胎兔皮肤组织蛋白质组双向电泳技术的建立与分析

和 ’’ /5（ 固相 德国 REJ/^ 公司， ’) /5（ VA*%’# ） VA&%)） 两性电解质、 银染增强型试剂盒购 VA 梯度预制胶条、 自 M,3%7DN 公司；十二烷基磺酸钠 ; 聚丙烯酰胺凝胶 电泳蛋白标记物购自北京三博远志生物技术有限公 司。等电聚焦单元及附件、十二烷基磺酸钠 ; 聚丙烯 酰胺凝胶电泳单元及附件为 M,3%7DN 公司产品；水浴 冷却系统、图像扫描仪、图像分析软件为 95EJ20D5 Z0DJ5D/,D 公司产品。 ’4 " 动物即样本准备 雌性新西兰大耳白兔 $ 只， 体 第三军医大学大坪医院动物室提供 质量 *4 # h *4 $ ^W， f 许可证号： 兔交配怀孕 "# N， 行 B@iF% < 军 = "##"%#*" g 。 宫内手术致胎兔背部皮肤全层切割伤， 术后 "& 0 处死 成年兔取致伤胎兔背部皮肤 （ 致伤组） 和 ’ 只同胞未致 伤胎兔背部皮肤 （ 未致伤组 ） ， ; 8# j 保存。按照总蛋 白提取试剂盒说明， 提取皮肤组织总蛋白， 用 MDJDK3JN 法 f " g 测定总蛋白浓度， 确定上样量及上样体积。 ’4 * ’4 *4 ’ 双向电泳 水 化 和 第 一 向 固 相 VA 梯 度 等 电 聚 焦 取 ’$# !H（ &## !W）样品，加入 * !H M,3%HGCE 95V03SGCE （ ， 再加超纯水 &) !H 调体积至 "## !H， 样品 VA & h )） 线性加入等电聚焦槽，去掉固相 VA 梯度预制胶条的 保护层， 将胶条胶面朝下放入槽中样品溶液上， 覆盖矿 物油， 置于等电聚焦仪上， 设置等电聚焦程序， 见表 ’ 。
孕 "# N 的新西兰大耳白兔、 行宫内手术致胎兔皮肤全层切割伤， "& 0 后 取致伤胎兔及其同胞未致伤胎兔背部皮肤，分别确定为致伤组和未致 伤组， 应用哺乳动物总蛋白提取试剂盒提取其总蛋白。应用双向电泳法 电泳结束后硝酸 将致伤组和未致伤组分别制成 * 块固相 VA 梯度胶条， 银染色、 图像扫描。同一胶条进行 * 次双向电泳， 对所得图像进行蛋白 质点、 匹配率以及伤后蛋白表达差异的分析。 结 果：致伤组和 未致伤组胎 兔皮肤组织 总蛋白分别 分离出蛋白 质点 （ （ 个、 个， 在两组中各选 ’ 块胶作为参考胶进行 * 块 ’#$ b ’& ） ’#8 b ’( ） （ 个、 个， 匹配率分别 胶间的匹配， 平均匹配点数分别是 （ 88 b 8 ） (# b ) ） 同一样本 * 块胶上不同蛋白质点在第一向的位置偏差分 为 8&d 、 8*d ， 别为 （ #4 8$ b #4 "$ ）55、 （ #4 ( b #4 & = 55， 在 第 二 向 的 偏 差 分 别 为 （ （ ’4 "$ b #4 $ ）55、 ’4 $ b #4 $ ）55。通过比对得到胎兔伤后表达增加的 蛋白质点 "# 个。 结论：加大皮肤组织总蛋白上样量进行双向电泳得到重复性和分辨率 均较好的电泳图谱， 并初步找到伤后差异表达的蛋白质点， 为无瘢痕愈 后的深入实验研究打下基础。 电泳 主题词： 创伤； 动物， 皮肤； 蛋白质类 > 分析；
解放军第三军医大学野战外科研究所四室，全军交通医学研究所，创 伤、 烧伤与复合伤国家重点实验室， 重庆市 &###&" 通讯作者： 邱 俊& ， 男， 重庆市垫江县人， 汉族， 解放军第三 ’()* 年生， 军医大学在读硕士， 研究实习员， 主要从事创伤基础研究。 +,-./0+1 230-4 /35 国家 “ 九七三 ” 项目资助 （ 6’(((#$&"## ） (
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引言 本课题组从基因表达差异的角度出发筛选出 ’&
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・基础研究・
胎兔皮肤组织蛋白质组双向电泳技术的建立与分析(&
邱 俊 ! 周继红 ! 张 波
中图分类号： 7*’8 文献标识码： 9 文章编号： ’:)’ ; $(": < "##$ = ’& ; ##$: ; #" 收稿日期： "##$ ; #" ; #* 修回日期： "##$ ; #" ; ’) < #* > 6? > @A =
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条与胎兔无瘢痕愈合相关的 eBL 片段
， 但从基因到
功能蛋白还有很长一段距离，本实验从蛋白质研究出 发，取胎兔皮肤切割伤模型的皮肤组织及未致伤的胎 兔对照皮肤组织，用双向凝胶电泳对其蛋白质组进行 分离， 获得分辨率和重复性较好的电泳图谱， 并初步进 行分析寻找差异表达的蛋白质。 G ’4 ’ 材料和方法 试剂与仪器 哺乳动物总蛋白提取试剂盒购自
$%& ’) *+,& ’1) *+/(. 02 345/67%4+89(5 /(: /(/7;4%4 ,< 5=,-:%89(4%,(/7 979>5?,@+,?94%4 <,? @?,59,894 ,< <95/7 ?/66%5 4A%(4 ; >"($??)( @#$.")+$? A+$?-) BCCDE ! F "# G H DI J K F L+%(/ G 邱俊 ! 周继红 ! 张波 4 胎兔皮肤组织蛋白质组双向电泳技术的建立与分析 M ’ N 2 中 M ===2 O.7>A<2 >,8 N 国临床康复， BCCD ， ! F "# G ： DI J K
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