等电点不同进行等电聚焦(IEF)作为第l向，然后再按照蛋白质分子量大小不同进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS -PAGE)作为第2向，经染色后可以在凝胶上得到大量的蛋白质点，从而得到样品的蛋白质表达图谱。
根据双向电泳中第l向等电聚焦方法的不同，双向电泳主要分为2个主要类型，ISO-DALT(等电点一道尔顿)IPG．DALT ( 固相pH梯度一道尔顿)双向电泳。
1.1 ISO-DALT双向电泳技术传统的ISO-DALT双向电泳中，首先将载体两性电解质添加在丙烯酰胺凝胶中，凝胶聚合后在电场作用下形成连续的DH值梯度，两性电解质以游离的形式分布于聚丙烯酰胺凝胶的网孔中。
通常采用圆柱状电泳，IEF凝胶制备在圆柱型玻璃管中，可以将样品加在未凝固的凝胶溶液中，也可在凝胶凝固后在玻璃管顶端加样，然后进行等电聚焦，通常在50～100V电压下聚焦1～2 h，让样品进入IEF胶条，然后在200 ～400V或更高电压下进行聚焦，直到电流接近零时为止。
等电聚焦结束后取下凝胶柱，向玻璃管中凝胶与管壁间注水，将凝胶条吹出，用缓冲液平衡凝胶条，主要目的是充分打断多肽链间及多肽链内部的二硫键并使其与SDS充分结合，然后将胶条用琼脂包埋于第2向电泳的凝胶板中，进行第2向SDS-PAGE，SDS-PAGE 可以使用均一的分离胶浓度，也可采用不连续梯度胶或者连续梯度胶。
双向电泳法
双向电泳法双向电泳法（Bidimensional Electrophoresis，2-DE）是一种常用的蛋白质分离技术，可以同时分析样品中上千种蛋白质。
本文将详细介绍双向电泳法的原理、步骤和应用。
原理双向电泳法结合了等电聚焦（IEF）和SDS-PAGE两种技术，通过两个维度的分离将复杂的蛋白质混合物分解为一系列单独的斑点。
在第一维度中，根据蛋白质的等电点（pI）进行分离；在第二维度中，根据蛋白质的分子量进行分离。
通过将这两个维度的分离结果叠加，可以获得高分辨率的蛋白质图谱。
双向电泳法的关键步骤如下：1.等电聚焦（IEF）：在第一维度中，使用等电聚焦技术将样品中的蛋白质按照其等电点进行分离。
等电聚焦是一种基于蛋白质在电场中向氧化物离子（OH-）或氢离子（H+）方向移动的分离方法。
在等电聚焦过程中，蛋白质会在pH梯度中向其等电点迁移，直到净电荷为零。
通过控制pH梯度和应用的电压，可以将蛋白质在等电聚焦过程中分离开。
2.SDS-PAGE分离：在第二维度中，将第一维度的等电聚焦凝胶与SDS-PAGE凝胶垂直叠加。
在SDS-PAGE凝胶中，蛋白质通过聚丙烯酰胺凝胶的孔隙随着电场的作用向阳极迁移。
由于SDS（十二烷基硫酸钠）的存在，蛋白质在SDS-PAGE凝胶中的迁移速度与其分子量成反比。
因此，蛋白质在SDS-PAGE 凝胶中会根据其分子量进行分离。
3.染色和分析：经过双向电泳分离后，凝胶可以通过染色方法显示出一系列斑点，每个斑点代表一个蛋白质。
常用的染色方法包括银染法、荧光染色、贵金属染色等。
对于银染法，它在灵敏度和线性范围上具有优势。
染色后可以使用成像设备捕捉图像并进行定量分析。
通过对斑点的比较和定量，可以识别不同样品之间的差异和变化。
步骤双向电泳法的步骤如下：1.样品制备：将待分析的生物样品（如细胞提取物）进行蛋白质提取，并使得蛋白质在石蜡中可溶解。
常用的方法包括总蛋白提取、亲和层析、激光捕获等。
2.等电聚焦（IEF）：将蛋白质样品与具有连续pH梯度的凝胶进行接触。
兔子宫内膜组织的双向电泳
兔子宫内膜组织的双向电泳
王水莲;薛立群;刘自逵
【期刊名称】《中国兽医学报》
【年(卷),期】2006(26)4
【摘要】为了有效地研究胚泡附植的分子机制,本研究建立了一套适合兔子宫内膜蛋白分析的双向电泳技术体系,包括蛋白质含量测定、第1向IEF-PAGE和第2向SDS-PAGE的凝胶配方及电泳参数的选择、电极溶液的选择,并运用该技术体系分析了未孕兔和受孕2、4、6、9 d兔子宫内膜蛋白。
结果表明,在给定的时期内,兔子宫内膜蛋白质的含量有变化,但差异不显著;用所建立的双向电泳体系分析子宫内膜蛋白质后发现,双向电泳图谱的重复性好,蛋白质点的分辨率高,共同蛋白质点多,差异蛋白质点少。
【总页数】4页(P451-453)
【关键词】兔;子宫内膜;蛋白质;双向电泳;附植
