SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳

SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳

第一部知识准备

一、双向凝胶电泳

蛋白质组分析的先决条件是蛋白质的分离。分离过程一般可以分为2步，首先将蛋白质消化成肽段，通常由蛋白水解酶完成，然后将复杂的混合物分离成简单地形式。这2步没有明确的先后关系，也可先将蛋白质混合体分离成单个的蛋白质或肽段，然后消化分析。双向凝胶电泳是采取的先分离后消化的方法，是目前唯一可以在一块凝胶上同时分离数千乃至数万个蛋白质的方法，是当今蛋白质组学方法的主流。刚刚兴起的非胶系统蛋白质组学是先消化然后直接质谱分析，充分应用生物信息学方法，是蛋白质组学分离方法的一个发展方向。

(一)双向电泳简介

双向电泳技术建立于20世纪70年代，它的基本原理是首先根据蛋白质等电点的不同在pH梯度介质中等电聚焦（isoelectrofocusing,IEF）将其分离，然后按照其分子量大小在垂直或水平方向进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-APGE）进行分离。

目前，根据第一向等电聚焦条件和方式的不同，可将双向凝胶电泳分为三种系统：载体两性电解质pH梯度-SDS电泳技术（ISO-DALT）、不平衡的pH梯度凝胶电泳（NEPHGE）、固相pH梯度-SDS电泳技术（IPG-DALT）。在ISO-DALT系统中，等电聚焦在聚丙烯酰胺管胶中进行，载体两性电解质在外加电场作用下形成pH梯度。其主要缺点是在碱性区域不稳定（阴极漂移）、重复性不易掌握和上样量低，并且一般不能分离等电点大于8.0的碱性蛋白质；优点是电泳设备要求不高，电泳溶液容易配制，易于展开工作。各种电泳条件经优化后，可达到非常高的分辨率，也可获得好的重复性，利用这一系统可以分辨10000个蛋白质斑点。NEPHGE为非平衡pH梯度电泳，是IPG胶发明之前用于分离碱性蛋白质的一种方法，蛋白质在等电点等电聚焦场中大道平衡前结束电泳，第一向的pH也是依靠载体两性电解质和电场来建立。在IPG-DALT是现在主要和常用的方法，它的优势表现在：pH梯度稳定、梯度分辨率高；无阴极漂移及碱性蛋白质丢失现象；蛋白质上样量大，可以提高低丰度蛋白质成分的分辨效果；样品中盐的干扰少，无边缘效应；pH梯度和分离效果的重复性好。

固相IPG胶条引入后，双向电泳技术的分辨率和重复性均得到大大的提高，可以更直观的提供蛋白质的分子量、等电点、表达丰度的相对量等信息，尤其是各个公司提供了多种不同pH范围的固相IPG胶条，使得双向电泳的分离效果得到进一步提高。但是双向电泳也存在以下问题：①很多疏水的膜结合蛋白、低丰度蛋白以及极酸和极碱的蛋白无法坚持；②同一实验中不同蛋白的染色强度不一致，不同的实验中同一种蛋白染色也可能不一致，这使得比较不同凝胶上含量变化的可信度低；③蛋白质翻译后修饰，磷酸化等加大了分析的复杂性；④双向电泳操作步骤多，影响因素也多，因此它的操作自动化也是期待解决的难点之一。

（二）样品制备

蛋白质样品制备是至关重要的一步，合理恰当的制备方法是获得分辨率高、重复性好的双向凝胶图谱的先决条件。对不同类型的蛋白质进行样品制备时，需要采用不同的方法和条件。但不管怎样，我们首先要明确的是其实验的研究目的，既是获得尽可能多的蛋白，还是仅仅需要获得感兴趣的某些蛋白。另外，虽然我们会采用一些附加的样品制备方法提高二维电泳图谱的质量，但是同时也会导致某些种类蛋白质的丢失，以及因操作步骤过多造成的实验重复性差。因此，在进行样品制备前我们必须谨慎的权衡上述几者之间的关系。

样品制备必须遵循严格的处理方法以避免蛋白质组成的定性定量变化，如保证蛋白质不被修饰，避免其等电点的改变，尽可能扩大其溶解度和解聚，尽量减少蛋白提取过程中的降解和丢失。总的来说，样品制备的理想状态就是尽量简化处理步骤，最好一步完成蛋白质的完全处理。细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解；样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80℃。勿反复冻融已经制备好的样品；通过超速离心清楚所有的杂质；加入尿素之后加温不要超过37℃，防止氨甲酰化而修饰蛋白。样品制备的裂解液主要是变性剂、表面活性剂和还原剂等。

（三）变性剂

变性剂通过断裂氢键和疏水建使蛋白质去折叠，暴露疏水核心，使蛋白质变性，增加其溶解性，而同时不影响蛋白质所带电荷。尿素是常用的强变性剂。尿素和硫脲结合使蛋白质的溶解性更好，尤其是对疏水性的膜蛋白。

（四）表面活性剂

表面活性剂有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。离子型表面活性剂虽然能有效地溶解蛋白，但是可以使蛋白质带上负电荷，干扰第一向等电聚焦而避免使用。传统的非离子型表面活性剂以前用得较多，但是慢慢被兼性型所代替，如丙磺酸3-（3-胆酰胺丙基）二甲胺内盐（CHAPS）。CHAPS可以加大尿素地溶解性，但是在硫脲浓度高时，其溶解能力大大降低，而SB3-10溶解疏水性氨基酸残基的能力更好，较CHAPS更有效，但是很难溶于高浓度尿素。因此，为协调变性剂和表面活性剂有效性的矛盾，针对不同样本应该采取不同的策略。

（五）还原剂

还原剂多使用β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT），通过打断二硫键，使蛋白彻底去折叠而变性。但是DTT由于带一定电荷，尤其是在碱性条件下，等电聚焦过程中会迁移出pH梯度，造成一些蛋白质重新形成二硫键而使蛋白质溶解度下降。三正丁基磷（tributyl phosphate,TBP）不带电荷，在等电聚焦中大大增加了蛋白质的溶解性，并提高了蛋白质从第一向到第二向的效率。

（六）两性电解质及其他

两性电解质能促使蛋白质的溶解，吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子，离心时有利于核酸的沉淀。此外，样品处理中还可以加入蛋白酶抑制剂如EDTA等，保持蛋白的完整性。为了去核酸，可用超速离心的方法或是加入核酸内切酶Dnase或Rnase。

二、等电聚焦

（一）等电聚焦的原理

等电聚焦是利用蛋白质的等电点不同，在凝胶中将蛋白质混合物分离开。蛋白质是两性分子，同时拥有酸性和碱性基团。在一定的pH条件下，蛋白质带上一定的电荷。在碱性环境中，酸性基团带负电，而在酸性环境中碱性基团就会带正电。蛋白质的净电荷就是氨基酸侧链中所以负电荷和正电荷的总和。这些净电荷可以绘制在以pH为刻度的图谱上。每一个蛋白质都有一个独特的净电荷曲线。该曲线与X轴的交点就是等电点（pI）-即在该pH值时，净电荷为零。

在电场作用下，蛋白质分子分别向正极或负极漂移，当达到与其等电点相同的pH位置时，蛋白质不带电，就不再发生漂移。最开始，由小分子载体两性电解质在电场作用下形成pH梯度，并将载体固定，于是形成了固相IPG胶条。载