【作者】王水莲;薛立群;刘自逵
【作者单位】湖南农业大学动物医学院
【正文语种】中文
【中图分类】S858.291
【相关文献】
1.兔股骨头蛋白质双向电泳样品制备方法的比较 [J], 胡峰;赵劲民;李晓峰;梁晓南;陆荣斌
2.兔晶状体蛋白质组的双向电泳和质谱鉴定研究 [J], 刘奕志;张敏;柳夏林;黄强;刘欣华;夏朝霞;吴明星
3.应用双向电泳、免疫印迹和质谱技术筛选子宫内膜异位症标志物 [J], 张虹;牛屹东;冯捷;郭慧方;叶雪
4.18例子宫内膜间质肉瘤的组织学和兔疫组织化学研究 [J], 丁长林;米粲;李圆圆因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
双向电泳操作双向电泳的技术流程和样品制备ppt课件
第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽 提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的 11%（W/W）。
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
增加样品溶解性的手段
变性剂：通过改变溶液中的氢键结构使蛋白质充分伸 展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能 量域。其典型代表是尿素和硫尿。
双向电泳分析中的样品制备
制备原则：
应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括 多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。
防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰
（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证
Amount 4.1ml of 8.5 stock or 2.1g urea in 3ml H2O 760mg
50ul of 200mM TBP stock
200mg See table 10ul of 0.1% stock To 5ml
Multiple surfactant solution preparation 经营者提供商品或者服务有欺诈行为的，应当按照消费者的要求增加赔偿其受到的损失，增加赔偿的金额为消费者购买商品的价款或接受服务的费用
IPG pH Range 3-10 4-7
2013.12.12 实验 蛋白质组学实验技术相关理论介绍(一)双向电泳(2DE)实验技术
第二向SDS-PAGE 垂直电泳
第二向SDS-PAGE 垂直电泳步骤
配制凝胶及准备第二向电泳系统 在SDS 平衡缓冲液中平衡固相pH干胶条 将平衡好的固相pH 干胶条放置在SDS 凝胶 上 进行电泳 染色、显影
平衡固相pH干胶条
平衡缓冲液（75 mM Tris-HCl, pH 8.8）： 使固相pH 干胶条的pH 值维持在电泳适合 的范围内；由缓冲液、尿素、甘油、还原 剂、SDS 和染料组成。
稳定的同位素虽然其化学性质相同，但质 量数却存在差异。 ITRAQ就是利用这一原 理，用稳定同位素分别标记不同的样品， 将标记和未标记的样品以等量混合，酶解 后再用质谱技术检测它们的相对丰度。作 为一种新的蛋白质绝对和相对定量技术， 具有很好的精确性和重复性。
二维凝胶差异电泳技术DIGE
DIGE技术中将样品和对照品的蛋白质用激发波长 不同而化学性质类似的两种荧光染料标记，混合
二维凝胶差异电泳技术digedige技术中将样品和对照品的蛋白质用激发波长不同而化学性质类似的两种荧光染料标记混合二维电泳分离然后采用不同波长扫描通过观察一个蛋白质点两种荧光密度的差异变化得特定蛋白质点的差异表达信息
双向电泳（2DE） 实验技术
中国医学科学院 北京协和医学院 医学生物学研究所 病毒免疫室 赵婷 2013.12.12
IEF注意事项：
Ettan IPGphor Ⅲ系统是高压设备，如果安 全装置失效，可能引起致命电休克。因此， 操作开始前必须锁上安全盖，否则就不会加 电。 每个IPG 胶条的电流限度建议值为50μA， 如超过可能会烧毁胶条并损坏仪器。 常规胶条槽和Manifold 胶条槽采用陶瓷制成， 应小心操作。
基质辅助激光解析质谱成像技术 MALDI MSI
蛋白质组双向电泳原理及实验步骤
胶条的平衡
冰箱中取出的胶条，于室温放置10分钟。 配制胶条平衡缓冲液 I 。 吸去胶条上的矿物油及多余的样品。 第一次平衡。振荡15分钟。 配制胶条平衡缓冲液 II 。 第二次平衡 ，振荡15分钟。
吸去玻璃板中液体。将玻璃板倒扣在桌面上。
琼脂糖封胶液进行加热溶解。配制1×电泳缓冲液。
快速
任意时间
l l l
选择所放置的胶条数。 设置每根胶条的极限电流。（30-50A/根） 设置等电聚焦时的温度。（17℃）
配制SDS-PAGE凝胶
配制 12% 的丙烯酰胺凝胶，直接用双向电 泳专用梳子；或在上部留 0.5cm 的空间， 用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封胶。 聚合30分钟。 待凝胶凝固后，拔去梳子，用MilliQ水冲 洗；或倒去分离胶表面的乙醇或水饱和正 丁醇，用MilliQ水冲洗，备用。
PDQuest软件分析（Software analysis）
质谱鉴定（Protein identification）
样品制备基本原则：
• 使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态，制 备方法应具有可重现性。 • 防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。 • 防止样品制备过程中发生样品抽提后的化学修饰。 • 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 • 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而 保证待研究蛋白的可检测性。
等电聚焦的 操作
等 电 聚 焦 程 序 的 设 置
7c 1000V 4000V 4000V 慢速 快速 线性 快速
12小时（17℃） 被动水化
30分钟 60分钟 3小时 24,000伏小时 ~28,000伏小时 除盐 除盐 升压 聚焦
S5
500V 保持
舌苔蛋白质双向电泳技术的建立
质双向电泳图谱 ， 共获得 （０２ ｏ） １８ ±ｌ５ 个蛋 白质斑点 ，ｐ 值主要 集 中在 ４ ｌ —８之 间。结论 ： 通过相 关条件 的
调整优化提 高了双 向电泳的分辨率 ， 为后 续舌 苔蛋 白质组 学研 究奠定 了基础 。
主题 词 舌苔 蛋 白质 组 学 双 向 电 泳
舌诊在 中 医学 中 占有 十分重要 而独 特 的地位 ， 千百年 来， 它一直被历代众多医家推居于中医四诊之首 。用现代科 学 方法阐明舌苔原理、 实现舌苔的客 观化 、 微观化 ， 中医现 是 代化基 础研究中的一个重大关键性课题 。因此 ， 我们拟运用 现代生命科学前沿的蛋 白质组学 技术探讨 舌 苔原 理及其 现
维普资讯
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８ ・ ４
中国中医药科技 ２０ ０８年 ３月第 ｌ ５卷第 ２ Ｍ ｒ２０ ．Ｖ １１ ｏ２ 期 ａ． ８ ｏ．５ Ｎ ． Ｏ
舌 苔 蛋 白质 双 向 电泳 技 术 的 建 立 ＊
张晓 丽 吴 正 治
（ 南方 医科 大 学 附属 深 圳 医院 ・ 圳 ５８３ ） 深 １０５
摘
要 目的 ： 立针对舌苔蛋 白质组学研 究的双 向电泳及其相 关技 术体 系。方法 ： 建 采用超 声裂解法提
取舌 苔蛋 白， 用固相 ｐ 利 Ｈ梯度 等电聚 焦对 舌苔总蛋 白进行 双向电泳 ， 染后获得 的 双向 电泳 图谱 进行 银
Ｉａｅ ａｔ ＤＰａｎｍ 软件 分析 ， 对 实验 条 件 进 行 调 整 优 化 。 结 果 ： 功 构 建 了 高 重 复 性 的 舌 苔 蛋 白 ｍ ｇＭ ｓ ｒ ｅ２ ｌ ｕ ｌ ｉ 并 成
１ 材料与方法
１１ 舌 苔标 本 ． 观察 记录舌 象后 ， 由经 过 培 训 的 课 题 组 人
胎兔皮肤无瘢痕愈合相关蛋白的筛选与初步分析
胎兔皮肤无瘢痕愈合相关蛋白的筛选与初步分析邱俊;周继红;张波;李杨【期刊名称】《中国美容医学》【年(卷),期】2007(16)1【摘要】目的:筛选胎兔皮肤组织无瘢痕愈合相关蛋白,并初步分析其在无瘢痕愈合过程中的作用.方法:建立胎兔背部切割伤模型,运用蛋白质组双向电泳技术筛选胎兔皮肤伤后差异表达的蛋白质,并进行质谱和数据库检索分析.结果:筛选出20个在伤后胎兔皮肤组织中特异高表达的蛋白质点,经过质谱和数据库检索分析后确定:伴侣素或线粒体蛋白P1前体、弹性蛋白(Vi-mentin,Vim)、微管蛋白β多肽、核不均一核糖核蛋白H(异质性胞核核糖核蛋白H)、α-烯醇酶(α-磷酸丙酮酸水合酶)等无瘢痕愈合相关蛋白在胎兔皮肤伤后表达增加.结论:上述无瘢痕愈合相关蛋白可能通过对基因转录和翻译的调控,促进胶原蛋白等的合成和正确的折叠、装配,以及促进细胞的增殖、分化和发育等,促进胎兔皮肤创伤的修复,参与其无瘢痕愈合过程.【总页数】4页(P11-14)【作者】邱俊;周继红;张波;李杨【作者单位】第三军医大学野战外科研究所四室全军交通医学研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆,400042;第三军医大学野战外科研究所四室全军交通医学研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆,400042;第三军医大学野战外科研究所四室全军交通医学研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆,400042;重庆市第九人民医院【正文语种】中文【中图分类】R6【相关文献】1.P物质和降钙素基因相关肽在胎兔皮肤无瘢痕愈合中的作用 [J], 谢江;赖西南;王正国;王丽丽;向德兵;黄晖;陈辉2.神经纤维在胎兔皮肤无瘢痕愈合中的变化 [J], 谢江;赖西南;李华强;王丽丽;向德兵3.兔胚胎皮肤伤口无瘢痕愈合机制研究 [J], 吴国强;李耀辉;刘晓艳;柳大烈;杨果凡4.胎兔皮肤创伤消减文库构建与瘢痕愈合基因的初步筛选 [J], 张波;王正国;朱佩芳5.神经肽SP在胎兔皮肤无瘢痕愈合中的作用 [J], 谢江;赖西南;王正国;王丽丽;向德兵;黄晖;陈辉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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・基础研究・
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孕 "# N 的新西兰大耳白兔、 行宫内手术致胎兔皮肤全层切割伤， "& 0 后 取致伤胎兔及其同胞未致伤胎兔背部皮肤，分别确定为致伤组和未致 伤组， 应用哺乳动物总蛋白提取试剂盒提取其总蛋白。应用双向电泳法 电泳结束后硝酸 将致伤组和未致伤组分别制成 * 块固相 VA 梯度胶条， 银染色、 图像扫描。同一胶条进行 * 次双向电泳， 对所得图像进行蛋白 质点、 匹配率以及伤后蛋白表达差异的分析。 结 果：致伤组和 未致伤组胎 兔皮肤组织 总蛋白分别 分离出蛋白 质点 （ （ 个、 个， 在两组中各选 ’ 块胶作为参考胶进行 * 块 ’#$ b ’& ） ’#8 b ’( ） （ 个、 个， 匹配率分别 胶间的匹配， 平均匹配点数分别是 （ 88 b 8 ） (# b ) ） 同一样本 * 块胶上不同蛋白质点在第一向的位置偏差分 为 8&d 、 8*d ， 别为 （ #4 8$ b #4 "$ ）55、 （ #4 ( b #4 & = 55， 在 第 二 向 的 偏 差 分 别 为 （ （ ’4 "$ b #4 $ ）55、 ’4 $ b #4 $ ）55。通过比对得到胎兔伤后表达增加的 蛋白质点 "# 个。 结论：加大皮肤组织总蛋白上样量进行双向电泳得到重复性和分辨率 均较好的电泳图谱， 并初步找到伤后差异表达的蛋白质点， 为无瘢痕愈 后的深入实验研究打下基础。 电泳 主题词： 创伤； 动物， 皮肤； 蛋白质类 > 分析；
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引言 本课题组从基因表达差异的角度出发筛选出 ’&
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